基于Sant-75结构的化合物

摘要

本发明涉及一种基于Sant-75结构的化合物，通过对Sant-75的结构进行修饰，提供至少一种具有更好生物学活性的基于Sant-75结构的化合物，其结构式可以为：其中，-R1为-H、-F或-Cl；-R2为-H、-F或-OH；-R3为-H、-F、-Cl、-OH、-NO2、-NH2、-Me、-SO2Me、-CO2Me、-CO2H、-NHAc或-NHSO2Me；-R4为-H、-F、-Cl或-SO2Me；并且-R1、-R2、-R3和-R4不同时为-H。上述基于Sant-75结构的化合物，通过对Sant-75进行系统的结构修饰，相对于Sant-75，其作为七次穿膜蛋白抑制剂的生物学活性较高。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白抑制剂，特别是涉及一种基于Sant-75结构的化合物。

背景技术

七次穿膜蛋白(Smoothened，Smo)是Hedgehog(Hh)信号通路中的一个重要 组分。Hh信号通路参与正常的动物发育以及恶性肿瘤的发生，对后生动物的胚 胎和成体组织的动态平衡也必不可少。Hh信号通路包括四个主要组分：Hh配 体，十二次穿膜蛋白受体Patched1(Ptch1)，七次穿膜蛋白受体Smo和Gli家族 的转录因子。Hh配体通过结合Ptch1来激活Hh信号通路，在非结合的状态， Ptch1受体抑制了下游七次穿膜蛋白受体Smo的活性；而Hh配体和Ptch1受体 的结合减轻了这种抑制作用，最终激活了Gli家族转录因子并移位到细胞核内， 引起靶基因的表达从而导致细胞的增值和分化。

Hh信号通路在正常的胚胎发生中调节细胞增殖和分化，由于其在调节细胞 命运和增殖方面的关键作用，过度激活的Hh通路参与了一些恶性肿瘤和癌症的 发生。基底细胞癌(Basal cell carcinoma，BCC)是西方国家最为普遍的癌症之 一，Ptch1和Smo的突变参与了其发生。在脑的发育中，Hh是小脑颗粒神经元 祖细胞(cerebellar granule neuron progenitors)的有丝分裂原，并在出生后的发 育中被下调。相比之下，大于30％的人成神经管细胞瘤显现出Gli1的高表达。 在人成神经管细胞瘤中也发现Ptch1和Smo的突变。

除了在胚胎发生中的作用，Hh信号通路也参与诸如血管发生和胰腺的器官 发生。在斑马鱼和小鼠中的研究表明，Hh的缺陷会导致血管结构的丧失。而Shh 缺陷小鼠会出现肺部脉管系统形成异常和支气管减少的表型。缺少Hh信号的斑 马鱼胚胎表现出初级节间血管出芽缺陷。Shh似乎可以通过调节血管生成素1， -2和VEGF的mRNA的水平来促进血管成熟。Hh信号通路也在肿瘤相关血管 发生中起重要作用。

近年来的研究还表明，异常的Hh信号还和许多其它恶性肿瘤的发生相关， 比如：小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌和骨髓瘤等。因此发展有效的Hh信号通路 的阻断剂是抗肿瘤药物研究的新策略和新思路。

由于异常活化的Hh信号与人类疾病相关，而突变的Ptch1和Smo蛋白几乎 都导致Hh信号的异常活化，所以人们已经花费了很多精力去寻找确定作用于 Smo或其下游的治疗型抑制剂。如图1所示，环巴胺(cyclopamine)就是这样 一个化合物，它通过与Smo直接相互作用从而特异性地阻断Hh信号通路。环 巴胺是一种从植物中提取的甾体类生物碱，对Hh信号通路有抑制作用，当用其 癌症治疗时，肿瘤发生中的血管结构会显著降低。Smo和Patched中的致癌突变 似乎可以被环巴胺逆转。小规模的临床研究发现，局部施用环巴胺可以有效减 小BCC病灶的大小。环巴胺在鼠类肿瘤的同种异体移植模型中也可以导致髓质 母细胞瘤的衰退和凋亡。然而，环巴胺较差的水溶性(ca.5μg/mL)和酸不稳定性 阻碍了其在临床上治疗肿瘤的应用。

结合图1，SAG是Hh通路的激活剂，它与Smo蛋白有亲和力，但是却以 一种与环巴胺作用相反的方式。由于SAG在更高浓度也抑制Hh通路，因此可 以通过修饰其结构，开发出靶向Smo的抑制剂Sant-75，详请参见专利 CN101597280A。但是，在对Sant-75的进一步研究中发现，Sant-75作为七次穿 膜蛋白抑制剂的生物学活性较低，Sant-75的生物活性有待于进一步提高。

