一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列及其克隆方法

摘要

本发明公开了一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列，该序列具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。该序列是一种新的BADH基因序列，使人们对BADH基因的研究对象从微生物及常见植物体进一步扩展到濒危灭绝的荒漠植物。并且，根据该BADH基因在植物体内催化合成的甜菜碱所表现出的优良的抗旱、耐盐等性能可以预料：如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物，将可以培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。本发明还公开了一种上述来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列的克隆方法。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列及其克隆方法。 

背景技术

矮沙冬青（Ammopiptanthus nanus Cheng f.）又名新疆沙冬青、小沙冬青、矮黄花木，属于豆科沙冬青属，是第三纪古地中海消失后残遗在塔里木盆地边缘荒漠的超旱生常绿阔叶灌木，间断性分布于西天山与昆仑山的结合部。由于自然历史原因和人类经济活动的影响，特别是过度放牧及樵采，矮沙冬青种群衰退严重，被列为国家一级濒危保护植物，其分布区内气候干旱，降水量远小于蒸发量，年平均气温6.8℃，气温变化极值可达70℃以上。沙冬青具有很强的抗逆性，在相对瘠薄的土壤条件下仍能在高达70℃左右的地表沙温和低至零下20℃~30℃的环境中正常生长发育。有很强的抗寒、抗旱和耐盐碱等抗逆特性。国内外关于沙冬青属植物的报道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱机理及相关的超微结构；染色体数目及核型、减数分裂期染色体行为、开花物候、和引种栽培试验等。这些研究都证实了沙冬青具有抗旱耐冻的特性，因此它是珍贵的抗旱耐冻遗传资源。 

甜菜碱醛脱氢酶是催化合成甜菜碱的关键酶之一，其催化合成产物（甜菜碱）是植物体内重要的渗透调节物质，对细胞渗透势的调节、生物大分子的稳定具有重要作用。甜菜碱醛脱氢酶基因的表达能显著提高植物耐盐能力；此外，还可以增强植物对干旱胁迫的耐受力。属于优良的抗逆基因资源，在植物抗逆基因工程中广泛利用。 

矮沙冬青作为优秀的抗逆植物，克隆上述抗逆基因对基础和应用研究具有重要意义。 

发明内容

本发明的主要目的就是针对荒漠抗逆植物矮沙冬青的抗逆基因开发研究的局限性，提供一种来源于植物矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列，以期应用于其它转基因作物中使之具有相应的优良的抗逆性能。 

本发明的另一个目的是提供一种上述基因序列的克隆方法。 

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下： 

一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列，该序列具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

该基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。 

上述核苷酸序列，可通过包括下述步骤的方法，从植物矮沙冬青叶片中提取总RNA、设计引物、进行PCR扩增、测序等克隆得到。 

（1）总RNA的提取和纯化： 

可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物矮沙冬青叶片中提取得到纯化的矮沙冬青叶片总RNA。

常用的RNA提取方法很多，如试剂盒法、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法、及各种改进方法等，均可用于矮沙冬青叶片总RNA的提取；本发明中可优选试剂盒法（北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNA_OUT2.0提取试剂盒，CAT#90404-50），进行矮沙冬青叶片总RNA提取。 

纯化主要是为了去除总RNA中的DNA污染，获得纯化的矮沙冬青叶片总RNA，以满足后续对目的基因的表达进行定量检测等需要。常用的RNA纯化方法包括：DNA酶消化法(简称 D法)、酸酚变性法(简称S法)、EDTA法(简称 E法)等；本发明中可优选DNA酶（北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNA_OUT2.0提取试剂盒，CAT#90404-50）消化法。 

（2）中间片段的克隆： 

A、中间片段cDNA第一链的合成

以上述步骤（1）纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，使用TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（Code：D314）试剂盒中3′ RACE Adaptor进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板。

B、PCR扩增 

以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述上游引物（jf）和下游引物（jx），进行PCR扩增：

jf: 5′-CTGTGAATGGCGACACGGAAG -3′，

jx: 5′-GATTGTTCCACGCTCGCTCTTAG-3′；

扩增得到矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。

本步骤中，扩增体系可优选为： 

TaqPlusPCR Master Mix           20 μL ，

cDNA模板                                 2 μL ，

2×引物（jx/jf）                   1 μL ，

ddH₂O                                     16 μL 。

扩增程序可优选为： 

95℃，3min；

95℃，30 s，58 ℃，30 s，72℃，40 s（30个循环）；

72℃，8 min；12℃保温。

（3）3′端的克隆： 

C、3′-outer PCR扩增

根据上述步骤（2）得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP-3′-outer，以前述步骤（2）A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP-3′-outer和TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（Code：D314）试剂盒中3′端下游引物3′-RACE outer，进行3′端outer PCR扩增：

GSP-3′-outer: 5′-ACTGGAAGCTCTGCAACTGGGACCAAGA-3′；

3′-RACE outer: 5′- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3′；

扩增得到的产物为cDNA 3′端。

本步骤中，扩增体系可优选为： 

1×cDNA Dilution Buffer II                                  8 μL ，

cDNA模板                                                      2 μL ，

2×引物（GSP-3′-outer/3′-RACE-outer）                            1 μL ，

10×LA PCR Buffer II（Mg²⁺ Free）                           4 μL ，

MgCl₂（25 mM）                                         3 μL ，

TaKaRa LA Taq（5 U/μl）                               0.25 μL ，

ddH₂O                                                     28.75 μL 。

扩增程序可优选为： 

95℃，3 min；

95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min 30 s（30个循环）；

72℃，8 min；12℃保温。

D、3′-inner PCR扩增 

根据前述步骤（2）所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSP-3′-inner，以前述步骤C所得3′端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP-3′-inner和TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（Code：D314）试剂盒中3′端下游引物3′-RACE inner，进行3′端inner PCR扩增：

