肌强直性营养障碍蛋白激酶(DMPK)表达的调节

摘要

本发明提供了用于减少动物中的DMPK mRNA和蛋白质的表达的方法、化合物和组合物。本发明中还提供了用于优先减少动物中的CUGexp DMPK RNA、减少动物中的肌强直或减少动物中的剪接病变的方法、化合物和组合物。此类方法、化合物和组合物对于治疗、预防、延迟或改善1型肌强直性营养不良或其症状是有用的。

说明书

序列表

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领域

本文中提供了用于减少动物中的DMPK mRNA和蛋白质的表达 的方法、化合物和组合物。同样地，本文中提供了用于优先减少动物 中的CUGexp DMPK RNA，减少动物中的肌强直或减少动物中的剪 接病变的包括DMPK抑制剂的方法、化合物和组合物。此类方法、 化合物和组合物用于例如治疗、预防或改善动物中的I型肌强直性营 养不良(DM1)。

背景

肌强直性营养不良1型(DM1)是成人的肌营养不良症的最常见形 式，据估计频率为1/7,500(Harper PS.,Myotonic Dystrophy.London： W.B.Saunders Company；2001)。DM1是由DMPK1的非编码CTG 重复的扩大引起的常染色体显性障碍。DMPK1为编码胞质丝氨酸/ 苏氨酸激酶(Brook JD等人，Cell,1992,68(4):799-808)。该激酶的生 理功能和底物还未完全确定。扩大的CTG重复位于DMPK1的3′非 翻译区(UTR)。该空谈导致RNA显性(RNA dominance)，其中包含扩 大的CUG重复的RNA(CUGexp)诱导细胞功能障碍的过程(Osborne  RJ和Thornton CA.,Human Molecular Genetics.,2006,15(2)： R162-R169)。

DMPK基因通常在3′非翻译区具有个5-37CTG重复。在肌强直 性营养不良I型中，该数目显著扩大，在例如50至大于3,500的范围 内(Harper,肌强直性营养不良(Saunders,London,ed.3,2001)；Annu. Rev.Neurosci.29：259,2006；EMBO J.19：4439,2000；Curr Opin  Neurol.20：572,2007)。

CUGexp片段与RNA结合蛋白包括盲肌样(MBNL)蛋白(剪接因 子)相互作用，并且引起突变的转录物保留在细胞核聚集点(nuclear  foci)。该RNA的毒性源自RNA结合蛋白的隔离和信号转导途径的激 活。动物模型的研究已显示如果减少CUGexp RNA的毒性，则可逆 转DM1的表型(Wheeler TM等人，Science.,2009,325(5938):336-339； Mulders SA等人，Proc Natl Acad Sci USA.,2009, 106(33):13915-13920)。

在DM1中，骨骼肌是受到最严重影响的组织，但疾病也对心脏 和平滑肌、眼睛水晶体(ocular len)和脑具有重大影响。颅、远肢(distal  limb)和膈肌也优先受到影响。手灵巧度较早受损，这引起数十年的 严重失能。死亡年龄中位数为55岁，通常死于呼吸衰竭(de  Die-Smulders CE等人，Brain.,1998,121(Pt8)：1557-1563)。

反义技术正新兴为调节某些基因产物的表达的有效工具，并且从 而可证明在许多关于DMPK1的调节的治疗、诊断和研究应用中具有 独特用途。已显示靶向CAG重复的完全经修饰的寡核苷酸的肌内注 射在小鼠中阻断CUGexp-MBNLl复合物的形成，分散CUGexp转录 物的细胞核聚集点，增强核质转运(nucleocytoplasmic transport)和 CUGexp转录物的释放，将MBNL蛋白释放至核质，标准化MBNL- 依赖性外显子的选择性剪接，和消除表达CUGexp的转基因小鼠的肌 强直(Wheeler TM等人，Science.,2009,525(5938):336-339； WO2008/036406)。

目前，不存在可改变DM1的过程的治疗。因此疾病负担是明显 的。因此，本文中的目的是提供用于治疗DM1的化合物、组合物和 方法。

概述

本文中提供了用于抑制DMPK表达和治疗、预防、延迟或改善 DMPK相关疾病和/或其症状的方法、化合物和组合物。在某些实施 方案中，该化合物和组合物抑制突变的DMPK或CUGexp DMPK。

某些实施方案提供了减少动物中的DMPK表达的方法，包括给 动物施用包含本文中进一步描述的靶向DMPK的经修饰的寡核苷酸 的化合物。

某些实施方案提供了优先减少CUGexp DMPK、减少肌强直或减 少动物中的剪接病变的方法，包括给动物施用包含本文中进一步描述 的靶向CUGexp DMPK的经修饰的寡核苷酸的化合物。由于它们在 细胞核中的更长的停留时间，CUGexp DMPK转录物据信对于通过细 胞核核糖核酸酶的反义敲低特别敏感，并且该敏感性据认为允许相关 组织（例如肌肉）中的CUGexp DMPK转录的有效反义抑制，尽管 存在对反义寡核苷酸的组织吸收的生物分布屏障。不通过细胞核核糖 核酸酶引发裂解的反义机制例如W heeler TM等人，Science.,2009, 325(5938):336-339和WO2008/036406中描述的CAG-重复ASO，不 提供相同的治疗有利方面。

某些实施方案提供治疗患有1型肌强直性营养不良的动物中的 方法。在某些实施方案中，该方法包括给动物施用治疗有效量的包含 本文中进一步描述的靶向DMPK的经修饰的寡核苷酸的化合物。在 某些实施方案中，该方法包括鉴定患有1型肌强直性营养不良的动 物。

某些实施方案提供了治疗、预防、延迟或改善与DM1的发展相 关的病症和结果，其包括肌肉僵硬(muscle stiffness)、肌强直、远端肢 体无力（disabling distal weakness）、面部肌肉和颚肌无力(weakness in  face and jaw muscles)、吞咽困难、举抬无力(上睑下垂)、颈肌无力 (weakness of neck muscles)、手臂和腿部肌肉无力(weakness in arm and  leg muscles)、持久性肌肉疼痛(persistent muscle pain)、嗜睡症 (hypersomnia)、肌萎缩、咽下困难(dysphagia)、呼吸功能不全 (respiratory insufficiency)、心律不齐(irregular heartbeat)、心肌损伤 (heart muscle damage)、情感淡漠(apathy)、胰岛素抗药性(insulin  resistance)和白内障的方法。某些实施方案提供了治疗、预防、延迟 或改善儿童的与DM1的发展相关的病症和结果(括发育迟滞、学习问 题、语言和言语问题以及人格发展问题)方法。

某些实施方案提供了施用通过直接裂解病原性转录抵消RNA显 性的反义寡核苷酸的方法。

在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号 NM_001081560.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：1)。在某些实 施方案中，DMPK具有GenBank登录号NT_011109.15所示的从核苷 酸18540696至18555106截断的序列(本文中合为SEQ ID NO：2)。 在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号NT_039413.7所示 的从核苷酸16666001至16681000截断的序列(本文中合为SEQ ID  NO：3)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号NM _032418.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：4)。在某些实施方案 中，DMPK具有GenBank登录号AI007148.1所示的序列(本文中合 为SEQ ID NO：5)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录 号AI304033.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：6)。在某些实施 方案中，DMPK具有如GenBank登录号BC024150.1所示的序列(本 文中合为SEQ ID NO：7)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank 登录号BC056615.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：8)。在某些 实施方案中，DMPK具有GenBank登录号BC075715.1所示的序列(在 本文中合为SEQ ID NO：793)。在某些实施方案中，DMPK具有 GenBank登录号BU519245.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO： 794)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号CB247909.1 中所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：795)。在某些实施方案中， DMPK具有GenBank登录号CX208906.1所示的序列(本文中合为 SEQ ID NO：796)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录 号CX732022.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：797)。在某些实 施方案中，DMPK具有GenBank登录号S60315.1所示的序列(本文中 合为SEQ ID NO：798)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank 登录号S60316.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：799)。在某些 实施方案中，DMPK具有GenBank登录号NM001081562.1所示的 序列(本文中合为SEQ ID NO：800)。在某些实施方案中，DMPK具 有GenBank登录号NM_001100.3所示的序列(本文中合为SEQ ID  NO：801)。

详细描述

应理解，上述一般描述和下列详细描述仅仅是示例性的和说明性 的并且不限制本发明，如所描述的。在本文中，除非另外声明，否则 单数的使用包括复数。在本文中，除非另外声明，否则”或”的用途意 指”和/或”。此外，术语”包括”以及其它形式例如”包含”和”含有”的用 途不是限制性的。同样地，除非另外声明，否则术语例如“成分”或” 组分”包括包含一个单位的成分和组分以及包含超过一个亚单位的成 分和组分。

本文中使用的部分的标题仅为了组织目的并且不被解释为限制 描述的主题。本申请中引用的所有文献或文献的部分包括但不限于专 利、专利申请、文章、书籍和论文通过引用以本文中描述的文献的部 分以及以其全文并入本文。

定义

除非提供明确的定义，否则本文中描述的分析化学、合成有机化 学以及医学和药物化学结合使用的命名法以及方法和技术是本领域 公知的且通常使用的命名法以及方法和技术。标准技术可用于化学合 和化学分析。当允许时，所有专利、申请、公开的申请和其它出版物、 可通过数据库例如国家生物技术信息中心(NCBI)获得的GENBANK 登录号和相关序列信息以及在整个本公开内容中提及的其它数据通 过引用以本文中论述的文献的部分以及以其整体并入本文。

除非另外指出，否则下列术语具有下列含义：

“2′-O-甲氧基乙基”(也为2′-MOE和2′-O(CH₂)₂-OCH₃)称为呋喃酰 基环的2′位置的O-甲氧基-乙基修饰。经2′-O-甲氧基乙基修饰的糖为 经修饰的糖。