发明内容

基于此，通过对Sant-75的结构进行修饰，提供一种作为七次穿膜蛋白抑制 剂的生物学活性较高的基于Sant-75结构的化合物。

一种基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

其中，-R¹为-H、-F或-Cl；

-R²为-H、-F或-OH；

-R³为-H、-F、-Cl、-OH、-NO₂、-NH₂、-Me、-SO₂Me、-CO₂Me、-CO₂H、 -NHAc或-NHSO₂Me；

-R⁴为-H、-F、-Cl或-SO₂Me；

并且-R¹、-R²、-R³和-R⁴不同时为-H。

在一个实施例中，上述基于Sant-75结构的化合物，具有如下化学式：

一种基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

一种基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

其中，为

一种基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

其中，为

一种基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

其中，-R¹为-H或-n-Pr；

-R²为-CH₃、-C₂H₅、-CH(CH₃)₂、-(CH₂)₂CH₃、-n-Bu、-(CH₂)₄CH₃、-(CH₂)₃CH₃、

-R³为-H或-Cl；

-R⁴为-H或-Cl。

在一个实施例中，上述基于Sant-75结构的化合物中，-R¹为-H。

在一个实施例中，上述基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

在一个实施例中，上述基于Sant-75结构的化合物中，-R¹为-n-Pr。

在一个实施例中，上述基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

上述基于Sant-75结构的化合物，通过对Sant-75进行系统的结构修饰，相 对于Sant-75，其作为七次穿膜蛋白抑制剂的生物学活性较高。

附图说明

图1为现有的几种Smo抑制剂和激活剂的结构对比图；

图2为一实施例的具有结构式(I)的化合物的制备方法的示意图；

图3为一实施例的具有化合物Hh-001的制备方法的示意图；

图4为一实施例的具有结构式(II)的化合物的制备方法的示意图；

图5为一实施例的具有结构式(III)的化合物的制备方法的示意图；

图6为一实施例的具有结构式(IV)的化合物的制备方法的示意图。

具体实施方式

通过对Sant-75进行系统的结构修饰，并借助于斑马鱼胚胎筛选和细胞实 验，发现如下具有更佳水溶性和药代动力学特性的Smo抑制剂。

一实施方式的基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

其中，-R¹为-H、-F或-Cl；

-R²为-H、-F或-OH；

-R³为-H、-F、-Cl、-OH、-NO₂、-NH₂、-Me、-SO₂Me、-CO₂Me、-CO₂H、 -NHAc或-NHSO₂Me；

-R⁴为-H、-F、-Cl或-SO₂Me；

并且-R¹、-R²、-R³和-R⁴不能同时为-H。

结合图2，具有结构式(I)的化合物的制备方法如下：

第一步骤——还原胺化(化合物2到化合物3)：

将单Boc保护的反式环己二胺加入到化合物2的四氢呋喃溶液，室温搅拌 30分钟；然后在0℃加入三乙酰氧基硼氢化钠，并在室温中搅拌过夜；反应用 饱和碳酸钠淬灭后，用二氯甲烷提取三次，有机层合并之后用无水硫酸镁干燥， 真空浓缩后残渣由硅胶柱纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物3。

第二步骤——烷基化反应(化合物3到化合物4)：

向化合物3的DMF溶液中加入氢化钠，反应在0℃搅拌1小时；然后滴加 碘丙烷，再升至室温搅拌3小时，反应用饱和碳酸氢钠淬灭后，用二氯甲烷萃 取三次；合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相浓缩之后残渣用硅胶柱层析 纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物4。

第三步骤——酰基化反应(化合物4到化合物6)：

化合物4和三乙胺溶于的二氯甲烷溶液，加入化合物5，室温搅拌2小时后， 移除溶剂，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液：正己烷/乙酸乙酯＝2/1)得到化合 物6。

第四步骤——脱Boc保护基(化合物6到具有结构式(I)的化合物)：

化合物6溶于的二氯甲烷溶液，在0℃下加入三氟乙酸，室温搅拌1小时， 然后以饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相并用无水硫酸 钠干燥；真空浓缩后，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/丙酮/三乙胺 ＝40/10/1)，得到具有结构式(I)的化合物。

在一个实施例中，上述具有结构式(I)的化合物为：

一实施方式的基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

结合图3，化合物Hh-001的制备方法如下：

第一步骤——还原胺化(化合物2到化合物3)：

将单Boc保护的反式环己二胺加入到化合物2的四氢呋喃溶液，室温搅拌 30分钟；然后在0℃加入三乙酰氧基硼氢化钠，并在室温中搅拌过夜；反应用 饱和碳酸钠淬灭后，用二氯甲烷提取三次，有机层合并之后用无水硫酸镁干燥， 真空浓缩后残渣由硅胶柱纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物3。

第二步骤——烷基化反应(化合物3到化合物4)：

向化合物3的DMF溶液中加入氢化钠，反应在0℃搅拌1小时；然后滴加 碘丙烷，再升至室温搅拌3小时，反应用饱和碳酸氢钠淬灭后，用二氯甲烷萃 取三次；合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相浓缩之后残渣用硅胶柱层析 纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物4。

