一种紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途

摘要

一种紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途，它涉及一种紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途。本发明方法为：一、制备供试品溶液；二、制作指纹图谱，将供试品溶液注入高效液相色谱仪；本发明紫苏子抗氧化活性提取物的指纹图谱有9个共有特征峰，这些共有特征峰构成了紫苏子抗氧化活性提取物的指纹特征，可作为紫苏子抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。本发明紫苏子抗氧化活性提取物标准指纹图谱的用途是指紫苏子抗氧化活性提取物指纹图谱作为标准指纹图谱用于紫苏子质量控制中。本发明应用于医药领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途。

背景技术

人体在利用氧气进行代谢反应时，会在体内产生大量含氧自由基，体内的抗氧化系统便会受到不够用的危机，从而引起癌症、动脉硬化、糖尿病、老年痴呆等重大疾病。研究表明，通过补充抗氧化物质能够消除体内过多的含氧自由基，对自由基引起的相关疾病可得到有效预防，通过食用功能性的抗氧化食品也是一种极为有效的补充抗氧化剂的方法。

紫苏子为唇形科植物紫苏的干燥成熟果实Perilla frutescens(L.)Britt.，收载于《中华人民共和国药典》2010版一部，具有降气化痰、止咳平喘、润肠通便的功效。现代药理学研究表明，紫苏子主要含有脂肪油、生物碱类、糖类、黄酮类等成分，具有降血脂、止咳平喘、抗过敏、抗衰老、抗氧化等作用。在质量控制方面，《中华人民共和国药典》2010版一部仅收载了紫苏子对照药材的鉴别和迷迭香酸的含量测定。由于中药的成分复杂，有效成分又多随产地、来源、采收季节等情况变化而变化，因此，采用指纹图谱技术全面反映药材的整体特征，并进一步与其活性相关联，对于完善目前的质量控制方法，保证临床用药的安全有效是十分必要的。目前，关于紫苏子的指纹图谱研究尚未有文献报道，更没有建立紫苏子抗氧化提取物的指纹图谱，从质量控制方面，有关紫苏子抗氧化提取物的标准指纹图谱亦没有报道。

发明内容

本发明是要提供一种紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱和用途。

本发明一种紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法，是按以下步骤进行：一、供试品溶液的制备：a、取紫苏子药材，粉碎后加入沸程为60～90℃的10倍质量的石油醚，回流3次，每次2h，得到残渣；

b、将残渣室温干燥后，加入10倍质量的质量浓度为75%的乙醇，回流2次，每次2h,收集两次回流所得溶液，然后过滤，收集滤液，再将滤液减压浓缩至干，得浸膏，即紫苏子抗氧化活性提取物；

c、将步骤b得到的紫苏子抗氧化活性提取物，用甲醇溶解成浓度为1mg/mL的溶液，用微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液；

二、指纹图谱的制作：将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以乙腈为A相，质量百分含量为0.5%的乙酸水溶液为B相进行梯度洗脱；

其中，高效液相色谱条件为：

色谱柱填料Thermo C18，规格为250×4.6mm，5μm；柱温为35℃；流动相为A相乙腈和B相质量百分含量为0.5％乙酸水溶液，流速0.8mL/min，检测波长280nm，进样10μL；

在此条件下分析供试品溶液，得到紫苏子抗氧化活性提取物的指纹图谱。

本发明采用一种紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法得到的紫苏子抗氧化活性提取物标准指纹图谱。

本发明紫苏子抗氧化活性提取物标准指纹图谱的用途是指紫苏子抗氧化活性提取物指纹图谱作为标准指纹图谱用于紫苏子质量控制中。

本发明提取了紫苏子中具有抗氧化作用的提取物，通过对DPPH自由基清除试验，证明了该提取物具有优良的抗氧化活性，本发明紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法具有快速准确、重现性好、操作性强、稳定可靠等优点。本发明的紫苏子抗氧化活性提取物标准指纹图谱有9个共有特征峰，这些共有特征峰构成了紫苏子抗氧化活性提取物的指纹特征，可作为紫苏子抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。本发明的紫苏子抗氧化活性提取物标准指纹图谱作为标准指纹图谱经多批样品验证后可用于紫苏子质量控制中，用于从整体上评价和控制紫苏子药材的质量,避免了只对单一或几个成分进行研究，使分析结果更加全面科学。