GSP-3′- inner: 5′-TCAAGCCTGTTTCACTAGAGCTCGGTGG-3′；

3′-RACE inner: 5′- CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3′；

扩增得到的产物为cDNA 3′端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3′端完整序列。

本步骤中，扩增体系可优选为： 

dNTP Mixture（2.5 mM each）                 8 μL ，

3′-outer PCR 产物                                    2 μL ，

2×引物（GSP-3′-inner/3′-RACE-inner）            1 μL ，

10×LA PCR Buffer II（Mg²⁺ Free）                4 μL ，

MgCl₂（25 mM）                               3 μL ，

TaKaRa LA Taq（5 U/μl）                      0.25 μL ，

ddH₂O                                            28.75 μL 。

扩增程序可优选为： 

95℃，3 min；

95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min 30 s（30个循环）

72℃，8 min；12℃保温。

（4）5′端的克隆： 

E、合成5′端的cDNA第一链：

以上述步骤（1）纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，经过Ambion公司FirstChoice? RLM-RACE Kit，SKU #：AM1700试剂盒对RNA处理，加入下述5′ RACE Adapter后，以Random Decamers进行反转录：

5′ RACE  Adapter：5′-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA -3′；

合成得到反转录产物5′端的cDNA第一链。

F、5′-outer PCR扩增 

根据上述步骤（2）得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP-5′-outer，以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP-5′-outer和FirstChoice? RLM-RACE Kit试剂盒中的5′端上游引物5′-RACE outer，进行5′端outer PCR扩增：

GSP-5′-outer: 5′-GCACCAGCTTCAGGACCTAATCCAGTGA-3′；

5′-RACE outer: 5′- GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3′；

扩增得到的产物为cDNA 5′端。

本步骤中，扩增体系可优选为： 

cDNA模板                                          1 μL ，

10X PCR Buffer                                       5 μL ，

dNTP Mix                                           4 μL ，

2×引物（GSP-5′-outer/5′-RACE outer）                  2 μL ，

ThermostabLe DNA poLymerase（0.25 μL of 5U/μL）     1.25 μL ，

ddH₂O                                                34.75 μL 。

扩增程序可优选为： 

95℃，3 min；

95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，1 min 30 s（30个循环）；

72℃，7 min；12℃保温。

G、5′-inner PCR扩增 

根据前述步骤（2）所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP-5′-inner，以前述步骤F所得5′端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP-5′-inner和FirstChoice? RLM-RACE Kit试剂盒中5′端上游引物5′-RACE inner，进行5′端inner PCR扩增：

GSP-5′- inner: 5′-CCAGCTCCAAACAGGTCACAGATGCCAA-3′；

5′-RACE inner: 5′- CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3′；

扩增得到的产物为cDNA 5′端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5′端完整序列。

本步骤中，扩增体系可优选为： 

5′-outer PCR 产物                                    1 μL ，

10X PCR Buffer                                      5 μL ，

dNTP Mix                                           4 μL ，

2×引物（GSP-5′-inner/5′-RACE inner）                 2 μL ，

ThermostabLe DNA poLymerase（0.25 μL of 5U/μL)）    1.25 μL ，

ddH₂O                                               34.75 μL 。

扩增程序可优选为： 

95℃，3 min；

95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，1 min 30 s （30个循环）；

72℃，7 min，12℃保温。

（5）全长序列拼接和ORF克隆： 

将上述步骤（2）所得中间片段、步骤（3）所得3′端inner PCR扩增序列和述步骤（4）所得5′端inner PCR扩增序列进行拼接，cDNA全长作为ORF（Open Reading Frame）扩增的cDNA模板。 

以下述上游引物ORF-S和下游引物ORF-A，并进行PCR扩增： 

ORF-S: 5′-GTGGATCC(BamH )ATGGCAACCCCAATACCGAAT

ORF-A: 5′-CATCAAGCTT(HindⅢ)CCTATCACAGCTTTGAAGGAGACTG

扩增得到的产物为完整的矮沙冬青甜菜碱醛脱氢酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。

本步骤中，扩增体系可优选为： 

dNTP Mixture（2.5 mM each）                           4 μL ，

2×引物（ORF-S/ORF-A）                             1 μL ，

cDNA模板                                             1 μL ，

5×PrimeSTAR Buffer（Mg²⁺ plus）                     10 μL ，

PrimeSTAR HS DNA PLoymerase（2. 5 U/μL）          0.5 μL ，

ddH₂O                                           32.5 μL 。

扩增程序可优选为： 

98℃，30 s；63℃，30 s；72℃，1 min 30 s （30个循环），12℃保温；

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明来源于植物矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶（BADH）的基因序列是新的BADH基因序列，使人们对这些基因的研究对象从细菌及其他植物体进一步扩展到矮沙冬青。

并且，根据在矮沙冬青植物的这些基因所具备的优良的抗旱、耐盐等性能可以预料：如果将其通过转基因技术导入小麦、水稻、玉米等其他植物的基因中，将可培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。 

附图说明

图1为AnBADH基因中间片段电泳检测结果图。 

图2为AnBADH基因3′端inner PCR电泳检测结果图。 

图3为AnBADH基因5′端inner PCR电泳检测结果图。 

图4为AnBADH基因电泳检测结果图。 

图5为表达载体pET32a-AnBADH示意图。 

图6为IPTG诱导后SDS-PAGE电泳检测结果图，图中1、2、3、4泳道分别为蛋白Marker、含pET32a菌未IPTG诱导、含pET32a菌IPTG诱导、含pET32a-AnBADH菌未IPTG诱导；5、6、7泳道分别为含pET32a-AnBADH菌IPTG诱导。 

图7为大肠杆菌盐胁迫实验中点斑实验的菌斑生长情况照片，图中A为对照组（非NaCl胁迫）、B、C、D、E分别表示培养基中添加的NaCl浓度为0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L、1.0 mol/L。 

图8为大肠杆菌盐胁迫实验中测定的生长曲线，图a为非NaCl胁迫结果，图b为0.7mol/L NaCl胁迫结果。 

图9为大肠杆菌高温胁迫实验中点斑实验的菌斑生长情况照片，图中A为对照组（非高温胁迫）、B、C、D、E、F分别表示55℃处理3min、6min、9min、12min、15min。 

