用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒

摘要

本发明属于生物技术领域，特别涉及用于检测慢性乙型肝炎耐药性的多重连接探针实时荧光PCR技术，所述多重连接探针实时荧光PCR试剂盒包括MLPA探针组、填充序列和通用引物组成，所述探针分别是针对HBV的P基因逆转录区的rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T突变位点而设计的，探针的序列如SEQ ID NO:1-10所示；本发明还涉及运用该试剂盒检测HBV拉米夫定及阿德福韦耐药的方法，该方法结合了多重连接探针扩增(MLPA)技术的高通量和实时荧光PCR快速灵敏、实时检测的特点，与直接测序方法进行了比较，符合率高，而且能够检测出测序方法由于灵敏度不够而不能检测的样本；整个检测耗时4～5小时，为临床提供了一种成本低廉、检测快速的乙肝耐药检测方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及用于检测慢性乙型肝炎耐药性的多重连接探针实时荧光PCR技术。 

背景技术

慢性乙型肝炎仍然是全世界的重大公共卫生问题。在中国，拉米夫定和阿德福韦这两种药物现已成为治疗慢性乙肝的一线药物。但是HBV耐药的产生成为长期治疗慢性乙肝成功与否的主要障碍。因此检测患者感染的HBV是否对拉米夫定和阿德福韦耐药，对临床抗HBV药物的选择非常重要。目前多种多样的用于乙肝耐药检测的方法被报道，包括PCR产物直接测序法、反向线性杂交法(INNO LIPA)、基因芯片和实时PCR等技术。PCR产物直接测序法和反向线性杂交法(INNO LIPA)是目前公认的可用于临床检测的方法。基因测序技术虽然是金标准，但是灵敏度较低,不能检测20%以下的突变株。INNO LIPA方法灵敏度高，但使用INNO LiPA法的试剂和配套仪器成本较高。基因芯片技术通量高，但检测费用贵，不利于临床推广。随着分子诊断技术的发展，方便快捷的实时荧光定量PCR方法被应用于HBV耐药的检测，其原理主要是依靠荧光探针Tm值的差异来区分点突变。但是这种方法对Tm值接近的突变位点、邻近的突变位点或“沉默”突变分辨力较差，而且需要将突变位点设置在探针的中间部位（例如MGB探针和锁核酸探针），探针设计常受到限制，影响了其检测通量，目前大多数只能检测单个位点。这里我们介绍一种新的检测方法，叫做MLP-rtPCR。该方法结合了MLPA技术通量高和实时PCR方法灵敏、快速和经济的特点，可以在同一反应管中同时快速检测与HBV拉米夫定和阿德福韦耐 药相关的5种突变，提高了其检测通量，包括HBV P基因逆转录区rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T的点突变。MLPA技术首先由Schouten于2002年建立。MLPA多达40对的探针，主要用于检测基因拷贝数的变化。同时，也可检测单核苷酸多态性或者单个碱基突变。目前有利用该技术对结核分枝杆菌进行基因分型及耐药检测。但是利用的是传统的MLPA技术，即利用毛细管电泳来定量分析待检DNA靶序列或利用芯片杂交技术来对病原体核酸进行定量和分型，这需要合成大量不同长度的探针，或者需要探针固定、杂交和洗脱等复杂的操作步骤。然而，以TaqMan探针作为标签的多重实时荧光定量PCR可省去毛细管电泳或者芯片杂交检测步骤，直接实时扩增连接后的MLPA探针，判定结果直观，方便快捷。因此，这是我们首次将MLPA技术和荧光定量PCR技术相结合来建立一种检测单碱基突变的方法。并将其用于乙肝耐药的检测。 

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种多重连接探针实时荧光PCR试剂盒，其能检测拉米夫定和/或阿德福韦耐药性，具有较高的特异性和敏感性。 

本发明介绍一种新的检测方法，叫做MLP-rtPCR。可以在同一反应管中同时快速检测与HBV对拉米夫定和阿德福韦耐药相关的5种突变，包括HBV P基因逆转录区rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T的点突变。 