第三步骤——酰基化反应(化合物4到化合物6’)：

化合物4和三乙胺溶于的二氯甲烷溶液，加入化合物5’，室温搅拌2小时 后，移除溶剂，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液：正己烷/乙酸乙酯＝2/1)得到 化合物6’。

第四步骤——脱Boc保护基(化合物6’到化合物Hh-001)：

化合物6’溶于二氯甲烷溶液，在0℃下加入三氟乙酸，室温搅拌1小时， 然后以饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相并用无水硫酸 钠干燥；真空浓缩后，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/丙酮/三乙胺 ＝40/10/1)，得到化合物Hh-001。

一实施方式的基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

其中，为

上述具有结构式(II)的化合物，具体为：

结合图4，具有结构式(II)的化合物的制备方法如下：

第一步骤——还原胺化(化合物2a到化合物3a)：

将单Boc保护的反式环己二胺加入到化合物2a的四氢呋喃溶液，室温搅拌 30分钟；然后在0℃加入三乙酰氧基硼氢化钠，并在室温中搅拌过夜；反应用 饱和碳酸钠淬灭后，用二氯甲烷提取三次，有机层合并之后用无水硫酸镁干燥， 真空浓缩后残渣由硅胶柱纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物3a。

第二步骤——烷基化反应(化合物3a到化合物4a)：

向化合物3a的DMF溶液中加入氢化钠，反应在0℃搅拌1小时；然后滴 加碘丙烷，再升至室温搅拌3小时，反应用饱和碳酸氢钠淬灭后，用二氯甲烷 萃取三次；合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相浓缩之后残渣用硅胶柱层 析纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物4a。

第三步骤——酰基化反应(化合物4a到化合物6a)：

化合物4a和三乙胺溶于的二氯甲烷溶液，加入化合物5a，室温搅拌2小时 后，移除溶剂，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液：正己烷/乙酸乙酯＝2/1)得到 化合物6a。

第四步骤——脱Boc保护基(化合物6a到具有结构式(II)的化合物)：

化合物6a溶于的二氯甲烷溶液，在0℃下加入三氟乙酸，室温搅拌1小时， 然后以饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相并用无水硫酸 钠干燥；真空浓缩后，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/丙酮/三乙胺 ＝40/10/1)，得到具有结构式(II)的化合物。

一种基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

其中，为

上述具有结构式(III)的化合物，具体为：

结合图5，具有结构式(III)的化合物的制备方法如下：

第一步骤——还原胺化(化合物2b到化合物3b)：

将单Boc保护的反式环己二胺加入到化合物2b的四氢呋喃溶液，室温搅拌 30分钟；然后在0℃加入三乙酰氧基硼氢化钠，并在室温中搅拌过夜；反应用 饱和碳酸钠淬灭后，用二氯甲烷提取三次，有机层合并之后用无水硫酸镁干燥， 真空浓缩后残渣由硅胶柱纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物3b。

第二步骤——烷基化反应(化合物3b到化合物4b)：

向化合物3b的DMF溶液中加入氢化钠，反应在0℃搅拌1小时；然后滴 加碘丙烷，再升至室温搅拌3小时，反应用饱和碳酸氢钠淬灭后，用二氯甲烷 萃取三次；合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相浓缩之后残渣用硅胶柱层 析纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物4b。

第三步骤——酰基化反应(化合物4b到化合物6b)：

化合物4b和三乙胺溶于的二氯甲烷溶液，加入化合物5b，室温搅拌2小时 后，移除溶剂，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液：正己烷/乙酸乙酯＝2/1)得到 化合物6b。

第四步骤——脱Boc保护基(化合物6b到具有结构式(II)的化合物)：

化合物6b溶于的二氯甲烷溶液，在0℃下加入三氟乙酸，室温搅拌1小时， 然后以饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相并用无水硫酸 钠干燥；真空浓缩后，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/丙酮/三乙胺 ＝40/10/1)，得到具有结构式(III)的化合物。

一种基于Sant-75结构的化合物，具有如下结构式：

其中，-R¹为-H或-n-Pr；

-R²为-CH₃、-C₂H₅、-CH(CH₃)₂、-(CH₂)₂CH₃、-n-Bu、-(CH₂)₄CH₃、-(CH₂)₃CH₃、

-R³为-H或-Cl；

-R⁴为-H或-Cl。

-n-Pr代表正丙基，-t-Bu代表叔丁基。

在一个实施例中，上述的具有结构式(IV)的化合物中，-R¹为-H，结构式 为：

在一个实施例中，上述的具有结构式(IV)的化合物中，-R¹为-n-Pr，结构 式为：

结合图6，具有结构式(IV)的化合物的制备方法如下：

第一步骤——还原胺化(化合物2c到化合物3c)：

将单Boc保护的反式环己二胺加入到化合物2c的四氢呋喃溶液，室温搅拌 30分钟；然后在0℃加入三乙酰氧基硼氢化钠，并在室温中搅拌过夜；反应用 饱和碳酸钠淬灭后，用二氯甲烷提取三次，有机层合并之后用无水硫酸镁干燥， 真空浓缩后残渣由硅胶柱纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物3c。