图10为大肠杆菌高温胁迫实验中测定的存活率。 

图11为植物表达载体pCAMBIA-AnBADH示意图。 

图12为转基因植株（转AnBADH基因T1代株系）PCR检测结果图。 

图13为转基因植株干旱胁迫结果图。 

具体实施方式

 下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。 

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。 

在下述各实施例中，将矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶简称为AnBADH。通过各实施例，最终得到来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶核苷酸序列（如SEQ ID NO.1所述）及其对应的氨基酸序列（如SEQ ID NO.2所述）。 

实施例1

本实施例为矮沙冬青叶片总RNA的提取和纯化，总RNA提取使用北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAOUT_2.0提取试剂盒，CAT#90404-50，包括下述步骤。

（1）估算组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-200 mg植物叶片或50-100 mg植物种子或200-500 mg植物果实。 

（2）先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在RNALOCKER中的植物组织需用纸吸去RNALOCKER液体后再剪切成小块)，放入10-15 mL塑料离心管中，加入1 mL 65℃预热的溶液A（用前需要摇晃混匀），然后用匀浆器匀浆5-20秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎植物组织，砚磨完后加入1 mL溶液A，但效果比较差，因为研钵本质是二氧化硅，在溶液A存在时会吸附RNA。 

（3）将匀浆物或砚磨物转移至干净的1.5 mL塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织（比如果实）含有大量水份，匀浆液会多于1 mL，转移时也只取1 mL。 

（4）在离心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自备氯仿，在振荡器上振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。 

（5）室温12000 rpm离心3-5分钟，两相间有约5mm厚的细胞破碎物。 

（6）将上清液(约0.6 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下100 μL上清液不取。 

（7）加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀。 

（8）将一半溶液转移到离心吸附柱(60911B)中，12000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。注意不要跟用于RNA提取的吸附柱（60911D）混用。 

（9）将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中， 12000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。 

（10）将0.7 mL 通用洗柱液加入到离心吸附柱中，12000 rpm室温离心10-30秒，弃穿透液。 

（11）12000 rpm室温离心10秒以便去除残留液体。 

（12）将10 μL（10 U）的RNase-free DNase加入到50 μL37℃预热的DNA膜反应液中，吹打混匀配制成DNase工作液。 

（13）将DNase工作液在37℃预热1分钟，然后全部加入到离心吸附柱中，室温放置5分钟。注意：5分钟一般足够降解大多数情况下的DNA污染。如果DNA没有彻底降解（可能由于样品中残留的杂质抑制了DNase的活性），此步的保温时间可以适当延长到10分钟或15分钟。 

（14）直接在离心吸附柱中加入0.7 mL通用洗柱液，盖上盖后颠倒数次混匀。 

（15）12000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。 

（16）再加0.3 mL通用洗柱液到离心吸附柱，12000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。 

（17）12000 rpm室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留乙醇会影响RNA的使用。 

（18）将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中，加入30-50 μL RNA洗脱液，室温放置1-2分钟。 

（19）12000 rpm室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品。本产品提供的离心吸附柱吸附力较强，一次洗脱不能全部将膜上RNA洗下，如有必要，可以再加入30-50 μL RNA洗脱液一次。 

实施例2

本实施例为AnBADH基因中间片段的克隆，方法如下。

以上述实施例1所得纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，按照Takara公司的3′-Full RACE Core Set Ver.2.0，Code：D314试剂盒说明书进行cDNA第一链合成，得到cDNA第一链。 

以蒙古沙冬青BADH基因（DQ288723.1）序列为参考序列，因两者之间亲缘关系很近，直接用该序列设计一对引物jf/jx： 

jf: 5′-CTGTGAATGGCGACACGGAAG -3′，

jx: 5′-GATTGTTCCACGCTCGCTCTTAG-3′。

以前述的cDNA第一链为模板，以设计的引物jf和jx进行矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶cDNA中间片段的扩增。 

扩增体系为：TaqPlusPCR Master Mix              20 μL ， 

cDNA模板                                       2 μL ，

2×引物（jx/jf）                            1 μL ，

ddH₂O                                    16 μL 。

扩增程序为：95℃，3min； 

95℃，30 s，58 ℃，30 s，72℃，40s（30个循环）；

72℃，8 min；12℃保温。

取所得扩增产物20 μL经1%非变性琼脂糖凝胶100 V电泳30 min，GoLdenView染色后紫外线检测扩增片段，结果如图1所示。 

扩增得到的产物为AnBADH基因cDNA中间片段，通过包括下述步骤的方法克隆测序，得到的中间片段序列如SEQ ID NO.3所述。 

①  目的片段的回收与纯化： 

将扩增出来的特异条带用干净刀片在紫外光下快而准确的从琼脂糖中挖出，置于1.5 mL离心管中，用凝胶回收试剂盒（OMEGA公司的E.Z.N.A.TM GeL Extraction Kit）回收胶中的DNA片段。

②  连接反应： 

将回收的DNA片段克隆于TaKaRa公司的pMD19-T载体中。连接反应采用连接试剂盒（Takara公司），连接体系总体积10 μL，16℃连接过夜。

③  感受态细胞的制备： 

Ⅰ、从LB平板上挑取新活化的E. coLiDH5α单菌落，接种于3-5 mL LB液体培养基中，37℃，225 r/min振荡培养12 h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3 h至OD₆₀₀＝0.35-0.5左右。

Ⅱ、将培养液转入离心管，冰上放置10 min，然后于4℃下3000 r/min离心10 min。 

Ⅲ、弃去上清，用预冷的0.05 moL/L的CaCL₂ 溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30 min后，4℃下3000 r/min离心10 min。 

Ⅳ、弃去上清，加入4 mL预冷含15%甘油的0.05 moL/L的CaCL₂ 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。 