用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒，所述多重连接探针实时荧光PCR试剂盒包括MLPA探针组、填充序列和通用引物组成，所述MLPA探针组分别是针对HBV的P基因逆转录区的rtM204V和/或rtM204I和/或rtA181T和/或rtA181V和/或rtN236T位点而设计的特异性序列。 

用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒，所述多重连接探针实时荧光PCR试剂盒包括MLPA探针组、填充序列和通用引物组成，所述MLPA探针组共有1-5组（表1），包括MLPA探 针组Ⅰ和/或MLPA探针组Ⅱ和/或MLPA探针组Ⅲ和/或MLPA探针组Ⅳ和/或MLPA探针组Ⅴ；所述MLPA探针组Ⅰ分为如SEQ ID NO:1所示的5’探针和如SEQ ID NO:2所示的3’探针，所述MLPA探针组Ⅱ分为如SEQ ID NO:3所示的5’探针和如SEQ ID NO:4所示的3’探针，所述MLPA探针组Ⅲ分为如SEQ ID NO:5所示的5’探针和如SEQ ID NO:6所示的3’探针，所述MLPA探针组Ⅳ分为如SEQ ID NO:7所示的5’探针和如SEQ ID NO:8所示的3’探针，所述MLPA探针组Ⅴ分为如SEQ ID NO:9所示的5’探针和如SEQ ID NO:10所示的3’探针。其中，MLPA探针组Ⅰ是针对rtM204V点突变设计的，MLPA探针组Ⅱ是针对rtM204I点突变设计的,MLPA探针组Ⅲ是针对rtA181T点突变设计的,MLPA探针组Ⅳ是针对rtA181V点突变设计的,MLPA探针组Ⅴ是针对rtN236T的点突变设计的；关于HBV P基因逆转录区rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T的点突变的文章，可参考下述三篇文献。1）Allen MI,Deslauriers M,Andrews CW，et al.Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine.Lamivudine Clinical Investigation Group.Hepatology 1998,27:1670–1677.2）Borroto-Esoda K,Miller MD,Arterburn S.Pooled analysis of amino acid changes in the HBV polymerase in patients from four major adefovir dipivoxil clinical trials.J Hepatol 2007,47:492–498.3）Hadziyannis SJ,Tassopoulos NC,Heathcote EJ,Chang TT,Kitis G,Rizzetto M,et al.Long-term therapy with adefovir dipivoxil for HBeAg-negative chronic hepatitis B.N Engl J Med 2005,352:2673–2681.”为了提高检测的特异性，针对M204V和M204I的3’探针5’末端倒数第二个碱基增设了一个错配碱基。针对A181T和A181V的5’探针3’端倒数第3个碱基增设了1个错配碱基。不增设错配碱基的条件下，本试剂盒也能达到同样的技术目的。 

多重连接探针实时荧光PCR，简称MLP-rtPCR技术的原理如下：每个MLPA探针（即本发明所说的MLPA探针组）由两个短探针组成，分别叫做5’探针和3’探针，3’探针的5’端磷酸化。每个短探针除含有一段特异性的杂交序列之外，还另设计有通用引物序列。至少有一个短探针在通用引物序列和杂交 序列之间有一段用于调整探针长度的填充序列或作为标签的特异序列（本发明为Taqman探针序列作为标签序列）。当两短探针在一定的盐离子浓度下与靶序列杂交后，5’探针的3’端与3’探针的5’端位置毗邻且无空缺，在DNA连接酶的作用下形成磷酸二酯键将探针连接成完整的单链DNA探针。探针连接的必要条件是5’探针的3’末碱基必须与靶序列完美互补配对。被连接后的探针利用一对通用引物对其进行实时荧光PCR。在上述原理上，设计了用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒。 

在所述多重连接探针实时荧光PCR试剂盒中，可设计多种通用引物，目的在于对其实施PCR，作为优选的方案，所述通用引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。在所述多重连接探针实时荧光PCR试剂盒中，可设计多种填充序列，目的在于调整探针长度和特异性标签，作为优选的方案，所述的用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒的所述标签序列（填充序列）为Taqman探针序列，如SEQ ID NO:13-17所示。 