“2′-O-甲氧基乙基核苷酸”意指包含经2′-O-甲氧基乙基修饰的糖 部分的核苷酸。

“5-甲基胞嘧啶”意利用连接于位置5的的甲基经修饰的的胞嘧 啶。5-甲基胞嘧啶为经修饰的核碱基。

“约”意指值的±7%。例如，如果说到“化合物影响DMPK的抑制 的至少70%”，则其意指DMPK水平被抑制的程度在63%与77%之间 的范围内。

“活性药物试剂”意指当给个体施用时提供治疗益处的药物组合 物中的物质。例如，在某些实施方案中，靶向DMPK的反义寡核苷 酸为活性药物试剂。

“活性靶区域”或“靶区域”意指一种或多种活性反义化合物被靶 向的区域。“活性反义化合物”意指降低靶核酸水平或蛋白质水平的反 义化合物。

“伴随施用的”是指两种试剂以其中两者的药理学作用在患者同 时表现的任何方式进行的共施用。伴随施用剂量不需要将两种试剂以 单一药物组合物、以相同剂量形式或通过相同施用途径进行施用。两 种试剂的作用本身不一定同时表现。作用只需重叠一段时间而不必共 同延伸。

“施用”意指给动物提供试剂，且包括但不限于通过医学专业人员 施用和自已施用。

“试剂”意指当给动物施用时可提供治疗益处的活性物质。“第一 试剂”意指本发明的治疗性化合物。例如，第一试剂可以是靶向DMPK 的反义寡核苷酸。“第二试剂”意指本发明的第二治疗性化合物(例如， 靶向DMPK的第二反义寡核苷酸)和/或非DMPK治疗性化合物。

“改善”是指相关疾病、病症或病状的至少一个指征、体征或症状 的减轻。指征的严重度可通过主观或客观测量来测定，这对于本领域 技术人员来说是已知的。

“动物”是指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、 猫、猪和非人灵长类动物（包括但不限于猴和黑猩猩）。

“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何 可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性为靶核酸或由 这样的靶核酸编码的蛋白质的量或表达的减少。

“反义化合物”意指能够经历通过氢键合与靶核酸杂交的寡聚化 合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，例如反义寡核苷酸、 siRNA、shRNA、snoRNA、miRNA和附属物（satellite）重复。

“反义抑制”意指在与靶核酸化合物互补的反义化合物存在的情 况下靶核酸水平或靶蛋白质水平与在所述反义化合物不存在的情况 下的靶核酸水平或靶蛋白质水平相比较的降低。

“反义寡核苷酸”意指具有允许与靶核酸的相应区域或片段杂交 的核碱基序列的单链寡核苷酸。

“二环糖”意指通过两个非成对碳环原子的桥连修饰的呋喃基环。 二环糖是经修饰的糖。

“二环核酸”或“BNA”是指其中核苷或核苷酸的呋喃糖部分包括 连接呋喃糖环上的两个碳原子从而形成二环环系统的桥的核苷或核 苷酸。

“帽状结构”或“端帽部分”意指经化学修饰的，其已被整合在反义 化合物的任一端。

“化学上不同的区域”是指以一定方式在化学上与相同反义化合 物的另一个区域不同的反义化合物的区域。例如，具有2′-O-甲氧基 乙基核苷酸的区域在化学上与具有不具有经2′-O-甲氧基乙基修饰的 核苷酸的区域不同。

“嵌合反义化合物”意指具有至少两个化学上不同的区域的反义 化合物。

“共施用”是指两种或更多种试剂对个体的施用。两种或更多种试 剂可存在于单一药物组合物中，或可存在于单独的药物组合物。两种 或更多种试剂的每一种可通过相同或不同的施用途径来施用。共施用 包括平行或相继施用。

“互补性”意指第一核酸与第二核酸的核碱基之间配对的能力。

“连续核碱基”意指彼此直接毗连的核碱基。

“CUGexp DMPK”意指包含扩大的CUG重复(CUGexp)的突变的 DMPK RNA。野生型DMPK基因在3′非翻译区中具有5-37个CTG 重复。在“CUGexp DMPK”(例如在肌强直性营养不良I型患者)中，该 数目显著扩大，在（例如）50至超过3,500个的范围内(Harper,肌强 直性营养不良(Saunders,London,ed.3,2001)；Annu.Rev.Neurosci.29： 259,2006；EMBO J.19：4439,2000；Curr Opin Neurol.20：572,2007)。

“稀释剂”意指组合物中缺乏药理学活性但为制药上必需或期望 的成分。例如，注射组合物中的稀释剂可以为液体例如盐溶液。

“DMPK”意指DMPK的任何核酸或蛋白质。DMPK可以为突变 的DMPK，包括CUGexp DMPK核酸。

“DMPK表达”意指从编码DMPK的基因转录的mRNA的水平或 从mRNA翻译的蛋白质的水平。DMPK表达可由本领域已知的方法 （例如Northern或Western印迹法）来测定。

“DMPK核酸”意指任何编码DMPK的核酸。例如，在某些实施 方案中，DMPK核酸包括编码DMPK的DNA序列、从编码DMPK 的DNA(包括包含内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列以 及编码DMPK的mRNA或mRNA前体序列。“DMPK mRNA”意指编 码DMPK蛋白的mRNA。

“剂量”意指单次施用或指定的时期中提供的药物试剂的指定量。 在某些实施方案中，可以以一次、两次或更多次推注(boluses)、片剂 或注射施用剂量。例如，在其中期望皮下施用的某些实施方案中，期 望的剂量需要不易被单次注射容纳的体积，因此，可使用两次或更多 次注射来实现期望的剂量。在某些实施方案中，通过在长期过程中或 连续地输注药物。剂量可表示为每小时、每天、每周或每月的药物试 剂的量。

“有效量”或“治疗有效量”意指足以在需要试剂的个体中实现期 望的生理结果的活性药物试剂的量。取决于待治疗的个体的健康和身 体状况，待治疗的个体的分类群，组合物的制剂，个体医学状况的评 估以及其它相关因素，有效量在个体间可变化。

“完全互补”或“100%互补”意指第一核苷酸的核碱基序列的每一 个核碱基在第二核酸的第二核碱基序列中具有互补核碱基。在某些实 施方案中，第一核酸为反义化合物并且靶核酸为第二核酸。

“空隙聚物(gapmer)”意指其中具有多个支持RNA酶H裂解的核 苷酸的内部区位于具有一个或多个核苷的外侧区之间的嵌合反义化 合物，其中包含内部区的核苷在化学上与包含外侧区的核苷不同。内 部区可称为“空隙区段(gap segment)”,且外侧区可称为“翼区段”。

“增宽的空隙(Gap-widened)”意指具有位于具有1至6个核苷的 5′与3′翼区段之间并且与其紧邻的12个或更多个连续2′-脱氧核糖核 苷的空隙区段的嵌合反义化合物。

“杂交”意指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补核酸 分子包括反义化合物和靶核酸。

“鉴定患有1型肌强直性营养不良的动物”意指鉴定已被诊断患有 1型肌强直性营养不良、病症或病状的动物或鉴定易于发生1型肌强 直性营养不良、病症或病状的动物。例如，具有家族史的个体可易于 患1型肌强直性营养不良、病症或病状。这样的鉴定可利用任何方 法(包括评估个体的医疗史以及标准临床测试或评估)来实现。

“紧邻”意指紧密相邻的成分之间不存在间插成分。

“个体”意指被选择来进行治疗或医治的人或非人动物。

“核苷间连接”是指核苷间的化学键。

“连接的核苷”意指通过核苷间连接键合或连接在一起的相邻核 苷。

“错配”或“非互补核碱基”是指当第一核酸的核碱基不能与第二 或靶核酸的对应核碱基配对时的情况。

“经修饰的核苷间连接”是指天然存在的核苷间键(即磷酸二酯核 苷间键)的替代和来自其的任何改变。

“经修饰的核碱基”是指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿嘧 啶的任何核碱基。“未经修饰的核碱基”意指嘌呤碱腺嘌呤(A)和鸟嘌 呤(G)和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。

“经修饰的核苷酸”意指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核 苷之间的连接或经修饰的核碱基的核苷酸。“经修饰的核苷”意指独立 地具有经修饰的糖部分或经修饰的核碱基的核苷。

“经修饰的寡核苷酸”意指包含至少一个经修饰的核苷酸的寡核 苷酸。

“经修饰的糖”是指天然糖的替代或来自天然糖的改变。

“基序(Motif)”意指反义化合物的化学上不同的区域的模式。

“肌强直”意指在随意收缩或电刺激后肌肉的异常缓慢松弛。

“细胞核核糖核酸酶”意指在细胞核中发现的核糖核酸酶。细胞核 核糖核酸酶包括但不限于RNA酶H（包括RNA酶H1和RN酶H2）、 双链RNA酶drosha和其它双链RNA酶。

“天然存在的核苷间连接”意指3′至5′的磷酸二酯键。

“天然糖部分”意指在DNA(2′-H)或RNA(2′-OH)中发现的糖。

“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括核糖核酸 (RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核 酸(siRNA)和微RNA(miRNA)。核酸还可在单个分子中包含此类成分 的组合。

“核碱基”意指能够与另一个核酸的碱基配对的杂环部分。

“核碱基序列”意指不依赖于任何糖、连接或核碱基修饰的连续核 碱基的顺序。

“核苷”意指连接于糖的核碱基。

“核苷模拟物”包括用于替换寡聚化合物的一个或多个位置上的 糖或糖及碱基以及不一定连接的那些结构，例如具有吗啉代、环己烯 基、环己基、四氢吡喃基、二环或三环糖模拟物例如非呋喃糖单位的 核苷模拟物。

“核苷酸”意指具有共价连接于核苷的糖部分的磷酸基的核苷。

“核苷酸模拟物”包括用于替换寡聚化合物的一个或多个位置上 的核苷和连接的那些结构，例如肽核酸或吗啉代(通过-N(H)-C(=O)-O- 或其它非-磷酸二酯键连接的吗啉代)。

“寡聚化合物”或“寡聚物”意指能够与核酸分子的至少一个区域 杂交的连接的单体亚单位的聚合物。

“寡核苷酸”意指连接的核苷的聚合物，所述每一个核苷可彼此独 立地被修饰或未被修饰。

“胃肠外施用”意指通过注射或输注进行的施用。胃肠外施用包括 皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内 施用（例如鞘内或脑室内施用）。施用可以是连续的或长期的，或短 暂的或间断性的。