Ⅴ、感受态细胞分装成100 μL的小份，贮存于-70℃可保存半年。 

④  质粒DNA的转化： 

Ⅰ、从-70℃冰箱中取出一管大肠杆菌感受态细胞DH5α，置于冰上融化。

Ⅱ、在无菌条件下加入10 μL连接反应液，轻轻震摇混匀后，在冰上放置30 min。 

Ⅲ、42℃水浴热击90 s，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2-3 min。 

Ⅳ、加入890 μL无Amp的LB液体培养基，混匀后，37℃、150 r/min摇床振摇培养，温育1 h。 

Ⅴ、取100 μL已转化的菌液涂于一个LB/Amp的培养平板上，正面朝上放置30 min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住，然后倒转培养皿，37℃避光培养12-16 h；随后筛选阳性菌落。 

⑤  重组菌落的鉴定与保存： 

从外观上看，一般白色且圆的菌落为阳性，通过菌液PCR进一步鉴定。

Ⅰ、在过夜培养的平板上用灭菌的小枪头挑取几个白色菌落，分别点种于含0.1 g/L Amp的LB液体培养基的1.5 mL离心管中，37℃，150 r/min振摇培养4-6h。 

Ⅱ、取1 μL菌悬液作为模板，用引物jf/jx进行PCR扩增，PCR反应条件中裂解时间延长至5min，用1% 的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。如果产物为目的条带时，此菌落为阳性克隆，否则为阴性。同时设不加菌悬液的阴性对照。 

Ⅲ、取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750 μL，加入250 μL的灭菌甘油，混匀后，用液氮速冻，置于-70℃冰箱中保存备用。 

Ⅳ、最后送英俊生物技术公司测序，所得序列在NCBI的BLastn 进行比对分析，验证克隆片段是否正确。 

实施例3

本实施例为AnBADH基因3′端的克隆，方法如下。

（1）3′-outer PCR扩增： 

根据实施例2得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP-3′-outer，以实施例2所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP-3′-outer和TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（Code：D314）试剂盒中3′端下游引物3′-RACE outer，进行3′端outer PCR扩增：

GSP-3′-outer: 5′-ACTGGAAGCTCTGCAACTGGGACCAAGA-3′；

3′-RACE outer: 5′- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3′。

扩增体系为： 

1×cDNA Dilution Buffer II                                 8 μL ，

cDNA模板                                                     2 μL ，

2×引物（GSP-3′-outer/3′-RACE-outer）                          1 μL ，

10×LA PCR Buffer II（Mg²⁺ Free）                        4 μL ，

MgCl₂（25 mM）                                     3 μL ，

TaKaRa LA Taq（5 U/μl）                             0.25 μL，

ddH₂O                                                   28.75 μL 。

扩增程序为： 

95℃，3 min；

95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min 30 s（30个循环）

72℃，8 min；12℃保温。

（2）3′-inner PCR扩增： 

根据实施例2得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP-3′-inner，以上述（1）所得outer PCR产物为模板，利用特异性上游引物GSP-3′-inner和TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（Code：D314）试剂盒中3′端下游引物3′-RACE inner，进行3′端inner PCR扩增：

GSP-3′-inner: 5′-TCAAGCCTGTTTCACTAGAGCTCGGTGG-3′；

3′-RACE inner: 5′- CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3。

扩增体系为： 

dNTP Mixture（2.5 mM each）                     8 μL ，

cDNA模板                                                2 μL ，

2×引物（GSP-3′-inner/3′-RACE-inner）              1 μL ，

10×LA PCR Buffer II（Mg²⁺ Free）                    4 μL，

MgCl₂（25 mM）                                 3 μL，

TaKaRa LA Taq（5 U/μl）                        0.25 μL，

ddH₂O                                            28.75 μL 。

扩增程序为： 

95℃，3 min；

95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，1 min 30 s（30个循环）；

72℃，8 min；12℃保温。

取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。 

扩增得到的产物为AnBADH基因3′端cDNA完整序列inner PCR产物，通过克隆测序，得到的3′端cDNA完整序列如SEQ ID NO.4所述。 

克隆测序参照实施例2的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回收，再将回收的产物克隆到19-T载体上，转化E. coLiDH5α感受态细胞，以GSP-3′-inner/3′-RACE-inner为引物，经菌液PCR验证后，将菌液送英俊生物技术公司测序。所得序列在NCBI的BLastn 进行比对分析，验证克隆片段是否正确。 

实施例4

本实施例为AnBADH基因5′端的克隆，包括下述步骤。

（1）5′端扩增的cDNA第一链合成： 

以实施例1纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，经过Ambion公司FirstChoice? RLM-RACE Kit，SKU #：AM1700试剂盒对RNA处理，加入下述5′ RACE Adapter后，以Random Decamers进行反转录：

5′ RACE Adapter: 5′-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA -3′；

合成得到反转录产物5′端的cDNA第一链。

（2）5′-outer PCR扩增： 

根据实施例2得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP-5′-outer，以前述步骤（1）所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP-5′-outer和试剂盒FirstChoice? RLM-RACE Kit，SKU #：AM1700中上游引物5′-RACE outer，进行5′端outer PCR扩增：

GSP-5′-outer: 5′-GCACCAGCTTCAGGACCTAATCCAGTGA-3′；

5′-RACE outer: 5′- GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3′。

扩增体系为： 

cDNA模板                                          1 μL ，

10X PCR Buffer                                       5 μL ，

dNTP Mix                                           4 μL ，

2×引物（GSP-5′-outer/5′-RACE outer）                  2 μL ，

ThermostabLe DNA polymerase（0.25 μL of 5U/μL）     1.25 μL ，

ddH₂O                                                34.75 μL 。

扩增程序为： 

95℃，3 min；

95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，1 min 30 s（30个循环）；

72℃，7 min；12℃保温。

（3）5′-inner PCR扩增： 

根据实施例2得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP-5′-inner，以前述步骤（2）所得outer PCR产物为模板，利用特异性下游引物GSP-5′-inner和试剂盒FirstChoice? RLM-RACE Kit，SKU #：AM1700中上游引物5′-RACE inner，进行5′端inner PCR扩增：

