一种花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法

摘要

本发明公开了一种花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，通过收集花生不同生长时期的根际土壤，分别提取土壤基因组DNA，采用16SrRNA基因简并引物进行扩增，获得的PCR产物经均质化处理后纯化，用于构建16SrRNA基因文库，对得到的文库数据经分析比较，从而全面展示花生不同生长发育时期根际土壤的细菌群落结构。本发明能获知花生不同生长发育时期根际土壤共有的细菌类群以及优势类群，全面了解花生不同生长发育时期根际土壤细菌群落结构的差异，具有效率高、周期短、全面揭示根际土壤中具体细菌类群的优势。

说明书

技术领域

本发明涉及一种花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，属于土壤微生物与农作物栽培技术领域。

背景技术

土壤微生物参与了土壤中80-90%的循环过程，而土壤细菌是土壤微生物中丰度和多样性最高的类群，在有机质的降解、营养元素的循环、土壤有毒物质的积累和降解、土壤结构的形成等过程中起到非常重要的作用。根际（rhizosphere）是由植物根系与土壤微生物之间相互作用所形成的独特圈带，受植物根系活动的影响，在物理、化学和生物学性质上均不同于根部周围土体。该微域中的细菌与植物根系之间的相互作用更为紧密，根际细菌的群落结构与植物的生长发育密切相关。

花生是世界重要的油料作物和经济作物，其结果于地下的特点更增加了其根际环境的独特性。受限于目前绝大多数土壤细菌仍不可培养的现状，传统的培养方法不能够全面揭示花生根际土壤的细菌结构。由于根际土壤取样的特殊性以及土壤细菌相当高的多样性，目前仍缺少研究根际土壤细菌群落结构、明确细菌具体类群的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，以获知花生不同生长发育时期根际土壤共有的细菌类群以及优势类群，全面了解花生不同生长发育时期根际土壤细菌群落结构的差异。

为达到上述目的，本发明所采用的技术手段是：一种花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，通过收集花生不同生长时期的根际土壤，分别提取土壤基因组DNA，采用16S rRNA基因简并引物进行扩增，获得的PCR产物经均质化处理后纯化，用于构建16S rRNA基因文库，对得到的文库数据经分析比较，从而全面展示花生不同生长发育时期根际土壤的细菌群落结构。

作为优选，所述收集花生不同生长时期的根际土壤，其收集方法为：用无菌水将盆栽花生浇透，用铲子将整株花生植株铲出，大块土掉落后，收集附着在根部的土壤；整个操作过程要无菌操作，所用工具均用75%酒精消毒。

作为优选，所述收集花生不同生长时期的根际土壤，每个时期任意选择三株花生作为样本，所取三个土样充分混匀后用液氮速冻，冻存于-80℃冰箱保存备用。

作为优选，所述提取土壤基因组DNA，整个提取过程须保证无菌操作，所有环节均在冰上进行，所用试剂也要4℃预冷。

作为优选，所述采用16S rRNA基因简并引物进行扩增，所用引物为：

16S-F: 5’-AGNGTTTGATCMTGGCTCAG-3’N：A或G, M：A或C；

16S-R: 5’-GGGCGGWGTGTACAAGKCC-3’W：A 或T，K：G 或 C；

退火温度为55℃，扩增25个循环。

作为优选，所述采用简并引物进行扩增，所提基因组DNA作为PCR模板，首先设定浓度梯度，分别为0.1μl、0.25μl、0.5μl、1μl、和2μl，PCR扩增后选择最适浓度，重新扩增6管，每管25μl体系，均匀混合后纯化用于构建16S rRNA基因文库。

作为优选，所述对得到的文库数据分析比较，将所构建文库的所有阳性克隆进行测序，采用DOTUR程序分析每个文库中序列的分类单元，以3%的差异为标准，序列差异≤3%即作为一个分类单元。