第二步骤——烷基化反应(化合物3c到化合物4c)：

向化合物3c的DMF溶液中加入氢化钠，反应在0℃搅拌1小时；然后滴 加碘丙烷，再升至室温搅拌3小时，反应用饱和碳酸氢钠淬灭后，用二氯甲烷 萃取三次；合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相浓缩之后残渣用硅胶柱层 析纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到化合物4c。

第三步骤——酰基化反应/脱Boc保护基(化合物4c到化合物6c或化合物 3c到化合物6c’)：

化合物4c或化合物3c和三乙胺溶于的二氯甲烷溶液，加入化合物5c，室 温搅拌2小时后，移除溶剂，残渣溶于的二氯甲烷溶液，在0℃下加入三氟乙 酸，室温搅拌1小时，然后以饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷萃取三次，合 并有机相并用无水硫酸钠干燥；真空浓缩后，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液： 二氯甲烷/丙酮/三乙胺＝40/10/1)，得到化合物6c或6c’。

第四步骤——酰基化反应(化合物6c到具有结构式(IV)的化合物或6c’到 具有结构式(V)的化合物)

化合物6c或6c’和三乙胺溶于的二氯甲烷溶液，加入化合物酰氯R₂COCl， 室温搅拌2小时后，移除溶剂，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲 醇＝20/1)得到具有结构式(IV)或(V)的化合物。

在一个实施例中，上述的具有结构式(V)的化合物为：

在一个实施例中，上述的具有结构式(VI)的化合物为：

上述基于Sant-75结构的化合物，通过对Sant-75进行系统的结构修饰，相 对于Sant-75，其作为七次穿膜蛋白抑制剂的生物学活性较高。

以下为具体实施例部分。

实施例1

3-氯-6-硝基-氮-反式-4-丙胺基环己基-氮-(3-(4-吡啶基))苄基苯并[b]噻吩 -2-甲酰胺(3-chloro-6-nitro-N-((trans)-4-(propylamino)cyclohexyl) -N-(3-(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

结合图2，化合物4(84mg，0.2mmol)和三乙胺(42μL，0.30mmol)溶于4ml 的二氯甲烷溶液，加入6-硝基-3-氯代苯并噻吩酰氯(66mg，0.24mmol)，室温 搅拌2小时后，移除溶剂，得到带有Boc保护基的Hh-0224粗产物。将该粗产 物溶于4ml的二氯甲烷溶液，在0℃下加入1ml三氟乙酸，室温搅拌1小时， 然后以4ml饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷(3×20mL)萃取，合并有机相 并用无水硫酸钠干燥；真空浓缩后，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲 烷/丙酮/三乙胺＝40/10/1)得到85mg目标产物Hh-0224，两步总收率为75％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.68(d，J＝5.4Hz，2H)， 8.28-8.42(br，1H)，7.90-8.11(br，1H)，7.26-7.67(m，7H)，4.63-4.82(br，2H)， 3.78-4.18(br，1H)，2.68-2.90(br，m，3H)，1.25-2.21(m，10H)，0.89(t，J＝7.2Hz， 3H)；HRMS(ESI)理论值C₃₀H₃₂ClN₄O₃S[M⁺]：563.1884，实测值：563.1898。

实施例2

3-氯-6-甲氧羰基-氮-反式-4-丙胺基环己基-氮-(3-(4-吡啶基))苄基苯并[b] 噻吩-2-甲酰胺(3-chloro-6-methoxylcarbonyl-N-((trans)-4-(propylamino)cyclohexyl) -N-(3-(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

结合图2，化合物4(84mg，0.2mmol)和三乙胺(42μL，0.30mmol)溶于4ml 的二氯甲烷溶液，加入6-甲氧羰基-3-氯代苯并噻吩酰氯(69mg，0.24mmol)， 室温搅拌2小时后，移除溶剂，得到带有Boc保护基的Hh-006的粗产物。将该 粗产物溶于4ml的二氯甲烷溶液，在0℃下加入1ml三氟乙酸，室温搅拌1 小时，然后以4ml饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷(3×20mL)萃取，合并 有机相并用无水硫酸钠干燥；真空浓缩后，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱液用： 二氯甲烷/丙酮/三乙胺＝40/10/1)得到64mg目标产物Hh-006，两步总收率为 56％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.57-8.66(m，3H)，7.26-8.19(m， 8H)，4.84(s，2H)，3.99(s，3H)，3.76(m，1H)，2.35-2.60(m，3H)，1.28-2.04(m，10H)， 0.83(t，J＝6.7Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值C₃₂H₃₅ClN₃O₃S[M⁺]：576.2088，实测 值：576.2079。

实施例3

3-氯-5，6-亚甲二氧基-氮-反式-4-丙胺基环己基-氮-(3-(4-吡啶基))苄基 苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(3-chloro-5，6-methylenedioxy-N-((trans)-4-(propylamino) cyclohexyl)-N-(3-(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

