桑树病程相关基因非表达子基因NPR1的克隆及应用

摘要

本发明涉及桑树病程相关基因非表达子基因NPR1的克隆及应用，本发明从桑树叶片中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据其他植物中NPR1基因编码蛋白的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式（PCR）反应，将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析，再通过3′和5′末端快速扩增技术获得全长cDNA。进一步构建植物正义表达载体，转化桑树，转基因桑树具有明显的抗桑树炭疽病和青枯病的能力。该基因可用于桑树或其他植物抗病性育种研究。

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种桑树病程相关基因非表达子基因NPR1的克隆及应用，属于分子生物学 和生物技术领域。

二、背景技术

桑树在长期的进化过程中常常受到一些病原微生物的侵袭,由于桑蚕对农药敏感，常规 的农药难以在桑园施用，桑树病害往往造成桑叶产量和质量的降低，是影响蚕桑业发展的重 要因素。开发广谱抗病新资源，培育持久抗病新品种是解决这一问题的根本途径之一。因此， 利用植物本身编码的抗病基因，通过基因工程技术培育抗病新品种是解决这一问题的根本途 径。植物在长期进化过程中，形成了复杂的防御病原物侵染的抗性机制，这一机制由不同水 平的多个抗性途径交叉、重叠组成，使得植物抗病性具有多种表现形式。不同形式的抗病性 信号传导途径有区别，也有重叠和交叉。其中的交叉点将是调节植物整体抗病性的重要因子。 近年来的研究结果表明，NPR1不仅对系统获得性抗性和诱导系统抗性起核心调控作用，而且 也是基础抗性以及由抗病基因决定的抗性的重要调控因子，是植物抗病性的关键调节基因。 通过基因工程技术将NPR1应用于桑树育种，可以使桑树避免多种病害的发生，具有光明的应 有前景。但关于桑树NPR1基因的克隆及其在桑树抗病性中的作用，目前还未见报道。

三、发明内容

本发明的目的旨在提供一种可提高桑树抗病性的相关基因NPR1，同时提供一种该基因 在植物中应用的方法，可提高植物的抗病能力。

本发明中提供的核苷酸序列来自桑树。

本发明从桑树（Morus alba var.multicaulis）叶片中提取总RNA，反转录得到cDNA。 根据GenBank中已发布的其他植物NPR1基因编码蛋白的保守氨基酸序列，设计兼并引物， 进行常规聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）。将PCR产物与pMD18-T载 体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析。然后通过3′和5′ 末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术分别获得3′和5′端序 列。根据cDNA的3′和5′末端序列设计特异引物，以桑树的cDNA为模板进行PCR扩增， 得到桑树NPR1的cDNA全长序列，其基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列 如SEQ.ID.NO.2所示。

桑树NPR1基因开放阅读框全长1743bp。由此推演出该基因编码的蛋白具有580个氨基 酸，将蛋白质序列在GenBank中检索，发现与已发表的ViNPR1（葡萄，XM002281439）、CaNPR1 （辣椒，DQ648785）、NPR1（番茄，NM001247629），NiNPR1（烟草，AF480488）等相比，蛋白 质同源性分别为72.35%、69.40%、68.38%，68.31%。由此表明，我们成功分离得到了桑树 NPR1基因的全长cDNA。

桑树NPR1基因序列如下：

序列表

(1)SEQ.ID.NO.1的信息

(a)序列特征

长度：1743bp

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

(b)分析类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：桑树（Morus alba var.multicaulis）

(f)序列描述：SEQ.ID.NO.1

atggattcca aaaccggctt ttccgattcc aacgagatcc tgagcaacag caacagcagc     60

atatgctgca tgggccaaaa actgccctcg tcgtcggaga attcaccgcc gtcggatgtc    120

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gtgctctatg cttctttcac gtttcaggtg tccgagttgg tggcgcttta ccagaatcat    540

cttttagata ttcttgacaa gattgcaatc gacgacgtct tggcggttct atctgttgca    600

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gtcgtaatgg atatttctca aattgatgac acttctgagt tcttagacgg gcaaagttcg   1380