作为优选，所述对得到的文库数据分析比较，采用OUT频率的log值，以2为底，作聚类分析，以减少PCR扩增的影响。

作为优选，所述对得到的文库数据分析比较，以系统分类为比较单元，从而减少数据库登记已知序列有限所带来的序列比对误差，而又尽可能地细化序列分类。

本发明的有益效果在于：本发明能获知花生不同生长发育时期根际土壤共有的细菌类群以及优势类群，全面了解花生不同生长发育时期根际土壤细菌群落结构的差异，具有效率高、周期短、全面揭示根际土壤中具体细菌类群的优势。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

一种花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，采取盆栽试验，在花生的整个生长周期选取苗期、花期、浆果期、收获期四个不同时期作为研究根际土壤细菌群落结构的时间点。每个时期均随机选择三株花生作为重复样本，分别收集三个样本的根际土壤，将三份土壤样品充分混匀后用液氮速冻，冻存于-80℃冰箱备用。取样过程要求无菌操作，所用工具均用75%酒精消毒。采用试剂盒提取土壤基因组DNA，整个提取过程保证无菌操作，所有环节均在冰上进行，所用试剂也要4℃预冷，以尽可能降低DNA的降解速度。选取最适模板浓度，采用16S rRNA基因简并引物进行扩增，获得的PCR产物经均质化处理后纯化用于构建16S rRNA基因文库。

作为优选，所述收集花生不同生长时期的根际土壤，每个时期任意选择三株花生作为样本，所取三个土样充分混匀后用液氮速冻，冻存于-80℃冰箱保存备用。

作为优选，所述提取土壤基因组DNA，整个提取过程须保证无菌操作，所有环节均在冰上进行，所用试剂也要4℃预冷。

作为优选，所述采用16S rRNA基因简并引物进行扩增，所用引物为：

16S-F: 5’-AGNGTTTGATCMTGGCTCAG-3’N：A或G, M：A或C；

16S-R: 5’-GGGCGGWGTGTACAAGKCC-3’W：A 或T，K：G 或 C；

退火温度为55℃，扩增25个循环。

作为优选，所述采用简并引物进行扩增，所提基因组DNA作为PCR模板，首先设定浓度梯度，分别为0.1μl、0. 25μl、0. 5μl l、1μl、和25μl，PCR扩增后选择最适浓度，重新扩增6管，每管25μl体系，均匀混合后纯化用于构建16S rRNA基因文库。

作为优选，所述对得到的文库数据分析比较，将所构建文库的所有阳性克隆进行测序，采用DOTUR程序分析每个文库中序列的分类单元，以3%的差异为标准，序列差异≤3%即作为一个分类单元。

作为优选，所述对得到的文库数据分析比较，采用OUT频率的log值，以2为底，作聚类分析，以减少PCR扩增的影响。

作为优选，所述对得到的文库数据分析比较，以系统分类为比较单元，从而减少数据库登记已知序列有限所带来的序列比对误差，而又尽可能地细化序列分类。

将所得的文库数据进行分析比较。所构建的四个16S rRNA基因文库，一共获得415个阳性克隆，鉴定出253个OTUs（其中7个为嵌合体）。聚类分析表明，四个时期的根际土壤细菌结构差异不大，浆果期和收获期的细菌结构更为相似。经比对分析，一共鉴定出21个与细菌相关的类群，其中酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、浮霉状菌门、蛋白菌门和疣微菌门在所有文库均为优势类群。具体到目，酸杆菌目、着色菌目、芽单胞菌目、黏球菌目和鞘脂单胞菌目、放线菌目、伯克氏菌目和假单胞菌目为四个生长发育时期共有的优势类群。伯克氏菌目和其中一支未知的γ-蛋白菌纲细菌的多样性和丰度在整个生长发育时期表现出明显减少趋势，而蛭弧菌目、绿弯菌目中的暖绳菌属、Solirubrobacterales和一支未知的δ-蛋白菌纲细菌的多样性和丰度则呈现出明显的增加趋势。

本发明包括但不限于以下实施方式，根据现有技术对本发明所进行的不脱离本发明实质内容的改变，仍属于本发明的保护范围。