结合图3，化合物4(84mg，0.2mmol)和三乙胺(42μL，0.30mmol)溶于4ml 的二氯甲烷溶液，加入5，6-亚甲二氧基-3-氯代苯并噻吩酰氯(66mg，0.24 mmol)，室温搅拌2小时后，移除溶剂，得到带有Boc保护基的Hh-001的粗产 物。将该粗产物溶于4ml的二氯甲烷溶液，在0℃下加入1ml三氟乙酸，室 温搅拌1小时，然后以4ml饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷(3×20mL)萃 取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥；真空浓缩后，残渣由硅胶柱层析纯化(洗 脱液用：二氯甲烷/丙酮/三乙胺＝40/10/1)得到81mg目标产物Hh-001，两步总 收率为72％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.65(d，J＝4.5Hz，2H)，7.30-7.68 (m，6H)，7.15-7.20(m，2H)，6.07(s，2H)，4.77(s，2H)，3.85(m，1H)，2.33-2.55(m， 3H)，1.83-1.97(m，5H)，1.26(m，5H)，0.87(t，J＝6.7Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值 C₃₁H₃₃ClN₃O₃S[M⁺]：562.1931，实测值：562.1979。

实施例4

3，6，7-三氯-氮-反式-4-丙胺基环己基-氮-(3-(4-吡啶基))苄基苯并[b]噻吩 -2-甲酰胺(3，6，7-trichloro-N-((trans)-4-(propylamino)cyclohexyl)N-(3-(pyridin-4-yl) benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

结合图2，化合物4(84mg，0.2mmol)和三乙胺(42μL，0.30mmol)溶于4ml 的二氯甲烷溶液，加入5，6-亚甲二氧基-3-氯代苯并噻吩酰氯(71mg，0.24 mmol)，室温搅拌2小时后，移除溶剂，得到带有Boc保护基的Hh-019的粗产 物。将该粗产物溶于4ml的二氯甲烷溶液，在0℃下加入1ml三氟乙酸，室 温搅拌1小时，然后以4ml饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷(3×20mL)萃 取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥；真空浓缩后，残渣由硅胶柱层析纯化(洗 脱液用：二氯甲烷/丙酮/三乙胺＝40/10/1)得到92mg目标产物Hh-019，两步总 收率为78％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.66(d，J＝4.2Hz，2H)，7.46-7.68 (m，8H)，4.69-4.85(br，2H)，3.79(m，1H)，2.42-2.72(m，3H)，1.80-2.08(m，4H)， 1.24-1.68(m，6H)，0.87(t，J＝6.7Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值C₃₀H₃₁Cl₃N₃OS [M⁺]：586.1253，实测值：586.1232。

实施例5

3-氯-6-氨基-氮-反式-4-丙胺基环己基-氮-(3-(4-吡啶基))苄基苯并[b]噻吩 -2-甲酰胺(3-chloro-6-amino-N-((trans)-4-(propylamino)cyclohexyl)-N-(3-(pyridin-4 -yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

实施例1制得的带有Boc保护基的Hh-0224(331mg，0.5mmol)溶于5ml 的DMF和水(1∶1)的混合溶剂中，加入FeCl₃(225mg，1.5mmol)，锌粉(325mg， 5mmol)。混合物在100℃反应1小时。当反应转化完全后，过滤混合物，滤液 用10ml水稀释，接着加入饱和的Na₂CO₃溶液中和反应体系，并用二氯甲烷(3x 10ml)萃取，无水硫酸钠干燥。浓缩后得到带有Boc保护基的Hh-0227的粗产物。 将该粗产物溶于10ml的二氯甲烷溶液，在0℃下加入2ml三氟乙酸，室温搅 拌1小时，然后以4ml饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷(3×30mL)萃取， 合并有机相并用无水硫酸钠干燥；真空浓缩后，残渣由硅胶柱层析纯化(洗脱 液：二氯甲烷/甲醇＝30/1)得到191mg目标产物Hh-0227，两步总收率为72％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，DMSO)δ8.63(s，2H)，7.47-7.64(m，7H)， 6.83-7.02(m，2H)，5.71(s，2H)，4.75(s，2H)，3.72(m，1H)，2.7-2.89(m，3H)， 1.21-2.07(m，10H)，0.87(t，J＝6.7Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值C₃₀H₃₄ClN₄OS [M⁺]：533.2142，实测值：533.2149。

实施例6

3-氯-6-甲磺酰胺基-氮-反式-4-丙胺基环己基-氮-(3-(4-吡啶基))苄基苯并 [b]噻吩-2-甲酰胺(3-chloro-6-(methylsulfonamido)-N-((trans)-4-(propylamino) cyclohexyl)-N-(3-(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