GSP3-5′-inner: 5′-CCAGCTCCAAACAGGTCACAGATGCCAA-3′；

5′-RACE inner: 5′- CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3。

扩增体系为： 

5′-outer PCR 产物                                    1 μL ，

10X PCR Buffer                                       5 μL ，

dNTP Mix                                            4 μL ，

2×引物（GSP-5′-inner/5′-RACE inner）                   2 μL ，

ThermostabLe DNA poLymerase（0.25 μL of 5U/μL）      1.25 μL ，

ddH₂O                                                 34.75 μL 。

扩增程序为： 

95℃，3 min；

95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，1 min 30 s（35个循环）；

72℃，7 min；12℃保温。

取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。 

扩增得到的产物为AnBADH基因5′端cDNA完整序列inner PCR产物，通过克隆测序，得到的5′端cDNA完整序列如SEQ ID NO.5所述。 

克隆测序参照实施例2的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回收，再将回收的产物克隆到19-T载体上，转化E. coLiDH5α感受态细胞，以GSP-5′-inner/5′-RACE inner为引物，经菌液PCR验证后，将菌液送英俊生物技术公司测序。所得序列在NCBI的BLastn 进行比对分析，验证克隆片段是否正确。 

实施例5

本实施例为AnBADH基因克隆，方法如下。

将上述实施例2所得中间片段、实施例3所得3′端inner PCR扩增序列和实施例4所得5′端inner PCR扩增序列进行拼接，得到cDNA全长（作为ORF扩增的模板），通过NCBI里ORF finder工具分析开放阅读框，并根据表达载体的酶切位点的需要设计上游引物ORF-S和下游引物ORF-A如下： 

ORF-S: 5′-GTGGATCC(BamH)ATGGCAACCCCAATACCGAAT；

ORF-A: 5′-CATCAAGCTT(HindⅢ)CCTATCACAGCTTTGAAGGAGACTG。

以拼接得到的cDNA全长作为模板，以上游引物ORF-S和下游引物ORF-A进行PCR扩增。 

扩增体系为： 

dNTP Mixture（2.5 mM each）                     4 μL ，

2×引物（ORF-S/ORF-A）                        1 μL ，

cDNA模板                                          1 μL ，

5×PrimeSTAR Buffer（Mg²⁺ plus）                10 μL ，

PrimeSTAR HS DNA PLoymerase（2. 5 U/μL）       0.5 μL ，

ddH₂O                                       32.5 μL 。

扩增程序为： 

98℃，30 s；63℃，30 s；68℃，1 min 30 s （30个循环）, 12℃保温。

取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。 

扩增得到的产物为完整开放阅读框，即矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因，通过克隆测序，既得其基因序列，如SEQ ID NO.1所述；其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。 

克隆测序参照实施例2的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回收，再将回收的产物克隆到19-T载体上，转化E. coLiDH5α感受态细胞，以ORF-S/ORF-A为引物，经菌液PCR验证后，将菌液送英俊生物技术公司测序。所得序列在NCBI的BLastn 进行比对分析，验证克隆片段是否正确。 

实施例6

由于基因在克隆、表达过程中具有诸多不确定性，最终得到的基因是否具有如预料相应的功能也是不确定的；因此，本实施例中，为了研究所克隆的上述矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因（AnBADH）是否具有某些特定的功能，构建原核表达载体pET32a-AnBADH，并转化原核表达菌株Rosetta的感受态，进一步验证该基因的功能。

由T7启动子启动矮沙冬青甜菜碱醛脱氢酶基因AnBADH，抗性基因Amp为选择标记，His-Tag为标签，T7 Terminator终止目的基因的表达，如图5所示。 

构建好的表达载体以热激法转化大肠杆菌表达菌株Rosetta的感受态，转化方法同实施例2步骤④；经菌液PCR检测阳性克隆的菌液用于后续试验。 

实施例7

本实施例为目的蛋白的诱导表达，方法如下。

（1）分别挑取含pET32a及pET32a-AnBADH 的Rosetta菌株单克隆，接种至含Amp的LB培养基中，于37℃，200rpm进行过夜培养。 

（2）次日以1：100进行扩大培养，在OD₆₀₀值约为0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，诱导大肠杆菌表达外源蛋白。 

（3）4h后取1ml菌液，4,000rpm离心10min，收集菌体。 

（4）用PBS缓冲液重悬菌体，加入等体积的2×蛋白上样缓冲液。 

（5）沸水浴煮5 min，14000rpm离心15min，取10μL上清液进行SDS-PAGE电泳分析。 

（6）电泳胶经考马斯亮蓝染色液染色30min。 

（7）加入脱色液覆盖电泳胶，脱色1h后更换新的脱色液，继续脱色。 

（8）脱色后将电泳胶置凝胶成像系统照相，结果如图6所示。IPTG诱导后，含pET32a的菌株只表达Tag标签，含pET32a-AnBADH的菌株则特异性表达目的蛋白；说明本发明所述的AnBADH基因转化到大肠杆菌菌体内后能正常表达。 

实施例8

本实施例为大肠杆菌盐胁迫实验，包括点斑实验和测定生长曲线实验两部分，步骤如下。

1.点斑实验: 

（1）分别挑取含pET32a及pET32a-AnBADH 的Rosetta菌株单克隆，接种至含Amp的LB 液体培养基中，于37℃，200rpm进行过夜培养。

（2）次日按1:100比例扩大培养，至OD₆₀₀约为0.6-0.8 时，加入终浓度为1 mM的IPTG，37℃，180rpm继续培养4h。 

（3）用含Amp的LB 液体培养基将菌液OD₆₀₀调节至约0.5，并做10倍梯度稀释，稀释至10^-5倍。 

（4）从各稀释度的菌液中取5μL，点至含Amp的LB固体培养基以及添加0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L、1 mol/L NaCl的盐胁迫培养基上。 

（5）37℃倒置培养过夜，观察菌斑生长情况并照相，结果如图7所示。随着培养基中盐浓度的增加，两种菌株的生存能力均逐渐下降；但在同一稀释梯度下含pET32a-AnBADH的菌株在不同盐浓度培养基上的生长情况均优于含pET32a的菌株，说明本发明所述的AnBADH基因转化到大肠杆菌菌体内后能正常表达并增强了菌株的耐盐能力。 