aagaatttaa atggtgctaa gagaaaaaca gtagacttaa atgaagctcc tttcaagatt   1440

caggaggagc atctgatcag actgaaaaca ctttctagaa ctgtggaact tgggaaacgc   1500

ttcttccctc gttgctcaga agtactaaat aagatcatgg atgctgaaga cttgtcactg   1560

ctagcatacc tgggacatga cactcctaca gaacgtctgg taaagaaaag gatggaactg   1620

caagaagtgc tcagtaaagc attcgacgaa gataaagaag aaatcgattg gtctgcaata   1681

gcatcttctt catcttccac ttcaattgta aggccaggtg gtaagctcag catcaacaaa   1740

taa                                                                 1743 其中灰色方框内的atg和taa分别为起始密码子和终止密码子。

(2)SEQ.ID.NO.2的信息

(a)序列特征

长度：580个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(b)分析类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ.ID.NO.2

本发明构建了桑树NPR1基因的超表达载体pBI121-NPR1，将该表达载体转入农杆菌 GV3101感受态细胞，筛选阳性转化子，采用叶盘转化法转化桑树。对获得的转基因桑树植 株进行抗病能力分析表明，转基因桑树植株NPR1的过量表达能显著提高其抗病能力，具有 良好的应用前景。

本发明涉及一种植物表达载体，包含有如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列，用于提 高植物的抗病性。

本发明提供了桑树NPR1基因在植物中应用的方法，可提高植物的抗病能力。步骤为：

1)将NPR1基因的cDNA序列置于CaMV35S强启动子之下，构建植物表达载体；

2)将构建的表达载体转入农杆菌感受态细胞；

3)利用2)获得的转化子转化植物，得到转基因植株。

本发明的优点在于：本发明提供了桑树中的一个内源NPR1基因及其在桑树转基因中的 应用。利用农杆菌T-DNA区将启动子-NPR1-终止序列表达盒导入桑树基因组中，可以实现 内源基因的高效稳定表达。本发明证实了桑树NPR1基因在增强桑树抗病中的作用，为桑树 或其他植物抗性育种提供了一种有效的候选基因，对于研究桑树或其他植物的广谱性抗病 性具有重要意义。

四、附图说明

图1.桑树NPR1（MuNPR1）氨基酸序列与其它几种植物的NPR1氨基酸序列的比对结果。 其中相同的氨基酸残基用黑底表示。它们在GenBank中的注册号及其物种来源分别为： ViNPR1（葡萄，XM002281439）、CaNPR1（辣椒，DQ648785）、NPR1（番茄，NM001247629）， NiNPR1（烟草，AF480488）。

图2.桑树NPR1基因植物正义表达载体的构建及酶切验证。

图2中：A为桑树NPR1基因植物正义表达载体的构建图，B为该表达载体经BamH I和 SacI双酶切的电泳图谱。表明我们已经将桑树NPR1基因核苷酸序列插入到植物表达载体 pBI121中，成功构建了NPR1基因植物正义表达载体。

图3.桑树叶片愈伤不定芽分化（A）、桑树抗性芽（B）和转基因植株（C）。说明我们 已成功建立了桑树再生和遗传转化体系。

图4.部分转基因植株的PCR鉴定结果。CK：非转基因对照；1-5：转基因桑树植株；M： marker DL2000。说明我们已成功地将NPR1基因转入桑树体内，并获得了转基因植株。

五、具体实施方式

实施方式（一）：桑树NPR1基因的克隆方法

1、RNA的提取：利用TransZol Plant试剂盒提取桑树叶片总RNA。

2、cDNA第一链的合成

在0.25ml离心管中加入下列试剂：

RNA           4μL

oligo d(T)₁₆  2μL

DEPC-H₂O      5μL

混匀后65℃水浴5min，冰上冷却5min，轻离心，加入下列试剂：

混匀，稍离心后，42℃保温1h，然后-20℃保存备用。

3、cDNA同聚物加尾反应

在0.25mL离心管中配制下列反应液：

将上述反应液37℃反应30min；加入50μL苯酚/氯仿/异戊醇（体积比为25:24:1），充 分混匀；离心，取上层移至另一离心管中；加入两倍体积的冷无水乙醇，-20℃沉淀30min； 离心回收沉淀，真空干燥后加适量ddH₂O回溶。