“肽”意指通过酰胺键连接至少两个氨基酸形成的分子。肽指多肽 或蛋白质。

“药物组合物”意指适用于给个体施用的物质的混合物。例如，药 物组合物可包含一种或多种活性剂和无菌水溶液。

“药学上可接受的盐”意指反义化合物的生理和药学上可接受的 盐，即保持亲代寡核苷酸的期望的生物活性并且不赋予其不期望的毒 理效应的盐。

“硫代磷酸酯连接”意指核苷之间的连接，其中通过用硫原子替代 非桥键氧原子中的一个修饰的磷酸二酯键。硫代磷酸酯连接是经修饰 的核苷间连接。

“部分”意指核酸的确定数量的连续(即连接的)核碱基。在某些实 施方案中，部分为靶核酸的确定数量的连续核碱基。在某些实施方案 中，部分为反义化合物的确定数量的连续核碱基。

“优先地减少CUG exp DMPK RNA”是指相对于来自正常DMPK 等位基因的RNA转录物，来自CUGexp DMPK等位基因的RNA转 录物的优先减少。

“预防”是指延迟或预先阻止疾病、病症或病状的发作或发展从数 分钟至无限期的一段时间。预防还意指降低发生疾病、病症或病状的 风险。

“前体药物”意指以无活性形式制备的治疗剂，其在体内或其细胞 内通过内源酶或其它化学药品或条件的作用被转化成活性形式。

“副作用”意指可归因于治疗的除期望的效应外的生理反应。在某 些实施方案中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能 异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌病和全身乏力。例如， 血清中氨基转移酶水平升高可表示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红 素增大可表示肝毒性或肝功能异常。

“单链寡核苷酸”意指不与互补链杂交的寡核苷酸。

“可特异性杂交的”意指这样的反义化合物，所述反义化合物在反 义寡核苷酸与靶核酸之间具有足够程度的互补性以诱导期望的作用， 同时在其中期望特异性结合的条件下，即在体内测定和治疗性治疗的 情况下在生理条件下显示对非靶核酸具有最小的作用或无作用。

“剪接病变”意指导致特定组织中改变的剪接产物的表达的一种 或多种RNA的选择性剪接。

“皮下施用”意指就在皮肤下面的施用。

“糖替代物”与略微更广的术语“核苷模拟物”交叠，但意欲表示仅 替代糖单位(呋喃糖环)。本文中提供的四氢呋喃环举例说明了其中呋 喃糖基已被四氢呋喃糖环系统替代的糖替代物的实例。

“靶向”或“被靶向的”意指将与靶核酸特异性杂交并且诱导期望 的作用的反义化合物的设计和选择的方法。

“靶核酸”、“靶RNA”和“靶RNA转录物”全都指能够被反义化合 物靶向的核酸。

“靶区段”意指反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸的序列。“5′ 靶位点”是指靶区段的5′最末端核苷酸。“3′靶位点”是指靶区段的3′ 最末端核苷酸。

“治疗有效量”意指给个体提供治疗益处的试剂的量。

“治疗”是指施用药物组合物以实现疾病的、病症或病状的改变或 改善。

“1型肌强直性营养不良”或“DM1”意指由DMPK的非编码CTG 重复的扩大引起的常染色体显性病症。该突变导致RNA显性，其中 包含扩大的CUG重复(CUGexp)的RNA的表达诱导细胞功能障碍的 过程。CUGexp片段与RNA结合蛋白相作用并且引起突变的转录保 留在细胞核聚集点。该RNA的毒性源于RNA结合蛋白的隔离和信 号转导途径的激活。

“未经修饰的核苷酸”意指由天然存在的核碱基、糖部分和核苷间 连接组成的核苷酸。在某些实施方案中，未经修饰的核苷酸为RNA 核苷酸(即β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即β-D-脱氧核糖核苷)。

某些实施方案

某些实施方案提供了用于抑制DMPK表达的方法、化合物和组 合物。

某些实施方案提供了减少动物中的DMPK表达的方法，包括给 动物施用包含靶向DMPK的经修饰的寡核苷酸的化合物。

某些实施方案提供了优先减少动物中的CUGexp DMPK RNA、 减少动物中的肌强直或减少动物中的剪接病变的方法，包括给动物施 用包含靶向DMPK的经修饰的寡核苷酸的化合物，其中经修饰的寡 核苷酸优先减少动物中的CUGexp DMPK RNA、减少动物中的肌强 直或减少动物中的剪接病变。

某些实施方案提供了施用反义寡核苷酸以通过直接裂解病原性 转录物来抵消RNA显性的方法。

某些实施方案提供了减少Serca1的剪接病变的方法。在某些实 施方案中，本文中提供的方法导致外显子22包含(inclusion)。在某些 实施方案中，校正剪接(corrective splicing)在胫骨前肌、腓肠肌和四头 肌中发生。

某些实施方案提供了减少了m-肌联蛋白的剪接病变的方法。在 某些实施方案中，本文中提供的方法导致外显子5包含。在某些实施 方案中，校正剪接在胫骨前肌、腓肠肌和四头肌中发生。

某些实施方案提供了减少Clcnl的剪接病变的方法。在某些实施 方案中，本文中提供的方法导致外显子7a包含。在某些实施方案中， 校正剪接在胫骨前肌、腓肠肌和四头肌中发生。

某些实施方案提供了减少Zasp的剪接病变的方法。在某些实施 方案中，本文中提供的方法导致外显子11包含。在某些实施方案中， 校正剪接在胫骨前肌、腓肠肌和四头肌中发生。

某些实施方案提供了用于治疗患有1型肌强直性营养不良的动 物的方法，包括：a)鉴定患有1肌强直性营养不良的所述动物，和 b)给所述动物施用治疗有效量的包含靶向DMPK的经修饰的寡核苷 酸的化合物。在某些实施方案中，给动物施用的化合物的治疗有效量 优先减少动物中的CUGexp DMPK RNA、减少动物中的肌强直或减 少动物中的剪接病变。

某些实施方案提供了实现CUGexp DMPK RNA的优先减少的方 法，包括给怀疑患有1型肌强直性营养不良或具有CUGexp DMPK  RNA的受试者施用与所述CUGexp DMPK RNA的非重复区域互补的 经修饰的反义寡核苷酸。当与所述CUGexp DMPK RNA结合时，经 修饰的反义寡核苷酸实现CUGexp DMPK RNA的优先减少。

某些实施方案提供了实现CUGexp DMPK RNA的优先减少的方 法，包括选择患有1型肌强直性营养不良或具有CUGexp DMPK RNA 的受试者以及给所述受试者施用与所述CUGexp DMPK RNA的非重 复区域互补的经修饰的反义寡核苷酸。当结合CUGexp DMPK RNA 时，经修饰的反义寡核苷酸激活核糖核酸或细胞核核糖核酸酶，从而 实现CUGexp DMPK RNA在细胞核中的优先减少。

某些实施方案提供了实现CUGexp DMPK RNA的优先减少的方 法，包括选择患有1型肌强直性营养不良或具有突变的或CUGexp  DMPK RNA的受试者以及给所述受试者全身性施用与所述CUGexp  DMPK RNA的非重复区域互补的经修饰的反义寡核苷酸。当结合突 变的或CUGexp DMPK RNA时，经修饰的反义寡核苷酸实现突变的 或CUGexp DMPK RNA的优先减少。

某些实施方案提供了减少有此需要的受试者的肌强直的方法。方 法包括给受试者施用与DMPK RNA的非重复区域互补的经修饰的反 义寡核苷酸，其中当结合DMPK RNA时，经修饰的反义寡核苷酸激 活核糖核酸酶或细胞核糖核酸酶，从而减少肌强直。在某些实施方案 中，受试者患有或怀疑患有1型肌强直性营养不良或具有突变的 DMPK RNA或CUGexp DMPK RNA。在某些实施方案中，DMPK  RNA被保留在细胞核中。

某些实施方案提供了减少有此需要的受试者的剪接病变的方法。 方法包括给受试者施用与DMPK RNA的非重复区域互补的经修饰的 反义寡核苷酸，其中当结合DMPK RNA时，经修饰的反义寡核苷酸 激活核糖核酸酶或细胞核糖核酸酶，从而减少剪接病变。在某些实施 方案中，受试者患有或怀疑患有1型肌强直性营养不良或具有保留在 细胞核中的CUGexp DMPK RNA。在某些实施方案中，DMPK RNA 被保留在细胞核中。在某些实施方案中，剪接病变为MBNL依赖性 剪接病变。

在某些实施方案中，该方法的经修饰的反义寡核苷酸是嵌合的。 在某些实施方案中，该方法的经修饰的反义寡核苷酸为空隙聚物。

在本文中提供的方法的某些实施方案中，施用是皮下施用。在某 些实施方案中，施用是静脉内施用。

在某些实施方案中，方法的经修饰的反义寡核苷酸靶向DMPK  RNA的非重复区域内的非编码序列。在某些实施方案中，寡核苷酸 靶向突变的DMPK RNA的编码区、内含子、5′UTR或3′UTR。

在本文中提供的方法的某些实施方案中，细胞核核糖核酸酶为 RNA酶H1。

在该方法的某些实施方案中，减少肌肉组织的DMPK RNA。在 某些实施方案中，突变的DMPK RNA CUGexp DMPK RNA优先被减 少。

在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号 NM_001081560.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：1)。在某些实 施方案中，DMPK具有GenBank登录号NT_011109.15所示的从核苷

