白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件增强子及其应用

摘要

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件增强子及其应用，涉及文昌鱼Pax2/5/8基因。供白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件的增强子序列及其在白氏文昌鱼基因表达中的应用。所述白氏文昌鱼Pax2/5/8基因增强子可有效调控下游基因表达，可以用作对感兴趣的基因功能在不同时间和不同空间上的研究，也可以用来研究基因转录调控机制。将该增强子介导的目的基因整合到文昌鱼基因组中，建立转基因文昌鱼，即可对文昌鱼的不同发育时期或是不同部位的目的基因进行研究。

说明书

技术领域

本发明涉及文昌鱼Pax2/5/8基因，尤其是涉及白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件 增强子及其应用。

背景技术

文昌鱼（Amphioxus）隶属脊索动物门（Chordata）的头索动物亚门（Cephalochordata）， 它处于无脊椎动物进化到脊椎动物一个重要的过渡阶段，是现存生物中最类似于脊椎动物亚 门直接祖先的类群之一。因其独特的进化地位，且结构简单，身体半透明，基因组仅为人类 的1/6，呈现出基因倍增前脊椎动物祖先的基因组的特征，它是研究脊椎动物基因起源和基因 家族演化的理想模式生物。随着对文昌鱼的研究日益深入，佛罗里达文昌鱼（Branchiostoma  flloridae）和白氏文昌鱼（Branchiostoma belcheri）全基因组测序完成，尤其是文昌鱼实验室 连续繁殖和多次诱导产卵的成功，极大地推动了文昌鱼的模式化进程。在其他模式生物中成 功运用的生物技术，如siRNA干扰、morpholino、Talen基因敲除和细胞培养等同样在文昌鱼 中需要建立。作为一种新型的模式生物，研究其调控目的基因表达的分子工具（例如启动子、 增强子等）也是必不可少的，到目前为止，文昌鱼中已有几个启动子和增强子被报道：如FoxD 基因启动子(13、Yu,J.K.,Holland,N.D.,Holland,L.Z.,Tissue-specific expression of FoxD  reporter constructs in amphioxus embryos.Development Biology.2004.(274),452-461)、热休克蛋 白70基因的启动子(12、Li,D.,L.,Li,G.,Wang,K.,R.,Liu,X.,Li,W.Y.,Chen,X.,Wang,Y.Q. Isolation and functional analysis of the promoter of the amphioxus Hsp70a gene.Gene.2012.510 (1)39-46)、Engrailed基因增强子(14、Beaster-Jones,L.,Schubert,M.,Holland,L.Z.Cis-regulation  of the amphioxus engrailed gene:insights into evolution of a muscle-specific enhancer.Mech Dev. 2007.124(7-8)532-542)、ZNF503/703基因增强子(10、Holland,L.Z.,et.The amphioxus genome  illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.Genome Research.2008.18(7), 1100-1111)等。

在现有的几种模式生物中，已建立了一些调控基因表达系统，如四环素诱导系统(15、 Gossen,M.,and Bujard,H.,Anhydrotetracycline,a novel effector for the tetracycline controlled  gene expression systems in eukaryotic cells.Nucleic Acids Research,1993.21,4411–4412;16、 Huang,C.J.,Jou,T.S.,Ho,Y.L.,Lee,W.H.,Jeng,Y.T.,Hsieh,F.J.,Tsai,H.J.Conditional  expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.Developmental  Dynamics.2005.233,1294-1303)、Gal/UAS系统(17、Lewandoski,M.Conditional control of gene  expression in the mouse.Nature Reviews Genetics.2001.2(10),743-755;18、Zhan,H.Q.,Gong, Z.y.Delayed and restricted expression of UAS-regulated GFP gene in early transgenic zebrafish  embryos by using the GAL4/UAS system.Marine Biotechnology.2009.12(1),1-7)，或是开发一些 组织特异性的启动子或是增强子，如vasa基因启动子能使下游目的基因只在生殖细胞中表达 (19、Tanaka,M.,Kinoshita,M.,Kobayashi,D.,Nagahama,Y.Establishment of medaka(Oryzias  latipes)transgenic lines with the expression of green fluorescent protein fluorescence exclusively in  germ cells:a useful model to monitor germ cells in a live vertebrate.Proceedings of the National  Academy of Sciences.2001.98(5),2544-2549.)，肾细胞特异的钙粘着蛋白基因的启动子能引导 报告基因在肾脏和生殖泌尿道中特异表达(20、Shao,X.L.,Johson,J.E.,Richardson,J.A., Hiesberger,T.,Igarashi,P.,A minimal Ksp-Cadhe-rin promoter linked to a green fluorescent protein  reporter gene exhibits tissue-specific expression in the developing kidney and genitourinary tract. Journal of American.Sociology.2002.13,1824–1836)。同样文昌鱼作为一种新兴的模式动物，也 需建立这些调控基因表达系统。虽然在佛罗里达文昌鱼中已经成功克隆鉴定了Engrailed基因 增强子(14、Beaster-Jones,L.,Schubert,M.,Holland,L.Z.Cis-regulation of the amphioxus  engrailed gene:insights into evolution of a muscle-specific enhancer.Mech Dev.2007.124(7-8) 532-542)和ZNF503/703基因增强子(10、Holland,L.Z.,et.The amphioxus genome illuminates  vertebrate origins and cephalochordate biology.Genome Research.2008.18(7),1100-1111)，但是 在白氏文昌鱼中还没有关于组织特异性增强子的报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件增强子。