本发明的目的之二在于提供一组探针，其能检测HBV的P基因的突变，特异性高。 

为实现上述目的，本发明的技术方案为： 

用于检测HBV的P基因的探针，所述MLPA探针有1-5组，分别是针对HBV的P基因逆转录区的rtM204V和/或rtM204I和/或rtA181T和/或rtA181V和/或rtN236T位点而设计的特异性序列，其中rtM204V位点的特异性序列如SEQ ID NO:18-19任一所示，rtM204I位点的特异性序列如SEQ ID NO:20-21任一所示，rtA181T位点的特异性序列如SEQ ID NO:22-23任一所示，rtA181V位点的特异性序列如SEQ ID NO:24-25任一所示，rtN236T位点的特异性序列如SEQ ID NO:26-27任一所示。 

本发明的目的之三在于提供上述试剂盒的使用方法，该方法检测耗时短，同测序方法相比，符合率高，简单快速，而且成本低廉。 

为实现上述目的，本发明的技术方案为： 

所述的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒的使用方法，将各组所述MLPA探针组中的5’探针和3’探针与靶序列杂交，短探针被DNA连接酶连接后，经一对通用引物进行荧光定量PCR，荧光探针被DNA聚合酶水解，释放出荧光基团，读取荧光数据。具体包括以下步骤： 

A检测前预扩增 

提取待测样本的HBV基因组，采用普通PCR技术扩增出P基因逆转录区片段作为靶序列，所述P基因逆转录区片段覆盖欲检测的突变位点；上游引物：ccccaactcccaattacatatcc下游引物:cccatcatcttgggctttcg。 

B杂交反应 

在如下离子浓度下(1.5M KCl,300mM Tris-HCl Ph8.5,1mM EDTA)，MLPA探针与预扩增产物在60℃下杂交1h.所述MLPA探针组中5’探针和3’探针与靶序列互补配对。5’探针的3’端与3’探针的5’端位置毗邻且无空缺。 

C连接反应 

每组MLPA探针组中的3’探针和5’探针与步骤A所得的靶序列杂交反应后，在TaqDNA连接酶的作用下，凭借磷酸二酯键将所述MLPA探针组中的一对探针连接成单链DNA探针； 

D实时荧光PCR 

加入荧光素标记的TaqMan探针，用所述通用引物扩增步骤C所得的单链DNA探针，采集荧光信号强度，并读数和分析。 

在DNA连接酶的作用下，凭借磷酸二酯键将所述MLPA探针组中的一对探针(5’探针和3’探针)连接成单链DNA探针，反应完成后，灭活连接酶。检测过程中，采用了三种方式。a方式：探针与靶序列恒温杂交1h后，ligase65酶54℃反应20min。b方式：探针与靶序列恒温杂交1h后采用TaqDNAligase酶60℃反应20min。c方式：将探针、靶序列和TaqDNAligase酶加入同一反应管，采用热循环杂交，反应条件95℃5min;（95℃30s,60℃5min）10个循环。使杂交和连接反应同时进行。 

实时荧光PCR在25μL体系中进行，使用Premix Ex Taq kit(DRR390A,宝生 物)，加入12.5μL的mix溶液,加入终浓度为0.2umol/L的引物，120nmol/L分别标记FAM（rtM204V）、HEX（rt M204I）,ROX（rtA181T）和CY5（rtA181V）的taqMAN探针,84nmol/L标记LC-red705（rtN236T）的taqMAN探针和5μL的连接产物。反应条件:95℃30s,(95℃5s,55℃30s)45个循环。。 

进一步，步骤A中，所述突变位点为rtM204V位点、rtM204I位点、rtA181T位点、rtA181V和rtN236T位点中任一个或多个。 

进一步，所述的使用方法，步骤A、B、C和D中，设置有实验组、阴性对照组、阳性对照组和空白组，所述阴性对照组为HBV阳性的野生型，阳性对照组为各突变型。 

进一步，所述的使用方法，步骤D中，SEQ ID NO:13被FAM荧光素标记，SEQ ID NO:14被HEX荧光素标记，SEQ ID NO:15被ROX荧光素标记，SEQ ID NO:16被CY5荧光素标记，SEQ ID NO:17被LC-red705荧光素标记。 