2. 测定生长曲线实验: 

（1）IPTG诱导目的蛋白表达同前述步骤（1）至（2）。

（2）用含Amp的LB 液体培养基将菌液OD₆₀₀调节至约1.0，分别取1ml培养物加至20ml的含0.7 mol/L NaCl液体培养基，于37℃，200rpm进行培养，此后每隔1h测定OD₆₀₀并绘制生长曲线，同时设置非NaCl胁迫对照。 

结果如图8所示，对照组（非NaCl胁迫）两者均迅速进入对数生长期，并无差异；在0.7 mol/L NaCl的胁迫下，两者均先进入延滞期，在胁迫4h后含pET32a-AnBADH 的菌株明显进入对数生长期，而对照菌株先是经历短暂的对数生长期并迅速进入稳定期，但是，含目的基因的菌株仍处于对数生长期，表现出较强的耐盐能力；说明本发明所述的AnBADH基因转化到大肠杆菌菌体内后能正常表达并显著增强菌株的耐盐能力。 

实施例9

本实施例为大肠杆菌高温胁迫实验，包括点斑实验和测定存活率实验两部分，步骤如下。

1.点斑实验： 

（1）IPTG诱导目的蛋白表达同实施例8中点斑实验的步骤（1）至（2）。

（2）用含Amp的LB 液体培养基将菌液OD₆₀₀调节至约0.5，按100μL/L管分装至1.5ml的EP管，于55℃水浴锅处理3min、6min、9min、12min、15min；同时37℃培养做对照 。 

（3）处理结束于4℃冰箱冷却3min后，做10倍梯度稀释，稀释至10^-5倍。 

（4）从各稀释度的菌液中取5μL，点至含Amp的LB固体培养基。 

（5）37℃倒置培养过夜，观察菌斑生长情况并照相，结果如图9所示。随着高温处理时间的延长，两种菌株的生存能力均逐渐下降；但在同一稀释梯度下含pET32a-AnBADH的菌株在不同处理时间后的生长情况均优于含pET32a的菌株，说明本发明所述的AnBADH基因转化到大肠杆菌菌体内后能正常表达并增强了菌株的耐高温能力。 

2.测定存活率实验： 

（1）IPTG诱导目的蛋白表达同实施例8中点斑实验的步骤（1）至（2）。

（3）用含Amp的LB 液体培养基将菌液OD₆₀₀调节至约0.5，按200μL/L管分装至1.5ml的EP管，于55℃水浴锅处理0min、5min、10min、20min、30min、45min、60min。 

（4）处理结束后做10倍梯度稀释，取100 μL稀释至10^-8倍的稀释物涂布LB固体培养基，37℃过夜培养，统计菌落数并计算存活率（公式如下）。每个处理重复3次，设置3次重复实验。 

存活率=处理后菌落数（平均值）／未处理菌落数（平均值）×100%。 

结果如图10所示，在不同的处理时间后，含含pET32a-AnBADH的菌株均表现出较高的存活率；随着高温处理时间的延长，两者的存活率均逐渐下降，但含目的基因的菌株存活率均比对照菌株的高，说明本发明所述的AnBADH基因转化到大肠杆菌菌体内后能正常表达并增强了菌株的耐高温能力。 

实施例10

本实施例中，为了研究所克隆的上述矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因（AnBADH）在植物体内是否具有预料的功能，发明人进行了深入研究，以便进一步验证该基因的功能。

（1）    构建植物表达载体，农杆菌介导花絮浸染拟南芥获得转基因植株 

由35S启动子启动矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因AnBADH，以抗潮霉素基因为选择标记，构建植物表达载体pCAMBIA-AnBADH，如图11所示。图11中，T-Border(L)，植物表达载体左边界；T-Border(R)，植物表达载体右边界；hygromycin，潮霉素标记基因；Kanamycin，卡那霉素标记，用于表达载体转化大肠杆菌、农杆菌时作为筛选标记。

 以拟南芥Col-0为受体，农杆菌介导花絮浸染pCAMBIA-AnBADH，经过潮霉素筛选得到转基因植株。 

 （2）转基因植株的分子鉴定 

经过潮霉素筛选，对初步确定为阳性株系的苗子部分进行PCR检测，如图12所示，M为DNA分子量标记DL2000，CK为阳性质粒对照（pCAMBIA-AnBADH），B1、B2、B3、B4、B5、B6分别为转AnBADH基因T1代不同株系，各转基因T1代不同株系结果全为阳性。

（3）转基因植株的耐旱性鉴定 

取少量未转基因的（CK）及转基因的纯合阳性株系（AnBADH）种子，经表面消毒播种于1/2MS培养基，待种子发芽14天后，取长势基本一致的幼苗分别移栽，培养室继续培养。待移栽后的第20天，做最后一次浇水（用水浸泡培养钵2h，待土充分吸水）； 此后，不浇水以致形成自然干旱；随后，每隔7天浇少量的水，持续处理20天。经过处理，转基因的苗子长势均优于未转基因的对照组，生长较健壮；转基因植株初步表现出较强的耐旱性。结果如图13所示。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  四川农业大学