4、cDNA全长序列的获得

（1）NPR1中间片段的克隆

利用BLAST分析NCBI已经登录的NPR1氨基酸序列的保守区域，设计一对兼并引物NPR-5 （SEQ.ID.NO.3）和NPR-3（SEQ.ID.NO.4）用于扩增桑树NPR1中间片段。

反应体系如下：

反应程序如下：

反应结束后1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的片段，连入pMD18-T克隆 载体，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD18-T vector说明书进行。连接产物采用热激法 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含IPTG和X-gal的LB固体培养基（胰蛋白胨10g/L， 酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氨苄青霉素50mg/L，琼脂10g/L）上进行蓝白斑筛选培养， 挑取白色单菌落，PCR鉴定后，阳性克隆单菌落在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母 粉5g/L，氯化钠10g/L，氨苄青霉素50mg/L）中过夜培养，碱法小量提取质粒DNA，酶切 鉴定后进行序列测定。

（2）桑树NPR1的3'RACE

根据所克隆到的中间片段测序结果，设计引物3W（SEQ.ID.NO.5）和3N（SEQ.ID.NO. 6），分别与T15（SEQ.ID.NO.7）和ST（SEQ.ID.NO.8）作嵌套PCR，扩增桑树NPR1的3' 端。

反应体系如下：

反应条件为：

反应结束后用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的片段进行克隆测序。

（3）桑树NPR1的5'RACE

利用上述制备的cDNA的加尾产物为模板，根据已知的中间片段设计特异引物5W（SEQ. ID.NO.9）和5N（SEQ.ID.NO.10）与G16（SEQ.ID.NO.11）和GT（SEQ.ID.NO.12） 作嵌套PCR，扩增桑树NPR1的5'端。

反应体系如下：

反应条件为：

反应结束后用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的片段进行克隆测序。

（4）桑树NPR1cDNA编码区全长序列的获得

根据测序结果设计特异引物MuNPR-5（SEQ.ID.NO.13）和MuNPR-3（SEQ.ID.NO.14）， 扩增桑树NPR1基因cDNA编码区全长。

反应体系如下：

反应条件为：

反应结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的片段进行克隆测序。

5、同源检索：利用BLAST软件将分离出的全长cDNA序列与GenBank中的序列进行比 较。

实施方式（二）：桑树NPR1植物表达载体的构建

1、根据分离出的桑树NPR1基因的核苷酸序列，设计引物MuNPR-F（SEQ.ID.NO.15） 和MuNPR-R（SEQ.ID.NO.16）,以桑树叶片提取的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进 行PCR反应。

2、取PCR产物与pMD18-T Simple克隆载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态 细胞，氨苄青霉素（50mg/L）抗性筛选阳性克隆，菌液PCR鉴定后提取重组质粒DNA，酶 切鉴定后进行序列测定。

3、将经序列测定含有桑树NPR1基因正确片段的重组质粒用BamHⅠ和SacⅠ酶切，回收NPR1 基因片段与用相同的限制性内切酶酶切的pBI121表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，卡那霉素（50mg/L）抗性筛选阳性克隆，对选取的阳性克隆进行菌液PCR鉴 定和质粒DNA的酶切鉴定。

4、采用冻融法将构建好的桑树NPR1植物表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞，卡那霉 素（50mg/L）抗性筛选阳性克隆。

实施方式（三）：转基因桑树植株的获得

1、挑取农杆菌（携带重组质粒的农杆菌单菌落）接种于LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L， 酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素50mg/L）中，28℃，250rpm，振荡培养约48h 至对数生长后期；将菌液用MS培养液稀释10倍，备用。

2、取桑树无菌苗叶片，剪成小块（0.5×0.5cm），将剪好的桑树叶片置于MS预分 化培养基（MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.2mg/L）中，28℃，光照时间16h/d，光照强度2000 Lux，预培养2d。