酸18540696至18555106截断的序列(本文中合为SEQ ID NO：2)。 在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号NT039413.7所示 的从核苷酸16666001至16681000截断的序列(本文中合为SEQ ID  NO：3)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号NM032418.1 所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：4)。在某些实施方案中，DMPK 具有GenBank登录号AI007148.1所示的序列(本文中合为SEQ ID  NO：5)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号AI304033.1 所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：6)。在某些实施方案中，DMPK 具有GenBank登录号BC024150.1所示的序列(本文中合为SEQ ID  NO：7)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号BC056615.1 所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：8)。在某些实施方案中，DMPK 具有GenBank登录号BC075715.1所示的序列(本文中合为SEQ ID  NO：793)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号 BU519245.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：794)。在某些实施 方案中，DMPK具有GenBank登录号CB247909.1所示的序列(本文 中合为SEQ ID NO：795)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank 登录号CX208906.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：796)。在某 些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号CX732022.1所示的序列 (本文中合为SEQ ID NO：797)。在某些实施方案中，DMPK具有 GenBank登录号S60315.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：798)。 在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号S60316.1所示的序 列(本文中合为SEQ ID NO：799)。在某些实施方案中，DMPK具有 GenBank登录号NM_001081562.1所示的序列(本文中合为SEQ ID  NO：800)。在某些实施方案中，DMPK具有GenBank登录号 NM_001100.3所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：801)。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO： 12-156、160-770和774-792的任一个中引用的核碱基序列的至少8 个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，经修饰的寡核苷 酸具有包含SEQ ID NO：12-156、160-770和774-792的任一个中引 用的核碱基序列的至少9、至少10或至少11个连续核碱基的核碱基 序列。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO： 12-156、160-770和774-792的任一个中引用的核碱基序列的至少12 个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸 具有包含SEQ ID NO：12-156、160-770和774-792的任一个中引用 的核碱基序列的至少13个、至少14个连续核碱基的核碱基序列。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO： 12-156、160-770和774-792的任一个中引用的核碱基序列的至少15 个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸 具有包含SEQ ID NO：12-156、160-770和774-792的任一个中引用 的核碱基序列的至少16个或至少17个连续核碱基的核碱基序列。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO： 12-156、160-770和774-792的任一个中引用的核碱基序列的至少18 个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸 具有包含SEQ ID NO：12-156、160-770和774-792的任一个中引用 的核碱基序列的至少19个连续核碱基的核碱基序列。

在某些实施方案中，本文中提供的经修饰的寡核苷酸被靶向SEQ  ID NO：1的下列区域的任一个：1178-1206、2159-2182、2174-2196、 2426-2447、2450-2518、2679-2704和2697-2725。

在某些实施方案中，本文中提供的经修饰的寡核苷酸被靶向SEQ  ID NO1的下列区域的任一个：178-223、232-253、279-299、366-399、 519-541、923-975、1073-1105、1171-1196、1215-1246、1263-1324、 1706-1734、1743-1763、1932-1979、1981-2003、2077-2108和 2152-2173。

在某些实施方案中，本文中提供的经修饰的寡核苷酸被靶向SEQ  ID NO2的下列区域的任一个：1251-1303、1305-1326、1352-1372、 3762-3795、4170-4192、5800-5852、6124-6149、6168-6199、6216-6277、 11979-12007、12016-12036、12993-13042、13044-13066、13140-13171 和3215-13236。

在某些实施方案中，动物为人。

在某些实施方案中，本发明的化合物或组合物被指定为第一试剂 并且本发明的方法还包括第二试剂。在某些实施方案中，共施用第一 试剂和第二试剂；在某些实施方案中，相继地或伴随地共施用第一试 剂和第二试剂。

在某些实施方案中，施用包括胃肠外施用。

在某些实施方案中，化合物为单链经修饰的寡核苷酸。在某些实 施方案中，经修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1-8和 793-801的任一个具有至少95%的互补性，如在所述经修饰的寡核苷 酸的整体上所测量的。在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸的核碱 基序列与SEQ ID NO：1-8和793-801的任一个具有100%的互补性， 如在所述经修饰的寡核苷酸的整体上测量的。

在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间连 接为经修饰的核苷间连接。在某些实施方案中，每一个核苷间连接为 硫代磷酸酯核苷间连接。

在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含 经修饰的糖。在某些实施方案中，至少一个经修饰的糖为二环糖。在 某些实施方案中，至少一个经修饰的糖包含2′-O-甲氧基乙基或 4′-(CH₂)_n-O-2′桥，其中n为1或2。

在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含 经修饰的核碱基。在某些实施方案中，经修饰的核碱基为5-甲基胞嘧 啶。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含：a)由连接的脱氧核 苷组成的空隙区段；b)由连接的核苷组成的5′翼区段；和c)由连接的 核苷组成的3′翼区段。空隙区段位于5′翼区段与3′翼区段之间并且每 一个翼区段的每一个核苷包含经修饰的糖。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含：a)由连接的脱氧核 苷组成的空隙区段；b)由5个连接的核苷组成的5′翼区段；和c)由5 个连接的核苷组成的3′翼区段。空隙区段位于5′翼区段与3′翼区段之 间，每一个翼区段的每一个核苷包含2′-O-甲氧基乙基糖，所述经修 饰的寡核苷酸的每一个核苷间连接为硫代磷酸酯连接，并且所述经修 饰的寡核苷酸的每一个胞嘧啶为5′-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。

某些实施方案提供了优先减少动物中的CUGexp DMPK RNA、 减少动物中的肌强直或减少动物中的剪接病变的方法，包括给动物施 用包含具有由10个连接的脱氧核苷组成的空隙区段、由5个连接的 核苷组成的5′翼区段和由5个连接的核苷组成的3′翼区段的经修饰的 寡核苷酸的化合物。空隙区段位于5′翼区段与3′翼区段之间，每一个 翼区段的每一个核碱基包含2’-O-甲氧基乙基糖，所述经修饰的寡核 苷酸的每一个核苷间连接为硫代磷酸酯连接，所述经修饰的寡核苷酸 中的每一个胞嘧啶为5′-甲基胞嘧啶。

某些实施方案提供了本文中描述的任何化合物在药剂的制造中 的用途，所述药剂用于本文中描述的任何治疗法。例如，某些实施方 案提供了本文中描述的化合物用于制造用于治疗、改善或或预防1型 肌强直性营养不良的药剂的用途。某些实施方案提供了本文中描述的 化合物用于制造用于抑制DMPK的表达以及治疗、预防、延迟或改 善DMPK相关疾病和/或其症状的药剂的用途。某些实施方案提供了 本文中描述的化合物用于制造用于减少动物中的DMPK表达的药剂 的用途。某些实施方案提供了本文中描述的化合物用于制造用于优先 减少动物中的CUGexp DMPK、减少动物中的肌强直或减少动物中的 剪接病变的药剂的用途。某些实施方案提供了本文中描述的化合物用 于制造用于治疗患有1肌强直性营养不良的动物的药剂的用途。某些 实施方案提供了本文中描述的化合物用于制造药剂的用途，所述药剂 用于治疗、预防、延迟或改善与DM1的发展相关的病症和结果包括 肌肉僵硬、肌强直、远端肢体无力、面部肌肉和颚肌无力、吞咽困难、 举抬无力(上睑下垂)、颈肌无力、手臂和腿部肌肉无力、持久性肌肉 疼痛、嗜睡症、肌萎缩、咽下困难、呼吸功能不全、心律不齐、心肌 损伤、情感淡漠、胰岛素抗药性和白内障。某些实施方案提供了本文 中描述的化合物用于制造用于通过直接裂解病原性转录物来抵消 RNA显性的药剂的用途。

某些实施方案提供了用于治疗、预防或改善本文中描述的1型肌 强直性营养不良的试剂盒，其中试剂包括：a)本文中描述的化合物； 和任选地b)本文中描述的另外的试剂或疗法。该试剂盒还可包括使用 试剂盒治疗、预防或改善I型肌强直性营养不良的说明书或标签。

某些实施方案提供了用于本文中描述的任何治疗法的本文中描 述的任何化合物或组合物。例如，某些实施方案提供了本文中描述的 用于抑制DMPK的表达以及治疗、预防、延迟或改善DMPK相关疾 病和/或其症状的化合物或组合物。某些实施方案提供了本文中描述 的用于减少动物中的DMPK表达的化合物或组合物。某些实施方案 提供了本文中描述的用于优先减少动物中的CUGexp DMPK、减少动 物中的肌强直或减少动物中的剪接病变的化合物或组合物。某些实施 方案提供了本文中描述的用于治疗患有1型肌强直性营养不良的动 物中的化合物或组合物。某些实施方案提供了本文中描述的用于治 疗、预防、延迟或改善与DM1的发展相关的症状和结果的化合物或 组合物，所述症状或结果包括肌肉僵硬、肌强直、远端肢体无力、面 部肌肉和颚肌无力、吞咽困难、举抬无力(上睑下垂)、颈肌无力、手 臂和腿部肌肉无力、持久性肌肉疼痛、嗜睡症、肌萎缩、咽下困难、 呼吸功能不全、心律不齐、心肌损伤、情感淡漠、胰岛素抗药性和白 内障。。某些实施方案提供了本文中描述的用于通过指导病原性转录 物的裂解来抵消RNA显性的化合物或组合物。某些实施方案提供了 由12至30个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸，其具有包含SEQ  ID NO：12-156、160-770和774-792的核碱基序列的任一个的至少 12个连续核碱基的核碱基序列。

还提供了可用于本文中描述的方法的其它化合物。

例如，某些实施方案提供了包含由10至80、12至50、12至30、 15至30、18至24、19至22或20个连接的核苷组成的经修饰的寡 核苷酸的化合物，所述经修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：41、 44、76、109、153、320、321、322、325、329、335和657的核碱 基序列的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至 少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19个 连续核碱基的核碱基序列。

某些实施方案提供了包含由10至80、12至50、12至30、15至 30、18至24、19至22或20个连接的核苷的经修饰的寡核苷酸的化 合物，所述经修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：15、73、77、79、 83、85、130、602、648、655、674和680的核碱基序列的任一个的 至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至 少15、至少16、至少17、至少18或至少19个连续核碱基的核碱基 序列。

某些实施方案包含由10至80、12至50、12至30、15至30、 18至24、19至22或20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸的化 合物，所述经修饰的寡核苷酸具有包含与等长度的SEQ ID NO：1的 664-683、773-792、926-945、927-946、928-947、931-950、935-954、 941-960、2089-2108、2163-2182、2490-2509、2499-2518、2676-2695、 2685-2704、2676-2695、2688-2707、2697-2716、2764-2783和2770-2789 的核碱基的部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、 至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19 或更多个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中核碱基序列与SEQ  ID NO：1互补。