本发明的第二目的在于提供白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件增强子在调控白氏 文昌鱼基因表达中的应用。

所述白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件8增强子的核苷酸序列为：

acgatgaaag gaatgcctct acctgtggat cgcatgaaaa tctgggattc cgaggaaaat 60

gaaggtggga atatgggcgt agtttatttc cctaattctg a                     120

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件15增强子的核苷酸序列为：

aaggttgtca tcctgaagtt aagtagcagt atccaacatt ttccgaaaag aactttagag 60

gttcattgga gatgaccaga ttctttgatg tccgtttgaa gtagccctct ggtgcgaggc 120

tgtagccgac ctgctggaca ccgccaatgg tcagttcaat cagcttctgc aatctttcta 180

gcatcgccat taagctttca gctcttatat acacgtaaaa cgttcaaact aaaagcatta 240

tttttctaac tagaaaacta ttttctcgac agagttctga acaaattatg cagatatttt 300

atgtccacgt ttttatctga tatgaagcaa caatgtttga agtgataaaa atttctcctg 360

gcattttttt tcactcaatt ttaataggat tttaacgtgc tataagataa catcac     416

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件17增强子的核苷酸序列为：

ctttcgcgat gtaaacaaaa caagtgtgcg ttgagacatg atcaatacat tgcacaaccc 60

ggttcaatgt ctggctagtc tgtccacagc aggcacttgc cgtccgccca gttaccagtg 120

acatgactga tagcctccac acaggttaag atagcccact gcttgttcct ggtcgaagat 180

cagatcttgt tctactggca tcagcagtca aaataggcca atatagaggg ggtcgcggtg 240

gtaatcggta ggtctttgcc ggggggttca aaaaacaccc ttatcgcccg gacagttaca 300

aatggttcga gtctgcccta ctctgaacc                                   329

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件19增强子的核苷酸序列为：

tgtgtcttcg actctgtcta taacatagcc gtacactcag taacacttag tacatatgta 60

gtagtgcaac aagatagtgt ggtaact                                     87

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件20增强子的核苷酸序列为：

tagctcagta cttcttgaaa gtaccaagtt gaagataacg aggtcagacc gtgaattaag 60

aaatcttagt tagacttgga gccgcggaga cttccgactg gggcgttgtg atcacatcat 120

atttttctca gcggattcat aagtcgtctc tctttgatcc acttatctca gaagtctatt 180

tctctcct                                                          188

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件24增强子的核苷酸序列为：

gaataacttt gacgcctact cgtctaaaca cagttgatat catcttgcca taaaatctga 60

taaagcctaa actttaaaat gtctaaacgg attaacacta acaatggctt tatcaaattc 120

ctaaacacat gattccatac acatcacaaa taccctccgt ctcttgaggc aatgatattt 180

ttgcagaagg atacaagcgc caggtattaa acttacctgc tcctttcgcg gtcgtcctca 240

caccccgaca gttcccgtag tttgtatatg tgtatgcgac aaactctact ggaacgtaca 300

acacagcccc gccaacgcgt aatgtcgtcg accacctaaa caatcgctga gt         352

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件44增强子的核苷酸序列为：