本发明的有益效果在于： 

1）建立了一种检测HBV常规耐药位点的方法，利用了MLPA技术的高通量特点，可实现同一反应管同时检测5种突变。利用实时荧光PCR灵敏快速的特点，整个检测耗时4-5小时，比测序方法灵敏,简单快速，而且成本低廉。通过对该方法的反应条件进行优化，5种MLPA探针均能够有效地检测相应突变位点。 

2）为了防止假阳性和假阴性结果的出现，每次实验均设立了阴性对照和阳性对照。MLPA探针在设计时也考虑了碱基错配的因素。通过多次试验探索，检测M204V和M204I的MLPA探针的3’探针5’端倒数第二个碱基增设了一个错配碱基，可以有效防止这两者探针之间的交叉反应和提高检出的特异性。另外，检测A181T和A181V的5’探针的3’末端倒数第3个碱基增设了1个错配碱基，可以有效地防止两者之间的交叉反应和因碱基错配而导致的假阳性结果(详见表2和图3)。 

3）为了节约检测时间和简化步骤，本发明采用恒温杂交1h的方式，对TaqDNA连接酶（NEB,美国）和ligase-65酶（MRC-Holland，荷兰）进行了比 较，TaqDNA连接酶表现优于ligase-65酶,因此选择了TaqDNA连接酶。 

4）影响MLP-rtPCR方法灵敏度除了连接效率外，rtPCR的扩增效率也相当重要，由于rtPCR是通过一对通用引物对既定长度(120bp左右)的探针进行扩增，反应条件变得易于控制。在同一反应条件下，各个突变位点的扩增效率能达到99%～105%，部分突变位点能够检测出低至0.1%含量的突变株。临床样本检测结果也显示，MLP-rtPCR能够检测出测序方法由于灵敏度低而不能检测的样本（详见表7）。 

附图说明

图1为MLP-rtPCR简要原理。其中(a)5’探针和3’探针(b)两短探针与靶序列杂交(c)短探针被DNA连接酶连接后，经一对通用引物扩增(d)荧光定量PCR，荧光探针被DNA聚合酶水解，释放出荧光基团。 

图2为实施例二中a方式、b方式和c方式三种方式的结果比较图。其中，(A):针对rtM204V突变的MLPA探针组Ⅰ，其被FAM标记；(B):针对rtM204I突变的MLPA探针组Ⅱ，其被HEX标记；(C)：针对rtA181T突变的MLPA探针组Ⅲ，其被ROX标记；(D)针对rtA181V突变的MLPA探针组Ⅳ，其被CY5标记；(E)针对rtN236T突变的MLPA探针组Ⅴ，其被LC-red705标记。 

图3为实施例二中用4种MLPA探针检测各个突变株及野生株，其中，a:MLPA探针与靶序列完全匹配，b:3’探针5’末端倒数第二个碱基错配（如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4）；c:5’探针3’末端倒数第二个碱基错配（如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29）；d:5’探针3’末端倒数第三个碱基错配（如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7）。 

图4为采用优化后的探针检测各个突变株及野生株。其中，(A):针对rtM204V突变的MLPA探针组Ⅰ，其被FAM标记；(B):针对rtM204I突变的MLPA探针组Ⅱ，其被HEX标记；(C)：针对rtA181T突变的MLPA探针组Ⅲ，其被ROX标记；(D)针对rtA181V突变的MLPA探针组Ⅳ，其被CY5标记；(E)针对rtN236T突变的MLPA探针组Ⅴ，其被LC-red705标记。 

图5为实时荧光PCR检测M204V位点的扩增效率图；(A):模板经一系列10倍稀释后的扩增曲线（B）稀释不同倍数与CT值之间的标准曲线。 

图6为五个通道检测不同比例突变株的扩增曲线，(A):针对rtM204V突变的MLPA探针组Ⅰ，其被FAM标记；(B):针对rtM204I突变的MLPA探针组Ⅱ，其被HEX标记；(C)：针对rtA181T突变的MLPA探针组Ⅲ，其被ROX标记；(D)针对rtA181V突变的MLPA探针组Ⅳ，其被CY5标记；(E)针对rtN236T突变的MLPA探针组Ⅴ，其被LC-red705标记。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。 