<120>  一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列及其克隆方法

<160>  5

<210>  1

<211>  1868

<212>  DNA

<213>  来源于矮沙冬青（Ammopiptanthus nanus Cheng f.）的甜菜碱醛脱氢酶（AnBADH）基因的核苷酸序列

<400>  1

aaaaatcgat ttcatttcaa taattcagag agatagagag tgtgctgtgt gtgtgtctca     60

aaatggcaac cccaataccg aatagacagc tattcataga tggagagtgg aaagtaccat    120

tcctaagcaa acgaattcca atcatcaacc cctccaccca acagatcata ggggatatcc    180

cagcagccac taaggaagat gttgacctcg ctgtcgctgc tgcaaaagca gccttgtccc    240

gtaacaaagg cactgattgg gcttccgctt ctggctccgt tcgtgctcgc tatctccgtg    300

ccatcgctgc caagatcact gagaaaaaat cggaactttc gaaacttgaa gccattgatt    360

gtggaaaacc actcgatgaa gccgcgtggg acatggatga tgttgctggt tgctttgatt    420

actatgctga ccttgctgaa aaattggatg caaaccaaaa ggctcctgtt tctcttccct    480

tggagaactt caggagttat gttcttaagg agcccattgg ggttgttgca ttgatcacac    540

catggaacta tcctctgtta atagcgacat ggaaggttgc tccagctcta gctgctggtt    600

gtgctgcaat attgaagcca tctgaattgg catccgtgac ctgtttggag ctggctgaaa    660

tatgcagaga agtgggcctt cctcgaggtg tattaaacgt tctcactgga ttaggtcctg    720

aagctggtgc tcctttagca tcccatcctg atgtagacaa gattgctttt actggaagct    780

ctgcaactgg gaccaagatt atgacagctg cagctcagct agtcaagcct gtttctctag    840

agctcggtgg aaaaagccca attgttgttt ttgaggatgt tgaccttgat aaggctgctg    900

aatggaccct ctttggctgc ttctgggtaa atggtcagat atgcactgca acttcccgcc    960

ttattgtaca tgaaagtatt gcaacagaat ttttgaatag gcttgtgaaa tggaccaaaa   1020

acatcaaaat ttcagatccc ttggaggaag gttgcaggct aggccctgtt gttagtgaag   1080

gacagtatga aaaaatattg aagtttatct caaacgctaa gagcgagggt gcaacaattt   1140

tgactggtgg gtctcgccca gagcatataa agaaaggatt ctttgttgaa ccaaccatca   1200

taactgatgt gactaccaac atgcaaatct ggagagaaga agtatttgga cctgttctct   1260

gtgtaaaaac atttagtact gaggaagaag ctattgatct agcaaatgac accatctatg   1320

gcttaggttc tgctgtaata tcaaatgatc tagaaagatg tgagcgcata actaaggcat   1380

ttagggctgg aattgtatgg gtaaattgct ctcaaccatg cttcactcag gccccatggg   1440

gaggcaccaa acgcagtggt tttggtcgtg aattaggaga atggggactt gataactact   1500

tgagtgtgaa gcaagtcact cggcacatct ctgatgaacc ttggggctgg taccagtctc   1560

cttcaaagct gtgataggta aactgatgat aaattggtgt tttataaact gacatcgaat   1620

aaggtgtgaa tgataccaaa ttatgattat gatatagtcg tggggaagac ttaatgtaat   1680

aaaatttgtt gttgtaataa ttttttgctg aaatttcaat ttcacgatta atttccaaac   1740

aaaggaaatt taactgatgt attttgattc cgtatgtaac gttttaaaat tttggtatgg   1800

ctcatctgaa cagacttttg atttctgaga ttcaattgaa atcaaacctc tttacacaaa   1860

aaaaaaaa                                                            1868

<210>  2

<211>  503

<212>  PRT

<213>  来源于矮沙冬青（Ammopiptanthus nanus Cheng f.）的甜菜碱醛脱氢酶（AnBADH）基因核苷酸序列对应的氨基酸序列

<400>  2

Met Ala Thr Pro Ile Pro Asn Arg Gln Leu Phe Ile Asp Gly Glu Trp

1               5                   10                  15     

Lys Val Pro Phe Leu Ser Lys Arg Ile Pro Ile Ile Asn Pro Ser Thr

            20                  25                  30         

Gln Gln Ile Ile Gly Asp Ile Pro Ala Ala Thr Lys Glu Asp Val Asp

        35                  40                  45             

Leu Ala Val Ala Ala Ala Lys Ala Ala Leu Ser Arg Asn Lys Gly Thr

    50                  55                  60                 

Asp Trp Ala Ser Ala Ser Gly Ser Val Arg Ala Arg Tyr Leu Arg Ala

65                  70                  75                  80 

Ile Ala Ala Lys Ile Thr Glu Lys Lys Ser Glu Leu Ser Lys Leu Glu

                85                  90                  95     

Ala Ile Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Ala Trp Asp Met Asp

            100                 105                 110        

Asp Val Ala Gly Cys Phe Asp Tyr Tyr Ala Asp Leu Ala Glu Lys Leu

        115                 120                 125            

Asp Ala Asn Gln Lys Ala Pro Val Ser Leu Pro Leu Glu Asn Phe Arg

    130                 135                 140                

Ser Tyr Val Leu Lys Glu Pro Ile Gly Val Val Ala Leu Ile Thr Pro

145                 150                 155                 160

Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Ile Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu

                165                 170                 175    

Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ile Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala Ser Val

            180                 185                 190        

Thr Cys Leu Glu Leu Ala Glu Ile Cys Arg Glu Val Gly Leu Pro Arg

        195                 200                 205            

Gly Val Leu Asn Val Leu Thr Gly Leu Gly Pro Glu Ala Gly Ala Pro

    210                 215                 220                

Leu Ala Ser His Pro Asp Val Asp Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ser Ser

225                 230                 235                 240

Ala Thr Gly Thr Lys Ile Met Thr Ala Ala Ala Gln Leu Val Lys Pro

                245                 250                 255    

Val Ser Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Val Val Phe Glu Asp

            260                 265                 270        

Val Asp Leu Asp Lys Ala Ala Glu Trp Thr Leu Phe Gly Cys Phe Trp

        275                 280                 285            

Val Asn Gly Gln Ile Cys Thr Ala Thr Ser Arg Leu Ile Val His Glu

    290                 295                 300                

Ser Ile Ala Thr Glu Phe Leu Asn Arg Leu Val Lys Trp Thr Lys Asn

305                 310                 315                 320

Ile Lys Ile Ser Asp Pro Leu Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro Val

                325                 330                 335    

Val Ser Glu Gly Gln Tyr Glu Lys Ile Leu Lys Phe Ile Ser Asn Ala

            340                 345                 350        

Lys Ser Glu Gly Ala Thr Ile Leu Thr Gly Gly Ser Arg Pro Glu His

        355                 360                 365            

Ile Lys Lys Gly Phe Phe Val Glu Pro Thr Ile Ile Thr Asp Val Thr

    370                 375                 380                

Thr Asn Met Gln Ile Trp Arg Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Leu Cys