caagtttgaa atcattttag acccatgttt aacagcagaa aaagttcctc ttgtatgcga 60

aattcccaga catacgcaga tagcagcaaa aagcagagga tgctttagga tgttatgact 120

tgtcgtcatt tcatgttgtg ttttgtgtgt acctggccgg ccagtaccaa tgtaaacagt 180

cagcaaattc agttgtggac gtcgcaggca gaattccctt tgaagccgtg tgtacccaaa 240

acaattctaa cc                                                     252

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件49增强子的核苷酸序列为：

gtcgtcgcag ttgaccactg aagccttgag caggctatca gtatcagtaa ccaagaactc 60

gcggcataaa ccagaaagaa ctctcaagaa accgcacacc gtttgtctct ttcctcggtc 120

ttaacttttc cgt                                                    133

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件61增强子的核苷酸序列为：

tccgcctgtt ctgacttaac aagatctaaa tgagttttta ccagctattt ccatccagcg 60

gcagcacaat aggtcagcgt accctactag gctgatgctg gcgccgctat gaaatttctc 120

attttggtgc t                                                      131

本发明所述白氏文昌鱼Pax2/5/8基因增强子可有效调控下游靶基因表达，它们可以用作 对感兴趣的基因功能在不同时间上，不同空间上的研究，也可以用来研究基因转绿调控机制。 将该增强子介导的目的基因整合到文昌鱼基因组中，建立转基因文昌鱼，即可对文昌鱼的不 同发育时期或是不同部位的目的基因进行研究。由此可见，白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码 保守元件的增强子可用于调控白氏文昌鱼基因的表达。

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件为白氏文昌鱼内源性的增强子，可以方便地应用 于基因功能以及转录调控元件的研究。本发明成功克隆了文昌鱼Pax2/5/8基因相关的非编码保 守元件8,15,17,19,20,24,29,44,49,61，并将该片段载入带有LacZ基因的报告载体，在文昌 鱼胚胎进行功能检验，已证明除了非编码保守元件29之外，其他的非编码保守元件都具有增 强子的活性。可作为调控文昌鱼基因时空表达的分子开关和转录调控元件功能的分子工具。

本发明利用生物信息学和显微注射技术鉴定了Pax2/5/8基因的增强子。这些组织特异性 的增强子可用于转基因文昌鱼以及文昌鱼中基因调控表达的研究。

组织特异性的增强子在转基因斑马鱼、小鼠等模式动物中都得到很好的应用，由于文昌 鱼转基因研究目前还是空白，如果从文昌鱼中克隆获得的增强子比来自其他物种的要更适合 用于文昌鱼的科学研究中。为此，本发明进行了文昌鱼组织特异性增强子鉴定和克隆研究， 成功地克隆到9个文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件，这些保守元件在文昌鱼和斑马鱼胚胎 发育中得到验证，它们具有组织特异性增强子的功能，并且具与Actin的最小启动子组合后有 很高的表达活性，可作为调控文昌鱼基因时空表达的分子开关，也可以用来研究基因转录调 控机制。

附图说明

图1为白氏文昌鱼Pax2/5/8基因在早期神经胚的原位杂交图。在图1中，箭头表示在神 经板处表达。标尺为50μm。

图2为白氏文昌鱼Pax2/5/8基因在中期神经胚的原位杂交图。在图2中，cv：脑泡（cerebral  vesicle），单箭头表示在肾管雏形表达，ph：咽区（pharynx），双箭头表示在咽鳃裂雏形表达。 标尺为50μm。

图3为白氏文昌鱼Pax2/5/8基因在开口前幼体的原位杂交图。在图3中，hd：将来形成 口前窝的地方（Hatschek’s left diverticulum），长箭头表示第一鳃裂，短箭头表示第二鳃裂。 标尺为50μm。

图4为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件8在文昌鱼胚胎中的表达模式图。

图5为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件8在文昌鱼胚胎中各个组织的表达百分率。 Nt:神经管（Nerve cord）,Gsr:鳃裂雏形（Gill slit rudiments）,S:体节（Somite）,P:咽区 （Pharynx）,No:脊索（Notochord）,Ne:肾管雏形（Nephridium rudiments）,Ee:表皮外胚 层（Epithelia ectoderm）,Cv:脑泡（Cerebral vesicle）,Ec:异位表达（Ectopic expression）。