附图说明

图1为试验1提供的紫苏子抗氧化活性提取物标准指纹图谱；其中1至9为紫苏子抗氧化活性提取物的9个共有特征峰；

图2为S1-S10的10批紫苏子药材指纹图谱。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法，是按以下步骤进行：一、供试品溶液的制备：a、取紫苏子药材，粉碎后加入沸程为60～90℃的10倍质量的石油醚，回流3次，每次2h，得到残渣；

b、将残渣室温干燥后，加入10倍质量的质量浓度为75%的乙醇，回流2次，每次2h,收集两次回流所得溶液，然后过滤，收集滤液，再将滤液减压浓缩至干，得浸膏，即紫苏子抗氧化活性提取物；

c、将步骤b得到的紫苏子抗氧化活性提取物，用甲醇溶解成浓度为1mg/mL的溶液，用微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液；

二、指纹图谱的制作：将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以乙腈为A相，质量百分含量为0.5%的乙酸水溶液为B相进行梯度洗脱；

其中，高效液相色谱条件为：

色谱柱填料Thermo C18，规格为250×4.6mm，5μm；柱温为35℃；流动相为A相乙腈和B相质量百分含量为0.5％乙酸水溶液，流速0.8mL/min，检测波长280nm，进样10μL；

在此条件下分析供试品溶液，得到紫苏子抗氧化活性提取物的指纹图谱。

本实施方式提取了紫苏子中具有抗氧化作用的提取物，通过对DPPH自由基清除试验，证明了该提取物具有优良的抗氧化活性，本实施方式紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法具有可重复性好、精密度好和稳定可靠的优点。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：梯度洗脱顺序为：0min→15min→40min→50min，乙腈5％→20％→37％→50％。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中的微孔滤膜过滤是采用0.45μm微孔滤膜进行过滤的。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式采用一种紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法得到的紫苏子抗氧化活性提取物标准指纹图谱。

本实施方式的紫苏子抗氧化活性提取物标准指纹图谱有9个共有特征峰，这些共有特征峰构成了紫苏子抗氧化活性提取物的指纹特征，可作为紫苏子抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：紫苏子抗氧化活性提取物的指纹图谱有9个共有特征峰，相对保留时间分别为0.266～0.275min、0.552～0.560min、0.632～0.642min、0.809～0.813min、0.852～0.854min、0.885～0.886min、0.970～0.971min、1.000min和1.165～1.167min，这些共有特征峰构成了紫苏子抗氧化活性提取物的指纹特征，可作为紫苏子抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式紫苏子抗氧化活性提取物标准指纹图谱的用途是指抗氧化活性提取物指纹图谱作为标准指纹图谱用于紫苏子质量控制中。

本实施方式的紫苏子抗氧化活性提取物标准指纹图谱作为标准指纹图谱经多批样品验证后可用于紫苏子质量控制中，用于从整体上评价和控制紫苏子药材的质量,避免了只对单一或几个成分进行研究，使分析结果更加全面科学。

通过以下试验验证本发明的有益效果：

试验1：紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立

1、试验方法：本试验一种紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法，是按以下步骤进行：

一、供试品溶液的制备：a、取紫苏子药材，粉碎后加入沸程为60～90℃的10倍质量的石油醚，回流3次，每次2h，得到残渣；

b、将残渣室温干燥后，加入10倍质量的质量浓度为75%的乙醇，回流2次，每次2h,收集两次回流所得溶液，然后过滤，收集滤液，再将滤液减压浓缩至干，得浸膏，即紫苏子抗氧化活性提取物；

c、将步骤b得到的紫苏子抗氧化活性提取物，用甲醇溶解成浓度为1mg/mL的溶液，用微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液；

二、指纹图谱的制作：将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以乙腈为A相，质量百分含量为0.5%的乙酸水溶液为B相进行梯度洗脱；

其中，高效液相色谱条件为：

色谱柱填料Thermo C18，规格为250×4.6mm，5μm；柱温为35℃；流动相为A相乙腈和B相质量百分含量为0.5％乙酸水溶液，流速0.8mL/min，检测波长280nm，进样10μL；

在此条件下分析供试品溶液，得到紫苏子抗氧化活性提取物的指纹图谱。

2、试验仪器：HITACHI L-2000高效液相色谱仪；HITACHI L-2400紫外检测器；AT-130色谱柱柱温箱；HITACHI D-2000色谱工作站。

