一种真核浮游植物多样性的快速高通量检测方法

摘要

本发明公开了一种真核浮游植物多样性的快速高通量检测方法，具体包括：采集浮游植物样品；提取浮游植物基因组总DNA；18SrDNA可变区V9区的PCR扩增及优化；利用Illumina测序平台快速测定样品并对数据进行分析。本发明利用通用引物扩增18SrDNA可变区V9后，进行高通量测序，再对操作分类单元OTU进行分类，实现对环境样品中真核浮游植物多样性的分析。在引物设计时引入barcode序列，可同时对多个样品进行区分，大大节约了测序时间和成本。此外，本发明所述技术方案建库时间短（仅1天），因此可快速、高效地实现大量真核浮游植物样品的多样性分析。

说明书

技术领域

本发明涉及真核浮游植物分类及其组成结构的技术领域，尤其涉及一种真核浮游植物多样性的快速高通量检测方法。

背景技术

浮游植物（phytoplankton），是指在水中营浮游生活的微小植物，它广泛存在于河流、湖泊和海洋中。浮游植物结构简单、类群多样、生长周期短，他们是水域中最重要的初级生产者，是水中溶解氧的主要供应者，同时也是固碳固氮的重要生物，因此在水域的能量流动、物质循环和信息传递中起着至关重要的作用。

浮游植物通常是指浮游藻类，包括蓝藻门（Cyanophyta）、绿藻门（Chlorophyta）、硅藻门（Bacillariophyta）、金藻门（Chrysophyta）、黄藻门（Xanthophyta）、甲藻门（Pyrrophyta）、隐藻门（Cryptophyta）和裸藻门（Euglenophyta）八个门类。根据其粒径大小可以分为：小型浮游植物（20~200 μm）、微型浮游植物（2~20 μm）和超微型浮游植物（0.2~2 μm）。

浮游植物多样性分析的方法，主要包括基于形态学研究的方法、基于核酸分析的方法、基于色素分析的方法、基于表观和固有光谱的方法以及基于荧光光谱的方法。近年来，基于核酸分析的方法因PCR、DNA测序、生物信息学等分子生物学技术的成熟而逐渐成为分类学中鉴定物种的有效方法。目前用于浮游植物多样性分析的基因主要是核糖体基因（rDNA），二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因（rbcL）、细胞色素C氧化酶第1亚基基因（cox1）等。其中18S rDNA基因存在于所有真核生物中，结构和功能保守，被广泛应用于进化、分类等研究。18S rDNA基因中的可变区域V9序列变异较大，且序列较短，易于扩增和测序，在分类学研究中具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供了一种真核浮游植物多样性的快速高通量检测方法，具体利用高通量测序技术对环境中真核浮游植物多样性进行快速、准确、高效的分析。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种真核浮游植物多样性的快速高通量检测方法，它包括以下步骤：

（1）采集浮游植物样品；

（2）提取浮游植物基因组总DNA；

（3）18S rDNA可变区V9区的PCR扩增及优化：

18S rDNA可变区V9正向引物V9F：5'磷酸化-CCCTGCC(A/T/C)TTTGTACACAC-3';

18S rDNA可变区V9反向引物V9R：5'磷酸化-CCTTC(C/T)GCAGGTTCACCTAC-3';

PCR扩增体系：总体系为40 μl，包括1×Phusion HF Buffer、0.2 mM dNTPs、0.5 μM引物V9F、0.5 μM引物V9R、0.625-2.5 ng/μl基因组总DNA、0.8 U Phusion超保真 DNA 聚合酶；

PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s、53-58℃退火30s、72℃延伸20s ，16-25个循环；最后72℃延伸10 min；

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，然后在凝胶成像系统中进行分析；

（4）Illumina测序平台上机样品的制备：

a、纯化步骤（3）所得的PCR产物；

b、PCR产物末端加A，进行PCR：32 μl反应体系中包括：步骤a纯化后的产物500 ng、2 U Taq酶、0.2 mM dATP、1×Taq Buffer、1.4 mM MgCl₂，72℃反应20 min；

c、纯化步骤b的PCR反应产物；

d、接头连接：

接头序列: Adapter-1：5'磷酸化-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3'；

接头序列: Adapter-2：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；

20μl反应体系包括：步骤c纯化后产物12 μl、1.5 μM接头、1×Quick Ligation Buffer和2 μl Quick T4 DNA连接酶（NEB），20℃反应30 min；

e、PCR引入barcode序列:

Primer-1：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；

Primer-2：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'；

Index Primer序列：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3'；

40μl反应体系中包括：步骤d的连接产物2 μl、1×Phusion HF Buffer、0.2 mM dNTPs、0.5 μM Primer-1、0.01 μM Primer-2、0.5 μM Index Primer、0.8 U Phusion超保真 DNA 聚合酶；

PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s、65℃退火30s、72℃延伸20s ，10-20个循环；最后72℃延伸10 min；

f、回收步骤e所得PCR产物；

（5）采用Illumina测序平台对所得产物进行双末端100bp测序；

（6）数据分析。

进一步的，所述步骤（1）中先采用20 μm微孔滤膜过滤，再用2 μm微孔滤膜过滤收集微型浮游植物。

进一步的，所述步骤（3）中PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压100V、时间25 min，浸入2%的溴化乙锭中染色10 min，然后在凝胶成像系统中进行分析。

进一步的，所述步骤（3）中PCR扩增体系中1.25 ng/μl为最适模板浓度。

进一步的，所述步骤（3）中PCR反应条件中20个循环为最适循环数。

进一步的，所述步骤（3）中PCR反应条件中55℃为最适退火温度。

进一步的，所述步骤（4）中e步骤PCR反应条件中15个循环为最适循环数。

进一步的，所述步骤（4）中c中将PCR产物溶于pH 8.5的10 mM Tris-Cl。

进一步的，所述步骤（4）e步骤中NNNNNN代表可变碱基，根据不同的Barcode序列改变。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明开发了基于高通量测序技术的快速检测环境样品中真核浮游植物多样性的方法，利用通用引物扩增18S rDNA可变区V9后，进行高通量测序，再对操作分类单元OTU(operational taxonomic units)进行分类，实现对环境样品中真核浮游植物多样性的分析。该技术在引物设计时引入barcode序列，可同时对多个样品进行区分，大大节约了测序时间和成本。此外，本发明所述技术方案建库时间短（仅1天），因此可快速、高效地实现大量真核浮游植物样品的多样性分析。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明18S rDNA可变区V9 PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测结果，泳道M为DNA分子量标准Marker（DL2000）；泳道1为18S rDNA可变区V9的PCR扩增产物，大小约为180bp。

图2是本发明为18S rDNA可变区V9 Illumina测序样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，泳道M为DNA分子量标准Marker（100bp Ladder），泳道1-4为制备的18S rDNA可变区V9的Illumina测序样品，产物大小约为300bp。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

下面以秦皇岛海域中微型真核浮游植物环境样品为例详细叙述本发明：

1、样品的采集：

（1）利用采水器于海域（本实施例以秦皇岛海域为例进行说明）采取足量表层新鲜海水；

（2）采用20 μm微孔滤膜过滤去除大于20 μm的浮游植物后，用2 μm微孔滤膜过滤收集微型浮游植物；

（3）将滤膜用硫酸纸包好，注明采样日期、地点、滤膜孔径，液氮保存、干冰运输。

2、微型浮游植物总DNA提取：

取含有微型浮游植物的滤膜于1.5 ml离心管中，加入600 μl CTAB缓冲液(2%CTAB；100 mM Tris-Cl pH8.0；1.4 mM NaCl；10 mM EDTA)和12 μl β-巯基乙醇，65℃水浴1h。取出滤膜，用酚氯仿抽提2次后，加入两倍体积无水乙醇沉淀DNA，70%乙醇清洗沉淀，加入RNaseA 37℃处理30 min后，得到微型浮游植物基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测并测定DNA浓度，4℃冰箱保存备用。

3、18S rDNA可变区V9的PCR扩增：

（1）利用真核生物通用引物V9F/V9R，扩增18S rDNA可变区V9， 

18S rDNA可变区V9正向引物V9F：5'磷酸化-CCCTGCC(A/T/C)TTTGTACACAC-3';

18S rDNA可变区V9反向引物V9R：5'磷酸化-CCTTC(C/T)GCAGGTTCACCTAC-3';