图6为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件8在文昌鱼胚胎中表达谱的代表图。标尺为 50μm。

图7为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件15在文昌鱼胚胎中的表达模式图。

图8为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件15在文昌鱼胚胎中各个组织的表达百分率。 Nt:神经管（Nerve cord）,Gsr:鳃裂雏形（Gill slit rudiments）,S:体节（Somite）,P:咽区 （Pharynx）,No:脊索（Notochord）,Ne:肾管雏形（Nephridium rudiments）,Ee:表皮外胚 层（Epithelia ectoderm）,Cv:脑泡（Cerebral vesicle）,Ec:异位表达（Ectopic expression）。

图9为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件15在文昌鱼胚胎中表达谱的代表图。右下角 的小图是这个文昌鱼胚胎的背面观。标尺为50μm。

图10为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件17在文昌鱼胚胎中的表达模式图。

图11为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件17在文昌鱼胚胎中各个组织的表达百分率。 Nt:神经管（Nerve cord）,Gsr:鳃裂雏形（Gill slit rudiments）,S:体节（Somite）,P:咽区 （Pharynx）,No:脊索（Notochord）,Ne:肾管雏形（Nephridium rudiments）,Ee:表皮外胚 层（Epithelia ectoderm）,Cv:脑泡（Cerebral vesicle）,Ec:异位表达（Ectopic expression）。

图12为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件17在文昌鱼胚胎中表达谱的代表图。右下 角的小图是这个文昌鱼胚胎的背面观。标尺为50μm。

图13为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件19在文昌鱼胚胎中的表达模式图。

图14为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件19在文昌鱼胚胎中各个组织的表达百分率。 Nt:神经管（Nerve cord）,Gsr:鳃裂雏形（Gill slit rudiments）,S:体节（Somite）,P:咽区 （Pharynx）,No:脊索（Notochord）,Ne:肾管雏形（Nephridium rudiments）,Ee:表皮外胚 层（Epithelia ectoderm）,Cv:脑泡（Cerebral vesicle）,Ec:异位表达（Ectopic expression）。

图15为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件19在文昌鱼胚胎中表达谱的代表图。标尺 为50μm。

图16为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件20在文昌鱼胚胎中的表达模式图。

图17为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件20在文昌鱼胚胎中各个组织的表达百分率。 Nt:神经管（Nerve cord）,Gsr:鳃裂雏形（Gill slit rudiments）,S:体节（Somite）,P:咽区 （Pharynx）,No:脊索（Notochord）,Ne:肾管雏形（Nephridium rudiments）,Ee:表皮外胚 层（Epithelia ectoderm）,Cv:脑泡（Cerebral vesicle）,Ec:异位表达（Ectopic expression）。

图18为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件20在文昌鱼胚胎中表达谱的代表图。标尺 为50μm。

图19为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件24在文昌鱼胚胎中的表达模式图。

图20为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件24在文昌鱼胚胎中各个组织的表达百分率。 Nt:神经管（Nerve cord）,Gsr:鳃裂雏形（Gill slit rudiments）,S:体节（Somite）,P:咽区 （Pharynx）,No:脊索（Notochord）,Ne:肾管雏形（Nephridium rudiments）,Ee:表皮外胚 层（Epithelia ectoderm）,Cv:脑泡（Cerebral vesicle）,Ec:异位表达（Ectopic expression）。

图21为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件24在文昌鱼胚胎中表达谱的代表图。标尺 为50μm。

图22为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件44在文昌鱼胚胎中的表达模式图。

图23为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件44在文昌鱼胚胎中各个组织的表达百分率。 Nt:神经管（Nerve cord）,Gsr:鳃裂雏形（Gill slit rudiments）,S:体节（Somite）,P:咽区 （Pharynx）,No:脊索（Notochord）,Ne:肾管雏形（Nephridium rudiments）,Ee:表皮外胚 层（Epithelia ectoderm）,Cv:脑泡（Cerebral vesicle）,Ec:异位表达（Ectopic expression）。

图24为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件44在文昌鱼胚胎中表达谱的代表图。标尺 为50μm。