3、将预培养后的桑树叶片侵入菌液2-10min，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入 MS基本培养基；弱光下，28℃共培养2d。

4、共培养后的外殖体先用含头孢青霉素250mg/L的无菌水洗涤3次，再用含头孢青 霉素250mg/L的MS培养液洗1次，然后用无菌滤纸吸干，转入含卡那霉素100mg/L，头 孢青霉素250mg/L的MS选择培养基（MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L+卡那霉素50mg/L+ 头孢青霉素250mg/L）上，28℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lux培养；每15d转 接一次。

5、待分化芽长至1cm左右时，切下分化芽转入MS生根培养基（MS+卡那霉素50mg/L， +头孢青霉素250mg/L）中，促其生根。

6、当分化苗长至5-6片叶，根系发育好后，移入盛有无菌土的花盆中，室温常规管理。

实施方式（四）：转基因桑树植株的PCR鉴定

1、采用CTAB法提取抗性植株及野生型植株的DNA。

2、根据35S启动子序列设计一对特异引物35S-5（SEQ.ID.NO.17）和35S-3（SEQ.ID. NO.18），分别以提取的抗性植株及野生型植株的DNA为模板，进行PCR，扩增35S启动子 序列。

反应体系如下：

反应条件为：

3、反应结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

通过琼脂糖凝胶电泳检测结果（图4）可以看出，抗性植株基因组DNA中均能扩增出一 条530bp左右的条带，而野生型植物基因组DNA未能扩增出该条带，表明我们已成功将 MuNPR1基因导入了桑树基因组中。

实施方式（五）：转基因桑树抗青枯病能力分析

1、挑取青枯病病原菌Rs-M07（Ralstonia solanacearum）接种于LB液体培养基（胰 蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L）中，30℃，180rpm，振荡培养约24h至对 数生长后期；将菌液用LB培养液稀释至10⁸CFU/mL，备用。

2、当转基因植株和野生型组培苗根系长度大约25mm左右时，移栽至直径为18cm的 花盆中，填充无菌土栽实，用无菌水浇灌至含土壤最大含水量的70%。

3、当植株生长正常后，选取大小一致的转基因和野生型植株进行试验。按照每100g± 12mL菌悬液(108CFU/mL)接种桑树青枯病病原菌，以无菌水处理为对照。放在26℃,相 对湿度为90%，光照时间12h/d，光照强度2000Lux条件下培养，期间适量浇灌无菌水。

4、培养至60d，检查植株发病率，测定植株高和鲜重。

通过转基因桑树抗青枯病能力分析（表1）看出，转基因桑树相对于非转基因桑树具有 明显的抗青枯病能力，具有很好的应用前景。

表1转基因桑树抗青枯病能力分析

实施方式（五）：转基因桑树抗炭疽病能力分析

1、挑取炭疽病菌株（Colletotrichum dematium）菌饼接种于PDA液体培养基（马铃 薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L）中，28℃恒温摇床振荡培养约6-7d至对数生长 后期；将培养液用PDA液体培养基稀释成孢子悬浮液(2.5×10⁶孢子/mL)，备用。

2、当转基因植株和野生型组培苗长至5-6片叶时，移栽至直径为18cm的花盆中，放 在26℃,相对湿度为90%，光照时间12h/d，光照强度2000Lux条件下培养，期间适量 浇灌水。

3、每株随机选取2片叶进行接菌试验。将直径大小约8mm的无菌滤纸浸放于C.dematium 孢子悬浮液中(2.5×10⁶孢子/mL)湿透，将滤纸放于所选叶片正面，然后用塑料袋套住接种 叶片保湿12h。将无菌滤纸浸湿无菌水进行相同处理为对照。放在26℃,相对湿度为90%， 光照时间12h/d，光照强度2000Lux条件下培养，期间适量浇灌无菌水。

4、培养至10d，测定试验叶片病斑直径大小和发病率。

通过转基因桑树抗炭疽病能力分析看出，转基因桑树相对于非转基因桑树具有明显的抗 炭疽病能力，具有很好的应用前景。

表2.转基因桑树抗炭疽病能力分析。