所述5'磷酸化为引物5'端碱基进行磷酸化。

PCR扩增体系：总体系为40 μl，包括1×Phusion HF Buffer、0.2 mM dNTPs、0.5 μM引物V9F、0.5 μM引物V9R、1.25 ng/μl基因组DNA、0.8 U Phusion超保真 DNA 聚合酶（NEB）；

（2）PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s、55℃退火30s、72℃延伸20s，20个循环；最后72℃延伸10 min；

（3）1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图1所示，电压100V、时间25 min，浸入2%的溴化乙锭中染色10 min，然后在凝胶成像系统中进行分析。

（4）PCR反应循环数的优化：固定PCR的其它反应条件，调节PCR的循环数（16、18、20、22、25），琼脂糖凝胶电泳检测确定20个循环为最适循环数。

（5）PCR反应体系中起始模板浓度的优化：固定PCR的其它反应条件，梯度变化起始模板量（终浓度0.625、1.25、2.5 ng/μl），琼脂糖凝胶电泳检测确定1.25 ng/μl为最适模板浓度。

（6）PCR反应退火温度的优化：固定PCR的其它反应条件，梯度变化退火温度（53、53.9、55、56.2、57.3℃），琼脂糖凝胶电泳检测确定55℃为最适退火温度。

4、Illumina测序平台上机样品的制备：

（1）利用QIAGEN PCR产物纯化试剂盒纯化步骤3所得的PCR产物，测定纯化后产物浓度，同时琼脂糖凝胶电泳检测；

（2）PCR产物末端加A：32 μl反应体系中包括：步骤（1）纯化后的产物500 ng、2 U Taq酶、0.2 mM dATP、1×Taq Buffer、1.4 mM MgCl₂，72℃反应20 min；

（3）利用MinElute PCR产物纯化试剂盒纯化步骤（2）反应产物，溶于13 μl Buffer EB (10 mM Tris-Cl，pH 8.5)；

（4）接头连接： 

接头序列: Adapter-1：5'磷酸化-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3'；

接头序列: Adapter-2：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；

20μl反应体系包括：步骤（3）纯化后产物12 μl、1.5 μM接头、1×Quick Ligation Buffer和2 μl Quick T4 DNA连接酶（NEB），20℃反应30 min；

（5）PCR引入barcode序列：

Primer-1：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；

Primer-2：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'；

Index Primer序列：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3'（其中NNNNNN代表可变碱基，可根据不同的Barcode序列改变）；

40μl反应体系中包括：步骤（4）的连接产物2 μl、1×Phusion HF Buffer、0.2 mM dNTPs、0.5 μM Primer-1、0.01 μM Primer-2、0.5 μM Index Primer、0.8 U Phusion超保真 DNA 聚合酶（NEB）；

PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s、65℃退火30s、72℃延伸20s，15个循环；最后72℃延伸10 min；

PCR反应循环数的优化：固定PCR的其它反应条件，调节循环数（10、12、15、18、20），琼脂糖凝胶电泳检测确定15个循环为最适循环数；

（6）将步骤（5）所得PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，时间35 min；切胶，用MinElute琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物；

（7）1.5%琼脂糖凝胶电泳和8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤（6）所得产物，如图2所示，并测定产物浓度。

5、采用Hiseq2000对所得产物进行双末端100bp测序。

6、数据分析：本实验测序后得到540,732条原始reads，利用生物信息学软件，首先对原始数据进行拼接，得到V9区全长序列；然后对序列进行质量过滤得到464,208条高质量的reads；聚类得到2,590个高质量的操作分类单元OUT；将每个分类单元和数据库进行比对，得到每个分类单元的详细分类信息；最后对各个分类信息进行统计，得出该样品的藻类主要由绿藻门、甲藻门、硅藻门组成，并得到各个门类所包含藻类的详细信息。

表1本发明涉及到的接头和引物：

接头及引物名称接头及引物序列V9F5'磷酸化-CCCTGCC(A/T/C)TTTGTACACAC-3'V9R5'磷酸化-CCTTC(C/T)GCAGGTTCACCTAC-3'Adapter-15'磷酸化-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3'Adapter-25'- ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'Primer-15'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT -3'Primer-25'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'Index Primer5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3'

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。