385                 390                 395                 400

Val Lys Thr Phe Ser Thr Glu Glu Glu Ala Ile Asp Leu Ala Asn Asp

                405                 410                 415    

Thr Ile Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Val Ile Ser Asn Asp Leu Glu Arg

            420                 425                 430        

Cys Glu Arg Ile Thr Lys Ala Phe Arg Ala Gly Ile Val Trp Val Asn

        435                 440                 445            

Cys Ser Gln Pro Cys Phe Thr Gln Ala Pro Trp Gly Gly Thr Lys Arg

    450                 455                 460                

Ser Gly Phe Gly Arg Glu Leu Gly Glu Trp Gly Leu Asp Asn Tyr Leu

465                 470                 475                 480

Ser Val Lys Gln Val Thr Arg His Ile Ser Asp Glu Pro Trp Gly Trp

                485                 490                 495    

Tyr Gln Ser Pro Ser Lys Leu

            500            

<210>  3

<211>  585

<212>  DNA

<213>  来源于矮沙冬青（Ammopiptanthus nanus Cheng f.）的甜菜碱醛脱氢酶（AnBADH）基因中间片段的核苷酸序列

<400>  3

ctgttaatag cgacatggaa ggttgctcca gctctagctg ctggttgtgc tgcaatattg     60

aagccatctg aattggcatc cgtgacctgt ttggagctgg ctgaaatatg cagagaagtg    120

ggccttcctc gaggtgtatt aaacgttctc actggattag gtcctgaagc tggtgctcct    180

ttagcatccc atcctgatgt agacaagatt gcttttactg gaagctctgc aactgggacc    240

aagattatga cagctgcagc tcagctagtc aagcctgttt ctctagagct cggtggaaaa    300

agcccaattg ttgtttttga ggatgttgac cttgataagg ctgctgaatg gaccctcttt    360

ggctgcttct gggtaaatgg tcagatatgc actgcaactt cccgccttat tgtacatgaa    420

agtattgcaa cagaattttt gaataggctt gtgaaatgga ccaaaaacat caaaatttca    480

gatcccttgg aggaaggttg caggctaggc cctgttgtta gtgaaggaca gtatgaaaaa    540

atattgaagt ttatctcaaa cgctaagagc gagggtgcaa caatt                    585

<210>  4

<211>  1046

<212>  DNA

<213>  来源于矮沙冬青（Ammopiptanthus nanus Cheng f.）的甜菜碱醛脱氢酶（AnBADH）基因3’端inner PCR的核苷酸序列

<400>  4

tcaagcctgt ttctctagag ctcggtggaa aaagcccaat tgttgttttt gaggatgttg     60

accttgataa ggctgctgaa tggaccctct ttggctgctt ctgggtaaat ggtcagatat    120

gcactgcaac ttcccgcctt attgtacatg aaagtattgc aacagaattt ttgaataggc    180

ttgtgaaatg gaccaaaaac atcaaaattt cagatccctt ggaggaaggt tgcaggctag    240

gccctgttgt tagtgaagga cagtatgaaa aaatattgaa gtttatctca aacgctaaga    300

gcgagggtgc aacaattttg actggtgggt ctcgcccaga gcatataaag aaaggattct    360

ttgttgaacc aaccatcata actgatgtga ctaccaacat gcaaatctgg agagaagaag    420

tatttggacc tgttctctgt gtaaaaacat ttagtactga ggaagaagct attgatctag    480

caaatgacac catctatggc ttaggttctg ctgtaatatc aaatgatcta gaaagatgtg    540

agcgcataac taaggcattt agggctggaa ttgtatgggt aaattgctct caaccatgct    600

tcactcaggc cccatgggga ggcaccaaac gcagtggttt tggtcgtgaa ttaggagaat    660

ggggacttga taactacttg agtgtgaagc aagtcactcg gcacatctct gatgaacctt    720

ggggctggta ccagtctcct tcaaagctgt gataggtaaa ctgatgataa attggtgttt    780

tataaactga catcgaataa ggtgtgaatg ataccaaatt atgattatga tatagtcgtg    840

gggaagactt aatgtaataa aatttgttgt tgtaataatt ttttgctgaa atttcaattt    900

cacgattaat ttccaaacaa aggaaattta actgatgtat tttgattccg tatgtaacgt    960

tttaaaattt tggtatggct catctgaaca gacttttgat ttctgagatt caattgaaat   1020

caaacctctt tacacaaaaa aaaaaa                                        1046

<210>  5

<211>  654

<212>  DNA

<213>  来源于矮沙冬青（Ammopiptanthus nanus Cheng f.）的甜菜碱醛脱氢酶（AnBADH）基因5’端inner PCR的核苷酸序列

<400>  5

aaaaatcgat ttcatttcaa taattcagag agatagagag tgtgctgtgt gtgtgtctca     60

aaatggcaac cccaataccg aatagacagc tattcataga tggagagtgg aaagtaccat    120

tcctaagcaa acgaattcca atcatcaacc cctccaccca acagatcata ggggatatcc    180

cagcagccac taaggaagat gttgacctcg ctgtcgctgc tgcaaaagca gccttgtccc    240

gtaacaaagg cactgattgg gcttccgctt ctggctccgt tcgtgctcgc tatctccgtg    300

ccatcgctgc caagatcact gagaaaaaat cggaactttc gaaacttgaa gccattgatt    360

gtggaaaacc actcgatgaa gccgcgtggg acatggatga tgttgctggt tgctttgatt    420

actatgctga ccttgctgaa aaattggatg caaaccaaaa ggctcctgtt tctcttccct    480

tggagaactt caggagttat gttcttaagg agcccattgg ggttgttgca ttgatcacac    540

catggaacta tcctctgtta atagcgacat ggaaggttgc tccagctcta gctgctggtt    600

gtgctgcaat attgaagcca tctgaattgg catccgtgac ctgtttggag ctgg          654