将实施例5制得的带有Boc保护基的Hh-0227(63mg，0.1mmol)和三乙胺 (20.8μl，0.15mmol)溶于10ml干燥的二氯甲烷，向其中加入MeSO₂Cl(14mg， 0.12mmol)，然后室温搅拌反应4小时后浓缩。将浓缩后的残留物溶于2ml的 二氯甲烷溶液，在0℃下加入0.5ml三氟乙酸，室温搅拌1小时，然后以2ml 饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷(3×10mL)萃取，合并有机相并用无水硫 酸钠干燥；真空浓缩后，残渣用硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝40/1) 得到48mg目标产物Hh-0215，两步总收率为78％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，DMSO)δ8.64(s，2H)，7.29-7.80(m，9H)， 4.79(s，2H)，2.98(s，3H)，2.35-2.50(m，3H)，1.21-2.07(m，10H)，0.87(t，J＝6.7Hz， 3H)；HRMS(ESI)理论值C₃₁H₃₆ClN₄O₃S₂[M⁺]：611.1917，实测值：611.1922。

实施例7

3-氯-6-乙酰氨基-氮-反式-4-丙胺基环己基-氮-(3-(4-吡啶基))苄基苯并[b] 噻吩-2-甲酰胺(3-chloro-6-(actamido)-N-((trans)-4-(propylamino)cyclohexyl) -N-(3-(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

将实施例5制得的带有Boc保护基的Hh-0227(63mg，0.1mmol)和三乙胺 (20.8μl，0.15mmol)溶于5ml干燥的二氯甲烷，向其中加入乙酰氯(10mg，0.12 mmol)，然后室温搅拌反应3小时后浓缩。将浓缩后的残留物溶于2ml的二氯 甲烷溶液，在0℃下加入0.5ml三氟乙酸，室温搅拌1小时，然后以2ml饱 和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲烷(3×10mL)萃取，合并有机相并用无水硫酸 钠干燥；真空浓缩后，残渣用硅胶柱层析纯化(洗脱液用：二氯甲烷/甲醇＝30/1) 得到42mg目标产物Hh-0218，两步总收率为74％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.65(s，2H)，8.25(s，1H)，7.28-7.65 (m，9H)，4.78(br，2H)，3.88-4.20(br，1H)，2.70-2.88(m，3H)，2.18(S，3H)，1.92-2.10 (m，4H)，1.26-2.14(m，10H)，0.87(t，J＝6.7Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值 C₃₂H₃₆ClN₄O₂S[M⁺]：575.2247，实测值：575.2246。

实施例8

3-氯-5，6-二羟基-氮-反式-4-丙胺基环己基-氮-(3-(4-吡啶基))苄基苯并[b] 噻吩-2-甲酰胺(3-chloro-5，6-dihydroxy-N-((trans)-4-(propylamino)cyclohexyl) -N-(3-(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

将实施例3制得的化合物Hh-001(56mg，0.1mmol)溶于5ml干燥的二氯 甲烷，冷却至-78℃，并用氮气保护反应体系，用注射器慢慢滴加三溴化硼(22.6 μL，0.24mmol)。加完后，撤除低温浴，让反应体系自然升至室温并搅拌过夜。 反应结束后，加入30ml乙酸乙酯稀释反应液，并连续用饱和食盐水(3x4mL) 和水(2x4mL)洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，真空浓缩后，残渣用硅胶柱层 析纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝20/1)得到37mg目标产物Hh-002，收率为 68％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，DMSO)δ9.79(br，2H)，8.79-8.95(m，3H)， 7.18-8.26(m，7H)，7.15-7.20(m，2H)，4.80(s，2H)，2.92-2.98(m，1H)，2.65-2.75(m， 2H)，2.02-2.15(m，2H)，1.56-1.78(m，6H)，1.20(m，2H)，0.87(t，J＝6.7Hz，3H)； HRMS(ESI)理论值C₃₀H₃₃ClN₃O₃S[M⁺]：550.1931，实测值：550.1947。

实施例9

3-氯-6-羧基-氮-反式-4-丙胺基环己基-氮-(3-(4-吡啶基))苄基苯并[b]噻吩 -2-甲酰胺(3-chloro-6-carboxyl-N-((trans)-4-(propylamino)cyclohexyl) -N-(3-(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

将实施例2制得的化合物Hh-006(28mg，0.05mmol)溶于2ml甲醇和2mL 0.25N KOH水溶液，混合物在40℃搅拌反应2小时。加入5ml的水，并搅拌 至均相。水相用乙醚萃取(2X4ml)以除去小极性的杂志。然后用浓盐酸酸化， 洗出固体，过滤出固体，水洗，干燥后得到18mg目标产物Hh-007，收率63％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，DMSO)δ8.58-8.66(m，3H)，7.46-8.14(m， 8H)，4.83(s，2H)，4.29(m，1H)，2.66-2.91(m，3H)，1.53-2.07(m，6H)，1.15-1.21(m， 4H)，0.83(t，J＝6.7Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值C₃₁H₃₃ClN₃O₃S[M⁺]：562.1931， 实测值：562.1935。