本实施方式中，涉及到的MLP-rtPCR简要原理，其原理如图1所示。所述原理具体为：每个MLPA探针由两个短探针组成，分别叫做5’探针和3’探针，3’探针的5’端磷酸化。每个短探针都有一段通用引物序列和一段杂交序列。至少有一个短探针在通用引物序列和杂交序列之间有一段用于调整探针长度的填充序列或作为标签的特异序列(本专利设计的填充序列为TaqMan探针序列)，除TaqMan探针序列之外，只要序列能实现调整探针长度或对探针赋予标签的的功能即可。当两短探针在一定的盐离子浓度下与靶序列杂交后，5’探针的3’端与3’探针的5’端位置毗邻且无空缺，在DNA连接酶的作用下形成磷酸二酯键将探针连接成完整的单链DNA探针。探针连接的必要条件是5’探针的3’末碱基必须与靶序列完美互补配对。被连接后的探针利用一对通用引物对其进行实时荧光PCR。 

实施例一 通用引物、TaqMan探针及MLPA探针设计 

利用primer premier 6.0软件在紫花苜蓿叶绿体基因组中设计了一对通用引物，利用Primer Expres 3.0软件设计了5个TaqMan探针序列作为MLPA探针的标签序列，分别标记FAM、HEX、ROX、CY5和LC red705荧光素（上海生工）。探针Tm值比引物Tm值高10℃左右，且满足探针自身二聚体、发夹 结构和交叉二聚体结构最小。首先在NCBI核酸数据库检索HBV P基因核酸序列，利用clustalx1.83软件进行多序列比对，根据中国HBV主要流行类型B和C型，设计了检测rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T位点的MLPA探针，MLPA探针的杂交序列Tm值大于65℃，5’探针3’末端碱基作为突变位点。为了提高检测的特异性，针对M204V和M204I的3’探针5’末端倒数第二个碱基增设了一个错配碱基。针对A181T和A181V的5’探针3’端倒数第3个碱基增设了1个错配碱基。所有人工合成的探针经高效液相色谱法纯化（上海生工）。 

表1 检测乙型肝炎病毒拉米夫定及阿德福韦耐药位点的探针 

注：黑色加粗碱基表示突变位点，加粗并斜体表示增设的错配碱基 

实施例二 试剂盒的制备及运用 

一材料与方法 

病人样本 

收集来自第三军医大学西南医院感染科2012年3月至2013年6月门诊和住院病人血清116例，均为HBV DNA载量检测阳性标本。本实验方案通过第三军医大学伦理委员会的认可。 

DNA提取及检测前PCR扩增 

利用care HBV RT-PCR Assay v2kit（凯捷，德国）提取HBV基因组，利用Prime STAR Max DNA Polymerase Kit（宝生物，日本）扩增出P基因逆转录区片段： 

ccatcatcttgggctttcgcaaaattcctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttatgccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaaaccctcataaaaccaaacgatggggatattcccttaacttcatgggatatgtaattgggggttgggg。上游引物：ccccaactcccaattacatatcc，下游引物：cccatcatcttgggctttcg，扩增条件：98℃10s，55℃5s，72℃30s，35个循环。 