某些实施方案提供了包含由10至80、12至50、12至30、15至 30、18至24、19至22或20个连接的核苷组成的经修饰的寡核苷酸 的化合物，所述经修饰的寡核苷酸具有包含与等长度的SEQ ID NO： 2的812-831、3629-3648、4447-4466、4613-4632、5803-5822、 5804-5823、5805-5824、5808-5827、5818-5837、6794-6813、 12463-12482、13152-13171和13553-13572的核碱基的部分互补的至 少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少 15、至少16、至少17、至少18或至少19或更多个连续核碱基的部 分的核碱基序列，其中核碱基序列与SEQ ID NO：2互补。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸为单链寡核苷酸。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID  NO：1-8和793-801的任一个具有至少70%、至少75%、至少80%、 至少85%、至少90%、至少95%或100%的互补性。

在某些实施方案中，至少一个核苷间连接为经修饰的核苷间连 接。

在某些实施方案中，每一个核苷间连接为硫代磷酸酯核苷间连 接。

在某些实施方案中，至少一个核苷包含经修饰的糖。

在某些实施方案中，至少一个经修饰的糖为二环糖。

在某些实施方案中，至少一个经修饰的糖包含2′-O-甲氧基乙基。

在某些实施方案中，至少一个核苷包含经修饰的核苷。

在某些实施方案中，经修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含：

由连接的脱氧核苷组成的空隙区段；

由连接的核苷组成的5′翼区段；和

由连接的核苷组成的3′翼区段；

其中空隙区段位于5′翼区段与3′翼区段之间，并且其中每一个翼 区段的每一个核苷包含经修饰的糖。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含：

由10个连接的脱氧核苷组成的空隙区段；

由5个连接的核苷组成的5′翼区段；

和由5个连接的核苷组成的3′翼区段；

其中空隙区段位于5′翼区段与3′翼区段之间，其中每一个翼区段 的每一个核苷包含2′-O-甲氧基乙基糖；并且其中每一个核苷间连接 为硫代磷酸酯连接。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸由14个连接的核苷组成。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。

在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。

反义化合物

寡聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、 寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸和siRNA。寡聚化合物 对于靶核酸可以是“反义的”，意指能够通过氢键合与靶核酸进行杂 交。

在某些实施方案中，反义化合物具有核碱基序列，当以5′至3′ 方向书写时，所述序列包含其靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序 列。在某些此类实施方案中，反义寡核苷酸具有核碱基序列，当以 5′至3′方向书写时，所述序列包含其靶向的靶核酸的靶区段的反向互 补序列。

在某些实施方案中，本文中描述的靶向DMPK的反义化合物在 长度上为10至30个核苷酸。换句话说，反义化合物在一些实施方 案中为10至30个连接的核碱基。在其它实施方案中，反义化合物包 含由8至80、10至80、12至30、12至50、15至30、18至24、19 至22或20个连接的核碱基组成的经修饰的寡核苷酸。在某些此类实 施方案中，反义化合物包含由在长度上为8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79或80个或由任何两个上述值确定的范围内 的连接的核碱基组成的经修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，具有 这些长度的任一个的反义化合物包含本文中描述的示例性反义化合 物的任一个的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少 12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少 19个连续核碱基(例如SEQ ID NO：12-156、160-770和774-792的任 一个中引用的核碱基序列的至少8个连续核碱基。

在某些实施方案中，反义化合物包含更短或截断的经修饰的寡核 苷酸。该更短或截断的经修饰的寡核苷酸可从5′末端(5′截断)，或可 选择地从3′末端(3′截断)缺失单个核苷。该缩短的或截断的寡核苷酸 可从5′末端缺失两个核苷，或可选择地可从3′末端缺失两个亚单位。 或者，缺失的核苷可分散在整个经修饰的寡核苷酸中，例如在从5′ 末端缺失一个核苷并且从3′末端缺失一个核苷的反义化合物中。

当单个额外核苷存在于延长的寡核苷酸中时，该额外核苷可位于 寡核苷酸的5′或3′末端。当两个或更多个额外核苷存在时，添加的 核苷可彼此相邻，例如在具有添加至寡核苷酸的5′末端(5′添加)或可 选择地添加至3′末端(3′添加)的两个核苷的寡核苷酸中。或者，添加 的核苷可分散在整个反义化合物中，例如在具有添加至5′末端的一个 核苷和添加至3′末端的一个亚单位的寡核苷酸中。

可能增加或减少反义化合物（例如反义寡核苷酸）的长度和/或 引入错配碱基而不消除活性。例如，在Woolf等人(Proc.Natl.Acad.Sci. USA89:7305-7309,1992)中，在卵母细胞注射模型中测试一系长度为 13-25个核碱基的反义寡核苷酸的诱导靶RNA的裂解的能力。在反 义寡核苷酸的末端附近具有8或11个错配的长度为25个核碱基的反 义寡核苷酸能够指导靶mRNA的特异性裂解，虽然程度不如不包含 错配的反义寡核苷酸。类似地，使用13个核碱基的反义寡核苷酸(包 括1或3个错配的反义寡核苷酸)实现靶特异性裂解。

Gautschi等人(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471,2001年3月)显示了 与bcl-2mRNA具有100%的互补性并且与bcl-xL mRNA具有3个错 配的寡核苷酸在体外和体内减少bcl-2和bcl-xL的表达的能力。此外， 该寡核苷酸显示高效的体内抗肿瘤活性。

Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)在兔网织红 细胞测定测试了一系列串联的14个核碱基的反义寡核苷酸，以及分 别由两个或三个串联的反义寡核苷酸的序列组成的28和42个核碱基 的反义寡核苷酸的阻止人DHFR的翻译的能力。3种14个核碱基的 反义寡核苷酸的每一种单独地能够抑制翻译，虽然在比28或42个核 碱基的反义寡核苷酸更适中的水平上。

反义化合物基序

在某些实施方案中，靶向DMPK核酸的反义化合物具有以赋予 反义化合物性质（例如增强的抑制活性、增加的对靶核酸的结合亲合 力或对由体内核酸酶产生的降解的抗性）的模式或基序排列的经化学 修饰的亚单位。

嵌合反义化合物通常包含经修饰以赋予增强的对核酸酶降解的 抗性、增加的细胞吸收、增强的对靶核酸的结合亲合力和/或增强的 抑制活性的至少一个区域。嵌合反义化合物的第二区域可任选地用作 细胞内切核酸酶RNA酶H的底物，该酶裂解RNA:DNA双链体的 RNA链。

具有空隙聚物基序的反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在空 隙聚物中，具有多个支持RNA酶H裂解的核苷酸的内部区位于具有 多个在化学上与内部区的核苷不同的核苷酸的外侧区之间。在具有空 隙聚物基序的反义寡核苷酸的情况下，空隙区段通常用作内切核酸酶 裂解的底物，同时翼区段包含经修饰的核苷。在某些实施方案中，空 隙聚物的区域通过包含每一个不同区域的糖部分的类型来区别。用于 区别空隙聚物的区域的糖部分的类型可在一些实施方案中包括β-D- 核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2′-修饰的核苷(例如除其它以外，2′- 修饰的核苷可包括2′-MOE和2′-O-CH₃)和双环糖修饰的核苷(此类双 环糖修饰的核苷可包含具有4′-(CH₂)_n-O-2′桥的修饰的核苷，其中n=l 或n=2)。优选，每一个不同的区域包含一致的糖部分。翼-空隙-翼基 序(wing-gap-wing motif)经常被描述为“X-Y-Z”，其中“X”代表5′翼区 域的长度，“Y”代表空隙区域的长度，而“Z”代表3′翼区域的长度。如 本文中所使用的，描述为“X-Y-Z”的空隙聚物具有如此的构型以使空 隙区段紧邻5′翼区段和3′翼区段的每一个。因此，在5′翼区段和空隙 区段、或空隙区段与3′翼区段之间不存在间插核苷酸。本文中描述的 的反义化合物的任一种可具有空隙聚物基序。在一些实施方案中，X 和Z是相同的，在其它实施方案中，它们是不同的。在优选实施方案 中，Y为8至15个核苷酸。X、Y或Z可为1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或 更多个核苷酸的任一个。因此，空隙聚物包括但不限于例如5-10-5、 4-8-4、4-12-3、4-12-4、3-14-3、2-13-5、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、 1-10-1、2-8-2、6-8-6、5-8-5、1-8-1或2-6-2。

在某些实施方案中，为“翼聚物(wingmer)”基序的反义化合物具有 翼-空隙或空隙-翼构型，即如上文中对于空隙聚物构型所描述的X-Y 或Y-Z构型。因此，翼聚物构型包括但不限于例如5-10、8-4、4-12、 12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13或5-13。

在某些实施方案中，靶向DMPK核酸的反义化合物具有5-10-5 空隙聚物基序列。

在某些实施方案中，靶向DMPK核酸的反义化合物具有增宽的 空隙(gap-widened)的基序。

在某些实施方案中，这些空隙聚物或翼聚物基序的任一种的反义 化合物包含本文中描述的示例性反义化合物的任一种的核碱基序列 的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、 至少15、至少16、至少17、至少18或至少19个连续核碱基(例如， SEQ ID NO：12-156、160-770和774-792的任一个中引用的核碱基序 列的至少8个连续核碱基。

靶核酸、靶区域和核苷酸序列

编码DMPK的核苷酸序列包括但不限于下列序列，如GenBank 登录号NM_001081560.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：1)、 GenBank登录号NT_011109.15所示的从核苷酸18540696至18555106 截断的序列(本文中合为SEQ ID NO：2)、GenBank登录号 NT_039413.7所示的从核苷酸16666001至16681000截断的序列(本 文中合为SEQ ID NO：3)、GenBank登录号NM_032418.1所示的序 列(本文中合为SEQ ID NO：4)、GenBank登录号AI007148.1所示的 序列(本文中合为SEQ ID NO：5)、GenBank登录号AI304033.1所示 的序列(本文中合为SEQ ID NO：6)、GenBank登录号BC024150.1所 示的序列(本文中合为SEQ ID NO：7)、GenBank登录号BC056615.1 所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：8)、GenBank登录号BC075715.1 所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：793)、GenBank登录号 BU519245.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：794)、GenBank登 录号CB247909.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：795)、GenBank 登录号CX208906.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO：796)、 GenBank登录号CX732022.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO： 797)、GenBank登录号S60315.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO： 798)、GenBank登录号S60316.1所示的序列(本文中合为SEQ ID NO： 799)、GenBank登录号NM_001081562.1所示的序列(本文中合为SEQ  ID NO：800)和GenBank登录号NM_001100.3所示的序列(本文中合 为SEQ ID NO：801)。应理解本文中包含的实例中的每一个SEQ ID  NO所示的序列不依赖于对糖部分、核苷间连接或核碱基的任何修饰。 这样，由SEQ ID NO定义的反义化合物可独立地包含一个或多个对 糖部分、核苷间连接或核碱基的修饰。由Isis号(Isis No)描述的反义 化合物表示核碱基序列和基序的组合。