图25为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件49在文昌鱼胚胎中的表达模式图。

图26为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件49在文昌鱼胚胎中各个组织的表达百分率。 Nt:神经管（Nerve cord）,Gsr:鳃裂雏形（Gill slit rudiments）,S:体节（Somite）,P:咽区 （Pharynx）,No:脊索（Notochord）,Ne:肾管雏形（Nephridium rudiments）,Ee:表皮外胚 层（Epithelia ectoderm）,Cv:脑泡（Cerebral vesicle）,Ec:异位表达（Ectopic expression）。

图27为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件49在文昌鱼胚胎中表达谱的代表图。标尺 为50μm。

图28为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件61在文昌鱼胚胎中的表达模式图。

图29为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件61在文昌鱼胚胎中各个组织的表达百分率。 Nt:神经管（Nerve cord）,Gsr:鳃裂雏形（Gill slit rudiments）,S:体节（Somite）,P:咽区 （Pharynx）,No:脊索（Notochord）,Ne:肾管雏形（Nephridium rudiments）,Ee:表皮外胚 层（Epithelia ectoderm）,Cv:脑泡（Cerebral vesicle）,Ec:异位表达（Ectopic expression）。

图30为文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件61在文昌鱼胚胎中表达谱的代表图。标尺 为50μm。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件(CNEs,conserved non-coding elements) 的鉴定

研究表明，基因组中的非编码保守元件通常具有增强子的功能（21、Woolfe,A.Goodson, M.Goode,D.K.Snell,P.McEwen,G.K.Vavouri,T.Smith,S.F.North,P.Callaway,H.Kelly,K. Walter,K.Abnizova,I.Gilks,W.Edwards,Y.J.Cooke,J.E.Elgar,G.Highly conserved  non-coding sequences are associated with vertebrate development.PloS Biol.2005.3(1):e7；22、 Ochi,H.Tamai,T.Nagano,H.Kawaguchi,A.Sudou,N.Ogino,H.Evolution of a tissue-specific  silencer underlies divergence in the expression of pax2and pax8paralogues.Nat Commun.2012.3: 848.）。本发明用MLAGAN软件(http://www.ensembl.org/index.html)对后口动物代表类群:人、 小鼠、非洲爪蟾、鸡、河豚、刺鱼、白氏文昌鱼、玻璃海鞘和海胆的Pax2/5/8基因以及与其 上下游基因间隔区的DNA序列比对（23、Mayor,C.Brudno,M.Schwartz,J.R.Poliakov,A. Rubin,E.M.Frazer,K.A.Pachter,L.S.Dubchak,I.2000.VISTA:visualizing global DNA  sequence alignments of arbitrary length.Bioinformatics16(11):1046-1047），找到了文昌鱼中的 非编码保守元件。接着，本发明验证了文昌鱼中10个非编码保守元件的功能，发现有9个具 有增强子功能。