MLP-rtPCR反应 

HBV的P基因逆转录区扩增产物经蒸馏水稀释至4.0ng/μl后,吸取0.5μl于200μl反应管，加入1μl盐溶液（1.5M KCl,300mM Tris-HCl Ph8.5,1mM EDTA），或参考“chouten J P,McElgunn C J,Waaijer R,et al.Relative quantification of 40nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.Nuc Acid Res.2002,30,e57”，加入0.5μl含有5种MLPA探针（50～500pmol/L）的混合液,加入双蒸水补充体系至5μl。样本在95℃下变性5min,然后在60℃下孵育1h，或参考“Reijans M,Dingemans G,Klaassen C,Meis JF,Keijdener J,Mulders B,Eadie K,Leeuwen W,Belkum A,Horrevorts AM,Simons G.Respifinder:a new multiparameter test to differentially identify fifteen respiratory viruses.J Clin Microbiol,2008,1232-1240”,再加入含有TaqDNAligase的混合液至10μl,终浓度1000U/ml TaqDNAligase,20mM Tris-HCl,25mM KAc,10Mm Mg(Ac)₂,10mMDTT,1mM NAD,0.1%TritonX-100,Ph 7.6,孵育20min后，加热至98℃ 5min灭活连接酶。实时荧光PCR在25μl体系中进行，使用Premix Ex Taq kit(DRR390A, 宝生物)，加入12.5μl的mix溶液，加入终浓度为0.2μmol/L的引物，120nmol/L分别标记FAM（rtM204V）、HEX（rt M204I）、ROX（rtA181T）和CY5（rtA181V）的TaqMAN探针,84nmol/L标记LC-red705（rtN236T）的TaqMAN探针和5μl的连接产物。反应条件：95℃30s，(95℃5s，55℃30s)45个循环。荧光信号通过在荧光定量PCR仪Rotor-Gene Q（凯捷,德国）退火步骤结束时采集。 

直接测序 

测序前对HBV p基因逆转录区进行巢式PCR扩增，第一轮扩增上游引物:tcctgctcaaggaacctcta；下游引物：aggccttataagttggcga，反应条件：94℃ 8min，(94℃ 30s，54℃30s，72℃1min)，30个循环，72℃10min。以第一轮反应产物为模板再次扩增，上游引物：cy(t/c)tgtattcccatcccatc；下游引物：tgacatactttccaatcaatagg。反应条件94℃8min，（94℃30s，55℃40s，72℃50s），30个循环，72℃10min。扩增产物经纯化后送华大基因公司测序。 

阴性对照株及阳性对照株的获得 

将HBV的P基因逆转录区扩增产物纯化后克隆到PMD18-T载体进行单克隆测序（宝生物）。将经测序鉴定为野生株的质粒作为模板，再次扩增P基因逆转录区片段，用于野生株样本阴性对照。通过同样的方法，获得5种突变株的阳性对照样本。 

TA克隆测序 

将HBV的P基因逆转录区扩增产物纯化后克隆到pUC57载体，随机挑选至少20个阳性克隆菌落做单克隆测序(上海生工)。 

统计学分析 

采用SPSS13.0统计学软件分析数据，采用四格表卡方检验、McNemar test验证MLP-rtPCR方法与直接测序方法检出率之间有无统计学差异，Kappa系数检验验证两种方法的一致性。 

二 结果 

MLP-rtPCR反应条件优化 

对于多重探针连接反应步骤，我们参考以前的文献，对同一份样本进行了 三种方式检测,分别检测了上述5个突变位点。a方式：探针与靶序列恒温杂交1h后，ligase65酶54℃反应20min。b方式：探针与靶序列恒温杂交1h后采用TaqDNAligase酶60℃反应20min。c方式：将探针、靶序列和TaqDNAligase加入同一反应管，采用热循环杂交，反应条件95℃5min；（95℃30s，60℃5min）10个循环。使杂交和连接反应同时进行。检测结果（图2）显示,总体来看恒温杂交方式要好于热循环杂交（图2A，2C，2D，2E），TaqDNAligase连接效率高于ligase 65酶（图2B，2C，2D，2E）。因此采用b方式。 

特异性 

为了验证MLPA探针检测单碱基突变的特异性，探针序列设计时增设了错配碱基，其特征在于：将如SEQ ID NO:5所示的5’探针错配，其核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；和/或将如SEQ ID NO:7所示的5’探针错配，其核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。并对5种突变形式的突变株样本、野生株阴性对照样本和水样本按照材料与方法中介绍的检测步骤进行检测（图3，表2），对于M204V/I位点，采用b类探针能够有效抑制野生株的扩增。对于A181T/V位点，采用d类探针能够有效抑制野生株的扩增。对于N236T位点，采用a类探针,野生株与突变株的循环阈值（CT值）相差最大（15个循环）,当检测N236T的MLPA探针浓度降低至50pmol/L时,能够有效抑制野生株的扩增（图4E）。图4A-E表示采用优化后的探针，各通道间无荧光交叉反应，MLPA探针间亦无交叉反应。 