3、试验材料：10批不同产地、不同批号的紫苏子。

用质量百分含量为75%的乙醇溶液分别将本试验制备的10组的紫苏子抗氧化活性提取物溶解成浓度为1mg/mL的溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤，将所得的续滤液用于DPPH自由基清除法测定抗氧化活性。每组实验重复三次，根据抑制率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%计算；A0为不含提取物的对照吸光度；A1为含提取物的吸光度；A2是不含DPPH的吸光度，试验结果如表1所示。从表1中可知，紫苏子抗氧化活性提取物对DPPH自由基有不同程度的抑制作用。为比较紫苏子抗氧化活性提取物与Vc的抗氧化能力大小，对10批紫苏子活性提取物的EC₅₀值进行了测定，即：清除50%原始DPPH·浓度所需抗氧化剂量的大小。EC50值越小，样品清除自由基能力越强，抗氧化能力越强。具体操作如下：分别移取2.0mg/mL的样品溶液0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.08mL、0.16mL与2.0mL DPPH溶液混合，暗处反应30min，517nm下测定吸光度值(A1)，同时将上述5个浓度的样品溶液分别用乙醇溶液补至4mL，测混合液吸光值(A2)，2mL DPPH与2mL乙醇混合液的吸光值(A0)，计算抑制率。运用GraphPad Prim软件进行曲线拟合得出10批紫苏子样品醇提取物提取物的EC₅₀值。同方法测定Vc的EC₅₀值做阳性对照。结果如表2所示：紫苏子抗氧化提取物的EC₅₀在0.032～0.092mg/mL之间，作用最强的药材的提取物抗氧化能力约为Vc的四分之一，显示了较强的抗氧化能力。

其中本试验的DPPH溶液的制备方法：称取8mg的DPPH粉末，用无水乙醇定容至100mL，得初始浓度为2×10^-4mol/L的DPPH溶液，放置于4℃下冷藏备用。

按照本试验的紫苏子抗氧化活性提取物的高效液相色谱指纹图谱的建立方法，对10批紫苏子建立了高效液相色谱指纹图谱，得到的谱图导入中药色谱指纹图谱相似度计算软件（中华人民共和国药典委员会，2004年版），确定了9个共有特征峰，以8号峰为对照峰，共有特征峰的相对保留时间分别为；1号共有特征峰相对保留时间为0.270±0.34%，2号峰相对保留时间为0.553±0.27%，3号峰相对保留时间为0.639±0.38%，4号峰相对保留时间为0.810±0.16%，5号峰相对保留时间为0.853±0.06%，6号峰相对保留时间为0.886±0.05%，7号峰相对保留时间为0.970±0.05%，8号峰相对保留时间为1.000，9号峰相对保留时间为1.166±0.07%，上述共有特征峰构成了紫苏子抗氧化活性提取物的指纹特征，可作为紫苏子抗氧化活性提取物的标准指纹图谱。

本试验得到的紫苏子抗氧化活性提取物的标准指纹图谱如图1所示。由图1可以看出，通过本方法可以清晰地得到具有9个共有特征峰的紫苏子抗氧化活性提取物的标准指纹图谱，为整体评价紫苏子的质量提供了良好的依据。

4、方法学考察

4.1方法重现性试验

取同一批紫苏子药材6份，按照试验方法中紫苏子抗氧化活性提取物供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样6次，测得共有色谱峰的相对保留时间RSD%小于1%，相对峰面积RSD%小于3%（见表3），表明本发明的方法重现性良好。

4.2指纹图谱精密度试验

取方法重现性试验用的供试品溶液一份，连续进样5次，测得共有色谱峰的相对保留时间RSD%小于1%，相对峰面积RSD%小于3%（见表4），表明本发明的方法精密度良好。

4.3指纹图谱稳定性试验

取方法重现性试验用的供试品溶液一份，进行指纹图谱测定，考察供试品溶液48小时内的稳定性，测得共有色谱峰的相对保留时间RSD%小于1%，相对峰面积RSD%小于3%（见表5），表明供试品溶液在48小时内稳定。

以上试验结果显示，该测定方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定。

表110批紫苏子抗氧化活性提取物的抑制率

注：每组实验重复3次，结果用平均值±标准差表示

表2   10批紫苏子抗氧化提取物的EC₅₀值

表3重现性试验结果（n=6）

表4精密度试验结果（n=5）

表5稳定性试验结果（n=5）