在某些实施方案中，靶区域为靶核酸的结构上确定的区域。例如， 靶区域可包括3′UTR、5′UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接 合处、编码区、翻译起始区、翻译终止区或其它确定的核酸区。DMPK 的结构上确定的区域可通过登录号从序列数据库（例如NCBI）获得 并且这样的信息通过引用并入本文。在某些实施方案中，靶区域可包 括从靶区域内的一个靶区段的5′靶位点至靶区域内的另一个靶区段 的3′靶位点的序列。

靶向包括反义化合物与其杂交(以便期望的作用发生)的至少一 个靶区段的确定。在某些实施方案中，该期望的作用为mRNA靶核 酸水平的降低。在某些实施方案中，该期望的作用为由靶核酸编码的 蛋白质水平的降低或与靶核酸相关的表型改变。

靶区域可包含一个或多个靶区段。靶区域内的多个靶区段可重叠 的。或者，它们可以是非重叠的。在某些实施方案中，靶区域内的靶 区段被不超过约300个核苷酸分隔。在某些实施方案中，靶区域内的 靶区段被靶核酸上为、约为、不超过、不超过约250、200、150、100、 90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸分隔，或在由任何 两个上述值确定的范围内的许多核苷酸分隔。在某些实施方案中，靶 区域内的靶区段被靶核酸上不超过、或不超过约5个核苷酸分隔。在 某些实施方案中，靶区段为连续的。考虑由具有为本文中所列的5′ 靶位点或3′靶位点中的任一个的起始核酸的范围确定的靶区域。

适当的靶区段可见于5′UTR、编码区、3′UTR、内含子、外显子 或内含子/外显子接合处内。包含起始密码子或终止密码子的靶区段 也是适当的靶区段。适当的靶区段可特别地不包括某些结构上确定的 区域（例如起始密码子或终止密码子）。

适当的靶区段的确定可包括靶核酸的序列与整个基因组上的其 它序列的比较。例如，BLAST算法可用于鉴定在不同核酸间具有相 似性的区域。该比较可防止选择可以以非特异性方式与除了选择的靶 核酸外的核酸(即，非靶或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。

在活性靶区域内可存在反义化合物的活性的变化(例如，如通过 靶核酸水平的百分比降低确定的)。在某些实施方案中，DMPK mRNA 水平的降低表示DMPK蛋白表达的抑制。DMPK蛋白质水平的降低 也表示靶mRNA表达的抑制。此外，表型改变（例如减少肌强直或 减少剪接病变）可表示DMPK mRNA和/或蛋白质表达的抑制。

杂交

在一些实施方案中，杂交在本文中公开的反义化合物与DMPK 核酸之间发生。杂交的最常见机制包括核酸分子的互补核碱基之间的 氢键合(例如，沃尔森-克里克、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合)。

杂交可在不同条件下发生。严格条件为序列依赖性的并且由待杂 交的核酸的性质和组成确定。

确定序列是否可与靶核酸特异性杂交的方法在本领域是公知的 (Sambrooke和Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第3 版,2001)。在某些实施方案中，本文中提供的反义化合物可与DMPK 核酸特异性杂交。

互补性

当反义化合物的充足数量的核碱基可与靶核酸的相应核碱基氢 键合，以便期望的作用发生(例如，靶核酸（例如DMPK核酸）的反 义抑制)时，反义化合物和靶核酸是彼此互补的。

反义化合物可在DMPK核酸的一个或多个区段上杂交，以便间 插或相邻区段不参与杂交事件(例如，环结构、错配或发夹结构)。

在某些实施方案中，本文中提供的反义化合物或其指定的部分与 DMPK核酸、其靶区域、靶区段或其指定的部分具有或具有至少70%、 80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%的互补性。在某些实施方案中， 反义化合物与DMPK核酸、其靶区域、靶区段或指定的部分具有至 少70%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、 至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的互 补性，并且包含本文中描述的示例性反义化合物的任一个的核碱基序 列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、 至少15、至少16、至少17、至少18或至少19个连续核碱基(例如， SEQ ID NO：12-156、160-770和774-792的任一个中引用的核碱基序 列的至少8个连续核碱基)。反义化合物与靶核酸的百分比互补性可 使用常规方法来测定，并且在反义化合物的整体上进行测量。

例如，其中反义化合物中的20个核碱基的18个与靶区域互补并 且从而可与其特异性杂交的反义化合物可代表90%的互补性。在该实 例中，可将其余的非互补核碱基集簇或分散在互补核碱基中，并且彼 此之间或与互补核碱基之间不必连续。这样，在长度上为18个核碱 基的具有4(四)个非互补核碱基(所述非互补核碱基的侧翼连接有两个 与靶核酸完全互补的区域)的反义化合物可与靶核酸具有77.8%的总 体互补性，从而落在本发明的范围内。反义化合物与靶核酸的区域的 百分比互补性可使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索 工具)和PowerBLAST程序(Altschul等人，J.Mol.Biol.,1990,215,403  410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649656)来常规地测定。 百分比同源性、序列同一性或或互补性可利用（例如）Gap程序 (Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix，Genetics  Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)，使用缺省设 置来测定，所述程序使用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math., 1981,2,482-489)。

在某些实施方案中，本文中提供的反义化合物或其指定的部分与 靶核酸或其指定的部分完全互补(即，100%互补)。例如，反义化合物 可与DMPK核酸、其靶区域或靶区段或靶序列完全互补。如本文中 所用，“完全互补”意指反义化合物的每一个核碱基能够与靶核酸的相 应核碱基精确碱基配对。例如，20个核碱基的反义化合物与400个 核碱基长的靶序列完全互补，只要存在与反义化合物完全互补的靶核 酸的相应的20个核碱基部分。完全互补还可用于第一和/或第二核酸 的指定的部分。例如，30个核碱基的反义化合物的20个核碱基的部 分可与400个核碱基长的靶序列“完全互补”。30个核碱基的寡核苷酸 的20个核碱基的部分与靶序列完全互补，如果靶序列具有其中每一 个核碱基与反义化合物的20个核碱基的部分互补的话。同时，全部 30个核碱基的反义化合物可与靶序列互补，这取决于反义化合物的 其余10个核碱基也与靶序列互补。

非互补核碱基的位置可位于反义化合物的5′末端或3′末端。或者， 非互补核碱基或核碱基可位于反义化合物的内部位置。当两个或更多 个非互补核碱基存在时，它们可以是连续的(即，连接的)或非连续的。 在一个实施方案中，非互补核碱基位于空隙聚物反义寡核苷酸的翼区 段中。

在某些实施方案中，在长度上为或达到10、12、13、14、15、 16、17、18、19或20个核碱基的反义化合物相对于靶核酸（例如 DMPK核酸或其指定的部分）包含不超过4个、不超过3个、不超过 2个或不超过1个非互补核碱基。

在某些实施方案中，在长度上为或达至10、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30 个核碱基的反义化合物相对于靶核酸（例如DMPK核酸或其指定的 部分）包含不超过6个，不超过5个，不超过4个，不超过3个，不 超过2个或不超过1个非互补核碱基。

本文中提供的反义化合物还包括与靶核酸的部分互补的反义化 合物。如本文中所用，“部分”是指靶核酸的区域或区段内确定数目的 连续(即连接的)核碱基。“部分”还可指反义化合物的确定数目的连续 核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少8个核碱基 的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少10个 核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少 15个核碱基的部分互补。还考虑与靶区段的至少8、至少9、至少10、 至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、 至少18、至少19、至少20或更多个核碱基的部分或在由这些值的任 何两个确定的范围内的部分互补的反义化合物。

同一性

本文中提供的反义化合物还可具有与特定核苷酸序列SEQ ID  NO或由特定Isis编号表示的化合物或其部分具有确定的百分比同一 性。如本文中所用，如果其具有相同核碱基配对能力，则反义化合物 与本文中公开的序列具有同一性。例如，包含替代公开的DNA序列 中的胸苷的尿嘧啶的RNA可被认为与DNA序列具有同一性，因为 尿嘧啶和胸苷都与腺嘌啶配对。还考虑本文中公开的反义化合物的缩 短的和延长的形式以及相对于本文中提供的反义化合物具有非同一 碱基的的化合物。非同一碱基可彼此相邻或分散在整个反义化合物 中。根据相对于与其比较的序列具有同一碱基配对的碱基的数目计算 反义化合物的百分比同一性。

在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文中公开的一个或 多个示例性反义化合物或SEQ ID NO或其部分具有至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至 少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性。

修饰

核苷是碱基-糖的组合。核苷的核碱基(也称为碱基)部分通常为杂 环碱基部分。核苷酸为还包括共价地连接于核苷的糖部分的磷酸基团 的核苷。对于包括戊呋喃糖基糖、磷酸基团的那些核苷可连接于糖的 2′、3′或5′羟基部分。寡核苷酸通过相邻核苷的彼此共价连接(以形成 线性多聚寡核苷酸)形成。在寡核苷酸结构内，磷酸基团通常称为形 成寡核苷酸的核苷间连接。

对反义化合物的修饰包括对核苷间连接、糖部分或核碱基的转换 或改变。经修饰的反义化合物通常因期望的性质（例如增强的细胞吸 收、增强的对核酸靶的亲合力、增强在核酸酶存在的情况下的稳定性 或增强的抑制活性）而优于天然形式。