所得白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件8的核苷酸序列为：

acgatgaaag gaatgcctct acctgtggat cgcatgaaaa tctgggattc cgaggaaaat 60

gaaggtggga atatgggcgt agtttatttc cctaattctg a                     120

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件15的核苷酸序列为：

aaggttgtca tcctgaagtt aagtagcagt atccaacatt ttccgaaaag aactttagag 60

gttcattgga gatgaccaga ttctttgatg tccgtttgaa gtagccctct ggtgcgaggc 120

tgtagccgac ctgctggaca ccgccaatgg tcagttcaat cagcttctgc aatctttcta 180

gcatcgccat taagctttca gctcttatat acacgtaaaa cgttcaaact aaaagcatta 240

tttttctaac tagaaaacta ttttctcgac agagttctga acaaattatg cagatatttt 300

atgtccacgt ttttatctga tatgaagcaa caatgtttga agtgataaaa atttctcctg 360

gcattttttt tcactcaatt ttaataggat tttaacgtgc tataagataa catcac     416

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件17的核苷酸序列为：

ctttcgcgat gtaaacaaaa caagtgtgcg ttgagacatg atcaatacat tgcacaaccc 60

ggttcaatgt ctggctagtc tgtccacagc aggcacttgc cgtccgccca gttaccagtg 120

acatgactga tagcctccac acaggttaag atagcccact gcttgttcct ggtcgaagat 180

cagatcttgt tctactggca tcagcagtca aaataggcca atatagaggg ggtcgcggtg 240

gtaatcggta ggtctttgcc ggggggttca aaaaacaccc ttatcgcccg gacagttaca 300

aatggttcga gtctgcccta ctctgaacc                                   329

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件19的核苷酸序列为：

tgtgtcttcg actctgtcta taacatagcc gtacactcag taacacttag tacatatgta 60

gtagtgcaac aagatagtgt ggtaact                                     87

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件20的核苷酸序列为：

tagctcagta cttcttgaaa gtaccaagtt gaagataacg aggtcagacc gtgaattaag 60

aaatcttagt tagacttgga gccgcggaga cttccgactg gggcgttgtg atcacatcat 120

atttttctca gcggattcat aagtcgtctc tctttgatcc acttatctca gaagtctatt 180

tctctcct                                                          188

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件24的核苷酸序列为：

gaataacttt gacgcctact cgtctaaaca cagttgatat catcttgcca taaaatctga 60

taaagcctaa actttaaaat gtctaaacgg attaacacta acaatggctt tatcaaattc 120

ctaaacacat gattccatac acatcacaaa taccctccgt ctcttgaggc aatgatattt 180

ttgcagaagg atacaagcgc caggtattaa acttacctgc tcctttcgcg gtcgtcctca 240

caccccgaca gttcccgtag tttgtatatg tgtatgcgac aaactctact ggaacgtaca 300

acacagcccc gccaacgcgt aatgtcgtcg accacctaaa caatcgctga gt         352

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件29的核苷酸序列为：

tcgtgctgtc gtgcacctgg atcctcccgt tttgcggcaa tggtttcccc attggtttcg 60

ccctaacctt tccagttgga caagtcggtg ccgctgactg t                     101

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件44的核苷酸序列为：

caagtttgaa atcattttag acccatgttt aacagcagaa aaagttcctc ttgtatgcga 60

aattcccaga catacgcaga tagcagcaaa aagcagagga tgctttagga tgttatgact 120

tgtcgtcatt tcatgttgtg ttttgtgtgt acctggccgg ccagtaccaa tgtaaacagt 180

cagcaaattc agttgtggac gtcgcaggca gaattccctt tgaagccgtg tgtacccaaa 240

acaattctaa cc                                                     252

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件49的核苷酸序列为：

gtcgtcgcag ttgaccactg aagccttgag caggctatca gtatcagtaa ccaagaactc 60

gcggcataaa ccagaaagaa ctctcaagaa accgcacacc gtttgtctct ttcctcggtc 120

ttaacttttc cgt                                                    133

白氏文昌鱼Pax2/5/8基因非编码保守元件61的核苷酸序列为：

tccgcctgtt ctgacttaac aagatctaaa tgagttttta ccagctattt ccatccagcg 60

gcagcacaat aggtcagcgt accctactag gctgatgctg gcgccgctat gaaatttctc 120

attttggtgc t                                                      131

实施例2白氏文昌鱼增强子功能检测

1、构建重组表达质粒

本发明设计特异引物将10个非编码保守元件以及2个对照序列从白氏文昌鱼的基因组中 PCR扩增出来，PCR产物经XhoⅠ,HindⅢ双酶切处理，分别转入经同样双酶切处理的129bp LacZ（该载体带有一个129bp的文昌鱼Actin基因的最小启动子）载体中，转化DH5α菌株， 经PCR及酶切鉴定得到阳性克隆后测序验证。

2、显微注射文昌鱼胚胎

将重组质粒在文昌鱼的胚胎发育中验证。

注射文昌鱼未受精卵，每个未受精卵注射量约为1-2pl，注射的重组质粒浓度约为100 ng/μl。可以发现增强子Pax2-8，17，49是神经管，体节和脊索的增强子（参见图4～6，10～12， 25～27），增强子Pax2-15，44是神经管，鳃裂雏形的增强子（参见图7～9，22～24），增强子 Pax2-19，61是神经管，鳃裂雏形，体节和脊索的增强子（参见图13～15，28～30），增强子 Pax2-20是神经管和体节的增强子（参见图16～18），增强子Pax2-24是体节的特异性增强子 （参见图19～21）。

表1

表1给出不同重组质粒和对照在文昌鱼胚胎表达数据统计。