表2 MLPA探针中加入一个错配碱基对MLP-rtPCR反应的影响 

表2中省略号处的核苷酸序列与表1中一致。 

灵敏度 

通过调整荧光探针浓度、引物浓度和退火温度等参数，使检测方法保证特异性的同时提高检测灵敏度。以实时荧光PCR扩增后的产物经一系列10倍稀释后作为RT-PCR的扩增模板，考察PCR的扩增效率。图5A表示rtM204V突变位点的扩增产物经一系列10倍稀释后的扩增曲线，图5B表示不同稀释倍数与CT值之间的标准曲线。对于rtM204V突变位点，该方法的扩增效率能够达到101%。5个检测通道的结果总结于表3中。为了更加准确地验证MLP-rtPCR方法对微量比例突变株检测的能力，我们将人工合成的突变株与野生株核酸配比成不同比例（总浓度500nmol/L，约为10¹¹拷贝/ml），图6显示每个通道能够检测最低比例突变株的扩增曲线。M204V、M204I、A181T和N236T通道能够检测0.1%的突变株。A181V能够检测1%的突变株。 

表3 对不同突变位点rtPCR的扩增效率 

临床样本检测及统计学分析 

对116例标本分别用MLP-rtPCR方法和直接测序法检测。每份样本，MLP-rtPCR做双次测定。两种方法检测阳性率之间的比较总结于表4中。经卡方检验两者方法检出率无统计学差异(p>0.05)。表5表示MLP-rtPCR法和测序法检测之间的一致性。对于M204V位点，测序法检测阳性的标本，MLP-rtPCR法均能检出，且检测出了测序法未检出的6例样本。Kappa检验（Kappa=0.674）显示两者吻合度一般。对于M204I位点，1例测序法检测阴性，而MLP-rtPCR法检测阳性。另1例由于MLP-rtPCR法检测前预扩增失败而检测阴性，而测序法检测阳性。kappa系数检验（Kappa=0.962）显示两者的吻合度强。A181T位点有一例MLP-rtPCR方法未检出。kappa系数为0.905，两者吻合度较强。A181V突变位点一例测序阳性，而MLP-rtPCR方法未检出（由于病毒含量低，预扩增失败）。另一例测序阴性，而MLP-rtPCR方法检测阳性。kappa系数为0.880,两种方法吻合度较强。对于N236T突变位点，1例样本MLP-rtPCR方法未检出。Kappa系数为0.965，吻合度强。表6显示了被MLP-rtPCR方法检测突变株的耐药类型及基因型，其中拉米夫定耐药41例，阿德福韦耐药16例及两者共同耐药6例。 

表4 MLP-rtPCR与直接测序法检测突变阳性率比较 

a:χ²=1.970，p=0.160 b:χ²=0.095，p=0.757 c:χ²=0.035，p=0.851 

表5 MLP-rtPCR和直接测序方法的一致性比较 

a:McNemar检验M204I，P=0.031；Kappa值=0.674(p=0.000) 

b:McNemar检验M204V，P=1.000；Kappa值=0.962(p=0.000) 

c:McNemar检验A181T，P=1.000；Kappa值=0.905(p=0.000) 

d:McNemar检验A181V，P=1.000；Kappa值=0.880(p=0.000) 

e:McNemar检验N236T，P=1.000；Kappa值=0.965(p=0.000) 

表6 MLP-rtPCR检测各突变株的频率及基因型 

^*直接测序方法检测阴性，MLP-rtPCR方法检测阳性 

TA克隆测序 

为了验证MLP-rtPCR的准确性，对于直接测序阴性而MLP-rtPCR检测阳性的7例样本进行了TA克隆后测序。每个样本至少随机挑取20个以上单克隆菌做测序，结果发现共有四例样本发现低比例的突变。结果见表7，说明MLP-rtPCR方法比直接测序方法更加灵敏。 

表7 经TA克隆测序验证的7例样本突变比例分析 

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。