经化学修饰的核苷还可用于增强缩短的或截断的反义寡核苷酸 对于其靶核酸的结合亲合力。因此，通常可利用具有这样经化学修饰 的的核苷的更短的反义化合物来获得可比较的结果。

经修饰的核苷间连接

RNA和DNA的天然存在的核苷间连接为3′至5′磷酸二酯连接。 因期望的性质（例如增强的细胞吸收、增强的对靶核酸的亲合力以及 增强的在核酸酶存在的情况下的稳定性）的原因，通常优先于具有天 然存在的核苷间连接的反义化合物选择具有一个或多个经修饰的（即 非天然存在的）核苷间连接的反义化合物。

具有经修饰的核苷间连接的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间 连接以及不具有磷原子的核苷间连接。代表性含磷核苷间连接包括但 不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。 制备含磷和非含磷连接的方法是公知的。

在某些实施方案中，靶向DMPK核酸的反义化合物包含一个或 多个经修饰的核苷间连接。在某些实施方案中，经修饰的核苷间连接 为硫代磷酸酯连接。在某些实施方案中，反义化合物的每一个核苷间 连接为硫代磷酸酯核苷间连接。

经修饰的糖部分

本发明的反义化合物可任选地包含一个或多个其中糖基团已被 修饰的核苷。此类糖修饰的核苷可赋予反义化合物增强的核酸酶稳定 性、增强的结合亲合力或一些其它有益的生物性质。在某些实施方案 中，核苷包含经化学修饰的呋喃核糖环部分。经化学修饰的呋喃核糖 环的实例包括但不限于取代基团的添加(包括5′和2′取代基、形成二 环核酸(BNA)的非成对环原子的桥连、S、N(R)或C(R₁)(R₂)(R，R₁和 R₂各自独立地为H、C₁-C₁₂烷基或保护基团)对核糖基环的氧原子的 替代及其组合。经化学修饰的糖的实例包括2′-F-5′-甲基取代的核苷 (关于其它公开的5′,2′-双取代核苷，参见于8/21/08公开的PCT国际 申请WO2008/101157)或S对核糖基环的氧原子的取代以及2′-位置 上的其它取代(参见2005年1月16日公开的美国专利申请 US2005-0130923公开)或可选择地BNA的5′-取代(参见11/22/07公开 的PCT国际申请WO2007/134181，其中LNA被例如5′-甲基或5′- 乙烯基取代)。

具有经修饰的糖部分的核苷实例包括但不限于包含5′-乙烯基、 5′-甲基(R或S)、4′-S、2′-F、2′-OCH₃、2′-OCH₂CH₃、2′-OCH₂CH₂F 和2′-O(CH₂)₂OCH₃取代基的核苷。2′位置上的取代基还可选自烯丙 基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C₁-C₁₀烷基、OCF₃、OCH₂F、 O(CH₂)₂SCH₃、O(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)、O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n)和 O-CH₂-C(=O)-N(R₁)-(CH₂)₂-N(R_m)(R_n)、其中每一个R₁、R_m和R_n独立 地为H或取代的或未取代的C₁-C₁₀烷基。

二环核酸(BNA)的实例包括但不限于包含4′与2′核糖基环原子之 间的桥的核苷。在某些实施方案中，本文中提供的反义化合物包括一 个或多个BNA核苷，其中桥包含下式中的一个：4′-(CH₂)-O-2′(LNA)； 4′-(CH₂)-S-2′；4′-(CH₂)₂-O-2′(ENA)；4′-CH(CH₃)-O-2′和 4′-CH(CH₂OCH₃)-O-2′(及其类似物，参见2008年7月15日颁布的美 国专利7,399,845)；4′-C(CH₃)(CH₃)-O-2′(及其类似物，参见公开为 WO/2009/006478的PCT/US2008/068922，2009年1月8日公开)； 4′-CH₂-N(OCH₃)-2′(及其类似物，参见公开为WO/2008/150729的 PCT/US2008/064591，2008年12月11日公开)；4′-CH₂-O-N(CH₃)-2′(参 见公开的美国专利申请US2004-0171570，2004年9月2公开)； 4′-CH₂-N(R)-O-2′，其中R为H、C₁-C₁₂烷基或保护基团(参见2008年 9月23日颁布的美国专利7,427,672)；4′-CH₂-C(H)(CH₃)-2′(参见 Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和 4′-CH₂-C(=CH₂)-2′(及其类似物，参见公开为WO2008/154401的 PCT/US2008/066154，2008年12月8日公开)。

其它二环核苷已在公开的文献中进行了报导(参见例如， Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc,2007,129(26)8362-8379；Frieden 等人，Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372；Elayadi等人，Curr. Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人，Chem.Biol., 2001,8,1-7；Orum等人，Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243； Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638； Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人， Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem. Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63, 10035-10039；美国专利号：7,399,845；7,053,207；7,034,133；6,794,499； 6,770,748；6,670,461；6,525,191；6,268,490；美国专利公开号： US2008-0039618；US2007-0287831；US2004-0171570；美国专利申 请系列号：12/129,154；61/099,844；61/097,787；61/086,231；61/056,564； 61/026,998；61/026,995；60/989,574；国际申请WO2007/134181； WO2005/021570；WO2004/106356；WO94/14226；和PCT国际申 请号：PCT/US2008/068922；PCT/US2008/066154和 PCT/US2008/064591)。前述二环核苷的每一种可经制备具有一个或多 个立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见 1999年3月25日公开为WO99/14226的PCT国际申请 PCT/DK98/00393)。

在某些实施方案中，二环核苷包含戊呋喃糖基糖部分的4′与2′ 碳原子之间的桥，包括但不限于包含1个或1至4个连接的基团的桥， 所述基团独立地选自-[C(R_a)(R_b)]_n-、-C(R_a)=C(R_b)-、-C(R_a)=N-、 -C(=NR_a)-、-C(=O)-、-C(=S)-、-O-、-Si(R_a)₂-、-S(=O)_x-和-N(R_a)-；其 中：x为0、1或2；n为1、2、3或4；每一个R_a和R_b独立地为H、 保护基团、羟基、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取 代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、取 代的C₅-C₂₀芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、 C₅-C₇脂环基、取代的C₅-C₇脂环基、卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、 COOJ₁、酰基(C(=O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(=O)₂-J₁)或增效 砜(S(=O)-J₁)；并且

每一个J₁和J₂独立地为H、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、 C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、 C₅-C₂₀芳基、取代的C₅-C₂₀芳基、酰基(C(=O)-H)、取代的酰基、杂 环基、取代的杂环基、C₁-C₁₂氨基烷基、取代的C₁-C₁₂氨基烷基或保 护基团。

在某些实施方案中，二环糖部分的桥为-[C(R_a)(R_b)]_n-、 -[C(R_a)(R_b)]_n-O-、-C(R_aR_b)-N(R)-O-或-C(R_aR_b)-O-N(R)-。在某些实施 方案中，桥为4′-CH₂-2′、4′-(CH₂)₂-2′、4′-(CH₂)₃-2′、4′-CH₂-O-2′、 4′-(CH₂)₂-O-2′、4′-CH₂-O-N(R)-2′和4′-CH₂-N(R)-O-2-，其中每一个R 独立地为H、保护基团或C₁-C₁₂烷基。

在某些实施方案中，二环核苷还通过异构构型来确定。例如，包 含4′-(CH₂)-O-2′桥的核苷可以α-L构型或以β-D构型存在。先前，α-L- 亚甲基氧(4′-CH₂-O-2′)BNA已被并入显示反义活性的反义寡核苷酸 中(Frieden等人，Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。

在某些实施方案中，二环核苷包括具有4′至2′桥的那些二环核苷， 其中此类桥包括但不限于α-L-4′-(CH₂)-O-2′、β-D-4′-CH₂-O-2′、 4′-(CH₂)₂-O-2′、4′-CH₂-O-N(R)-2′、4′-CH₂-N(R)-O-2′、4′-CH(CH₃)-O-2′、 4′-CH₂-S-2′、4′-CH₂-N(R)-2′、4′-CH₂-CH(CH₃)-2′和4′-(CH₂)₃-2′，其中 R为H、保护基团或C₁-C₁₂烷基。

在某些实施方案中，二环核苷具有式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

-Q_a-Q_b-Q_c-为-CH₂-N(R_c)-CH₂-、-C(=O)-N(R_c)-CH₂-、 -CH₂-O-N(R_c)-、-CH₂-N(R_c)-O-或-N(R_c)-O-CH₂。

R_c为C₁-C₁₂烷基或氨基保护基团；和

T_a和T_b各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性 磷基团、磷部分或至载体介质的共价附着。

在某些实施方案中，二环核苷具有式：

其中:

Bx为杂环碱基部分；

T_a和T_b各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性 磷基团、磷部分或至载体介质的共价附着；

Z_a为C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、取代的C₁-C₆烷基、 取代的C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆炔基、酰基、取代的酰基、取代的 酰胺、巯基或取代的巯基。

在一个实施方案中，用独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ_c、NJ_cJ_d、 SJ_c、N₃、OC(=X)J_c和NJ_eC(=X)NJ_cJ_d的取代基团独立地单取代或多取 代每一个取代基团，其中每一个J_c、J_a和J_e独立地为H、C₁-C₆烷基 或取代的C₁-C₆烷基并且X为O或NJ_c。

在某些实施方案中，二环核苷具有下式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T_a和T_b各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性 磷基团、磷部分或至载体介质的共价附着；

Z_b为C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、取代的C₁-C₆烷基、 取代的C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆炔基或取代的酰基(C(=O)-)。

在某些实施方案中，二环核苷具有式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T_a和T_b各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性 磷基团、磷部分或至载体介质的共价附着；

R_d为C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或取代的C₂-C₆炔基；

每一个q_a、q_b、q_c和q_d独立地为H、卤素、C₁-C₆烷基、取代的 C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或取代的C₂-C₆炔基、C₁-C₆烷氧基、取代的C₁-C₆烷氧基、酰基、取代的酰基、C₁-C₆氨基烷基或取代的C₁-C₆氨基烷基；