实施例10

氮-(2，4’-联吡啶-6-基-甲基)-3-氯-氮-反式-4-丙胺基环己基苯并[b]噻吩-2- 甲酰胺(N-(2，4′-bipyridin-6-ylmethyl)-3-chloro-N-((trans)-4-(propylamino) cyclohexyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

结合图2，以2，4′-联吡啶-6-甲醛为原料，采用通用的制备步骤，即：1)还 原胺化；2)烷基化；3)酰胺化；4)脱Boc保护基；合成得到Hh-0273。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.75(d，J＝5.7Hz，2H)，7.39-7.94 (m，9H)，4.76-4.93(br，2H)，4.52(br，0.4H)，3.82(br，0.6H)，2.52-2.66(m，3H)， 1.43-2.33(m，10H)，0.88(t，J＝7.2Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值C₂₉H₃₂ClN₄OS [M⁺]：519.19851，实测值：519.1986。

实施例11

3-氯-氮-反式-4-丙胺基环己基-氮-((2-(吡啶-4-基)-嘧啶)-4-基)甲基) 苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(3-chloro-N-((trans)-4-(propylamino)cyclohexyl) -N-((2-(pyridin-4-yl)pyrimidin-4-yl)methyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制 备

结合图2，以2-(吡啶-4-基)嘧啶-4-甲醛为原料，采用通用的制备步骤， 即：1)还原胺化；2)烷基化；3)酰胺化；4)脱Boc保护基；合成得到Hh-0530。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.78-8.83(m，3H)，7.46-7.86(m， 7H)，4.82(br，2H)，4.52(m，0.4H)，3.92(m，0.6H)，2.73-2.90(m，3H)，1.66-2.21(m， 10H)，0.88(t，J＝7.2Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值C₂₈H₃₁ClN₅OS[M⁺]： 520.1938，实测值：520.1943。

实施例12

3-氯-氮-(反式)-4-丙胺基环己基-氮-(3-(嘧啶-5-基)苄基)苯并[b]噻吩 -2-甲酰胺(3-chloro-N-((trans)-4-(propylamino)cyclohexyl)-N-(3-(pyrimidin-5-yl) benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

结合图5，以3-(嘧啶-5-基)苯甲醛为原料，采用通用的制备步骤，即：1) 还原胺化；2)烷基化；3)酰胺化；4)脱Boc保护基；合成得到Hh-0266。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ9.21(s，1H)，8.79-8.98(br，2H)， 7.49-7.84(m，8H)，4.68-4.82(br，2H)，3.80-4.28(m，1H)，2.45-2.62(m3H)， 1.25-2.06(m，10H)，0.87(t，J＝7.2Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值C₂₉H₃₂ClN₄OS [M⁺]：519.1985，实测值：519.1981。

实施例13

3-氯-氮-(3-吗啡啉苄基)-氮-((反式)-4-丙胺基环己基)苯并[b]噻吩-2- 甲酰胺(3-chloro-N-(3-morpholinobenzyl)-N-((1r，4r)-4-(propylamino)cyclohexyl) benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

结合图5，以3-(吗啡啉)苯甲醛为原料，采用通用的制备步骤，即：1) 还原胺化；2)烷基化；3)酰胺化；4)脱Boc保护基；合成得到Hh-0566。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ7.78-7.81(m，2H)，7.43-7.52(m， 2H)，7.00-7.22(m，1H)6.71-6.79(m，3H)，4.55-4.68(m，2H)，3.83-4.10(m，1H)，3.83 (s，4H)，3.21-3.25(m，4H)，2.68-2.86(m，3H)，2.57-2.60(br，4H)，1.79-2.23(m，10H)， 0.91(t，J＝7.2Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值C₂₉H₃₇ClN₃O₂S[M⁺]：526.2295，实测 值：526.2296。

实施例14

3-氯-氮-((反式)-4-(氮-丙基环丁烷甲酰胺基)环己基)-氮-(3-(4-吡啶 基))苄基苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(3-chloro-N-((trans)-4-(N- propylcyclobutanecarboxamido)cyclohexyl)-N-(3-(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiop hene-2-carboxamide)的制备

将化合物Sant-75(52mg，0.1mmol)和三乙胺(20.8μl，0.15mmol)溶于5ml 干燥的二氯甲烷，向其中加入环丁烷甲酰氯(14mg，0.12mmol)，然后室温搅拌 反应3小时后浓缩。将浓缩后的残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/ 甲醇＝30/1)得到51mg目标产物Hh-01047，收率为86％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.67(br，2H)，7.27-7.88(m，10H)， 4.65-4.86(m，2H)，3.82-3.98(m，1H)，2.90-3.18(m，4H)，1.28-2.32(m，16H)，0.85(t， J＝7.2Hz，3H)；HRMS(ESI)理论值C₃₅H₃₉ClN₃O₂S[M⁺]：600.2452，实测值： 600.2437。

实施例15

3-氯-氮-((反式)-4-(氮-丙基尼古丁甲酰胺基)环己基)-氮-(3-(4-吡啶 基))苄基苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(3-chloro-N-((trans)-4-(N-propylnicotinamido) cyclohexyl)-N-(3-(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)的制备

将化合物Sant-75(52mg，0.1mmol)和三乙胺(20.8μl，0.15mmol)溶于5ml 干燥的二氯甲烷，向其中加入尼古丁甲酰氯(17mg，0.12mmol)，然后室温搅拌 反应3小时后浓缩。将浓缩后的残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/ 甲醇＝20/1)得到45mg目标产物，收率为73％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.67(br，4H)，7.19-7.91(m，12H)， 4.71-4.88(m，2H)，2.95-3.91(m，4H)，1.44-2.01(m，10H)，0.90(br，3H)；HRMS(ESI) 理论值C₃₆H₃₆ClN₄O₂S[M⁺]：623.2247，实测值：623.2254。

实施例16

3-氯-氮-((反式)-4-(2-苯氧乙酰胺基)环己基)-氮-(3-(4-吡啶基))苄 基苯并[b]噻吩-2-甲酰胺3-chloro-N-((trans)-4-(2-phenoxyacetamido)cyclohexyl) -N-(3-(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide的制备

结合图6，化合物3c(190mg，0.5mmol)和三乙胺(104μL，0.75mmol)溶于 8ml的二氯甲烷溶液，加入3-氯代苯并噻吩酰氯(138mg，0.6mmol)，室温搅 拌2小时后，移除溶剂，所得残留物溶于8ml的二氯甲烷溶液，在0℃下加入 2ml三氟乙酸，室温搅拌1小时，然后以8ml饱和碳酸钠淬灭反应，用二氯甲 烷(3×30mL)萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥；真空浓缩后，所得中 间体溶于20ml干燥的二氯甲烷，向其中加入三乙胺(104μl，0.75mmol)和2-苯 氧乙酰氯(102mg，0.6mmol)，然后室温搅拌反应3小时后浓缩。将浓缩后的残 留物用硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝20/1)得到198mg目标产物， 收率为65％。

产物经测定：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.66(d，J＝4.8Hz，2H)，6.28-7.86 (m，15H)，4.70-4.85(m，2H)，4.40(s，2H)，3.71-3.85(m 2H)，1.65-1.95(m，8H)； HRMS(ESI)理论值C₃₅H₃₃ClN₃O₃S[M⁺]：610.1931，实测值：610.1943。

性能测试一

分别选取具有代表性的化合物进行性能测定，具体化合物见表1。将上述化 合物作用于斑马鱼的FLK胚胎，通过显微镜观察胚胎发育型态的变化，可实现 在整个活体胚胎中在体内水平上检测Hh的活性：Hh通路被抑制的胚胎会有U 型体节(正常为V型)，并且身体弯曲，眼睛发育异常。各化合物对FLK胚胎 表型的最低作用浓度实验结果如表1所示：

表1：代表化合物的转基因斑马鱼胚胎抑制试验

  化合物   最低作用浓度   Sant-75   5μM   Hh-0241   5μM   Hh-011   5μM   Hh-0273   50μM   Hh-0566   5μM   Hh-01047   1μM   Hh-01034   2.5μM   Hh-01121   20μM   Hh-01149   10μM   Hh-01137   20μM   Hh-01031   5μM   Hh-01157   0.6μM   Hh-01160   2.5μM   Hh-01186   20μM   Hh-01193   2.5μM

性能测试二

上述化合物采用Shh-Light2细胞系来进一步检测对Hh通路的活性，用只有 N端活性部分的合成的Shh蛋白作为信号分子，在培养基中加入上述待测的化 合物以及荧光素酶报告质粒。通过从1×10^-2到1×10⁴nM浓度梯度的检测， 发现化合物对Hh信号传导也有明显的抑制作用，结果见表2。对比文献(Taipale， J.，Chen，J.K.，Cooper，M.K.，Wang，B.，Mann.R.K.，Milenkovic，L.，Scott，M.P.，and Beachy，P.A.2000.Effects of oncogenic mutations in Smoothened and Patched can be reversed by cyclopamine.Nature 406：1005-1009.)中已经报道的Cyclopamine的 浓度要低(IC50＝300nM)。

表2：代表化合物的Shh-light2细胞试验

  化合物 Normalized IC50 with Shh-light2   Sant-75 9nM   Hh-0241 2.5nM   Hh-011 17nM   Hh-0273 11nM   Hh-0566 136nM   Hh-01047 20.6nM   Hh-01034 15.2nM   Hh-01121 9.8nM   Hh-01149 11.4nM   Hh-01137 11.6nM   Hh-01031 23.8nM   Hh-01157 20.2nM   Hh-01160 6.9nM   Hh-01186 5.6nM   Hh-01193 13.1nM

由性能测试一和性能测试二可以看出，这种基于Sant-75结构的化合物，通 过对Sant-75进行系统的结构修饰，相对于Sant-75，其作为七次穿膜蛋白抑制 剂的生物学活性较高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。