在某些实施方案中，二环核苷具有下式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T_a和T_b各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性 磷基团、磷部分或至载体介质的共价附着；

q_a、q_b、q_e和q_f各自独立地为氢、卤素、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₂-C₁₂烷氧基、取代的C₁-C₁₂烷氧基、OJ_j、SJ_j、SOJ_j、SO₂J_j、 NJ_jJ_k、N₃、CN、C(=O)OJ_j、C(=O)NJ_jJ_k、C(=O)J_j、O-C(=O)NJ_jJ_k、 N(H)C(=NH)NJ_jJ_k、N(H)C(=O)NJ_jJ_k或N(H)C(=S)NJ_jJ_k；

或q_e和q_f一起为=C(q_g)(q_h)；

q_g和q_h各自独立地为H、卤素、C₁-C₁₂烷基或取代的C₁-C₁₂烷基。

具有4′-CH₂-O-2′桥的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、 胸腺嘧啶和尿嘧啶二环核苷的合成和制备以及它们的寡聚化和核酸 识别性质已进行了描述(Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54, 3607-3630)。二环核苷的合成也已描述于WO98/39352和WO 99/14226中。

具有4′至2′桥连基团（例如4′-CH₂-O-2′和4′-CH₂-S-2′）的各种二 环核苷的类似物也已被制备(Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett., 1998,8,2219-2222)。包含用作核酸聚合酶的底物的二环核苷的寡聚 脱氧核糖核苷酸双链体的制备也已被描述(Wengel等人，WO  99/14226)。此外，2′-氨基-BNA(新型构象限制的高亲合力寡核苷酸类 似物)的合成已在本领域中进行了描述(Singh等人，J.Org.Chem., 1998,63,10035-10039)。此外，已制备了2′-氨基-和2′-甲基氨基-BNA， 并且先前已报导了它们的具有互补RNA与DNA链的双链体的热稳 定性。

在某些实施方案中，二环核苷具有下式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T_a和T_b各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性 磷基团、磷部分或至载体介质的共价附着；

每个q_i、q_j、q_k和q_i独立地为H、卤素、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₁-C₁₂烷氧基、取代的C₁-C₁₂烷氧基、OJ_j、SJ_j、SOJ_j、SO₂J_j、 NJ_jJ_k、N₃、CN、C(=O)OJ_j、C(=O)NJ_jJ_k、C(=O)J_j、O-C(=O)NJ_jJ_k、 N(H)C(=NH)NJ_jJ_k、N(H)C(=O)NJ_jJ_k或N(H)C(=S)NJ_jJ_k；并且

q_i和q_j或q_i和q_k一起为=C(q_g)(q_h)，其中q_g和q_h各自独立地为H、 卤素、C₁-C₁₂烷基或取代的C₁-C₁₂烷基。

具有4′-(CH₂)₃-2′桥和烯基类似物桥4′-CH=CH-CH₂-2′的一个碳环 二环核苷已进行了描述(Frier等人，Nucleic Acids Research,1997, 25(22),4429-4443和Albaek等人，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。 碳环二环核苷的合成及制备以及它们的寡聚化和生物化学研究也已 进行了描述(Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.2007,129(26), 8362-8379)。

在某些实施方案中，二环核苷包括但不限于(A)α-L-亚甲基氧 (4′-CH₂-O-2′)BNA、(B)β-D-亚甲基氧(4′-CH₂-O-2′)BNA、(C)乙烯基氧 (4′-(CH₂)₂-O-2′)BNA、(D)氨基氧(4′-CH₂-O-N(R)-2′)BNA、(E)氧氨基 (4′-CH₂-N(R)-O-2′)BNA、(F)甲基(亚甲基氧)(4′-CH(CH₃)-O-2′)BNA(也 称为约束(constrained)乙基或cEt)、(G)亚甲基-硫代(4′-CH₂-S-2′)BNA、 (H)亚甲基-氨基(4′-CH₂-N(R)-2′)BNA、(I)甲基碳环 (4′-CH₂-CH(CH₃)-2′)BNA、(J)丙烯碳环(4′-(CH₂)₃-2′)BNA和(K)乙烯基 BNA，如下文中描述的。

其中Bx为碱基部分并且R独立地为H、保护基团、C₁-C₆烷基 或C₁-C₆烷氧基。

在某些实施方案中，通过用糖替代物替代核糖基环来修饰核苷。 此类修饰包括但不限于利用替代环系统(有时称为DNA类似物)（例 如吗啉代环、环己烯基环或四氢吡喃基环（例如具有下式中的一个的 四氢吡喃基环））对核糖基环的替代：

在某些实施方案中，选择具有下式的糖替代物：

其中：

Bx为杂环碱基部分：

T₃和T₄各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接于寡聚化合物 的核苷间连接基团或T₃和T₄中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接 于寡聚化合物或寡核苷酸的核苷间连接基团，而另一个为H、羟基保 护基团、连接的缀合物基团或5′或3′-末端基团；

q₁、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自独立地为H、C₁-C₆烷基、取代的 C₂-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或取代的C₂-C₆炔基；和

R₁和R₂中的一个为氢，而另一个选自卤素、取代的或未取代的 烷氧基、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(=X)J₁、OC(=X)NJ₁J₂、NJ₃C(=X)NJ₁J₂和CN，其中X为O、S或NJ₁并且J₁、J₂和J₃独立地为H或C₁-C₆烷基。

在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自为H。在 某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇的至少一个不为H。 在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇的至少一个为甲基。 在某些实施方案中，提供了其中R₁和R₂中的一个为F的THP核苷。 在某些实施方案中，R₁为氟代并且R₂为H；R₁为甲氧基并且R₂为H， R₁为甲氧基乙氧基并且R₂为H。

此类糖替代物包括但不限于在本领域内称为己糖醇核酸(HNA)、 阿卓糖醇核酸(ANA)和甘露醇核酸(MNA)的物质(参见Leumann,C.J., Bioorg.&Med.Chem.,2002,10,841-854)。

在某些实施方案中，反义化合物包含一种或多种经修饰的环己烯 基核苷，其为用六元环己烯基替代天然存在的核苷中的戊呋喃糖基糖 残基的核苷。经修饰的环己烯基核苷包括但不限于本领域中描述的那 些经修饰的环己烯基核苷(参见例如公开共同拥有的公开的PCT申请 WO2010/036696，于2010年4月10日公开，Robeyns等人，J.Am. Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984；Horváth等人，Tetrahedron Letters, 2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等人，J.Am.Chem.Soc.,2007, 129(30),9340-9348；Gu等人，Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等人，Nucleic Acids  Research,2005,33(8),2452-2463；Robeyns等人，Acta  Crystallographica,Section F:Structural Biology and Crystallization  Communications,2005,F61(6),585-586；Gu等人，Tetrahedron,2004, 60(9),2111-2123；Gu等人，Oligonucleotides,2003,13(6),479-489； Wang等人，J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505；Verbeure等人，Nucleic  Acids Research,2001,29(24),4941-4947；Wang等人，J.Org.Chem., 2001,66,8478-82；Wang等人，Nucleosides,Nucleotides&Nucleic  Acids,2001,20(4-7),785-788；Wang等人，J.Am.Chem.,2000,122, 8595-8602；公开的PCT申请WO 06/047842；和公开的PCT申请WO  01/049687；将每一篇文本通过引用整体并入本文)。某些经修饰的环 己烯基核苷具有下式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为将环己烯基核苷类似物连接于反义化合物 的核苷间连接基团或T₃和T₄中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接 于反义化合物的核苷间连接基团，而另一个为H、羟基保护基团、连 接的缀合物基团或5′-或3′-末端基团；且q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆、q₇、 q₈和q₉各自独立地为H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、 取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、取代的C₂-C₆炔基或其它糖取代基。

可用于修饰用于并入反义化合物的核苷的许多其它二环和三环 糖替代物环系统在本领域也是已知的(参见例如综述论文：Leumann, Christian J.,Bioorg.&Med.Chem.,2002,10,841-854)。此类环系统可 经历各种加成取代以增强活性。

用于制备经修饰的糖的方法对于本领域技术人员是公知的。教导 此类经修饰的糖的制备的一些代表性U.S.专利包括但不限于U.S.： 4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137； 5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722； 5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,670,633； 5,700,920；5,792,847和6,600,032，以及2005年6月2号提交的并且 于2005年12月22日公开为WO2005/121371的国际申请 PCT/US2005/019219，将其每一个通过引用整体并入本文。

在具有经修饰的糖部分的核苷酸中，维持核碱基部分(天然的、 经修饰的或其组合)以与适当的核酸靶杂交。

在某些实施方案中，靶向DMPK核酸的反义化合物包含一种或 多种具有经修饰的糖部分的核苷酸。在某些实施方案中，经修饰的糖 部分为2′-MOE。在某些实施方案中，2′-MOE修饰的核苷酸排列在空 隙聚物基序。

经修饰的核碱基

核碱基(或碱基)修饰或置换在结构上可与天然存在或合成的未 经修饰的核碱基区别开来，然而在功能上可与其互换。天然和经修饰 的核碱基能够参与氢键合。此类核碱基修饰可赋予反义化合物核酸酶 稳定性、结合亲合力或一些其它有益生物性质。经修饰的核碱基包括 合成的和天然核碱基（例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)）。某些核碱基置 换（包括5-甲基胞嘧啶置换）对于增强反义化合物对于靶核酸的结合 亲合力是特别有用的。例如，已显示5-甲基胞嘧啶置换使核酸双链体 的稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,eds., Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993, pp.276-278)。

另外的未经修饰的核碱基包括5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄 嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基以及腺嘌呤和鸟嘌呤的其它烷基衍生物、 腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸 腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡ C-CH₃)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-氮杂尿嘧 啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧定、8-卤代、 8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基(thioalkyl)、8-羟基和其它8-取代的腺嘌 呤和鸟嘌呤、5-卤代（特别地5-溴代）、5-三氟甲基和其它5-取代的 尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨 基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮 腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

杂环碱基部分还可包括其中用其它杂环替代嘌呤或嘧啶碱基的 那些碱基部分，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和 2-吡啶酮。对于增强反义化合物的结合亲合力是特别有用的核碱基包 括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括 2氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。

在某些实施方案中，靶向DMPK核酸的反义化合物包含一个或 多个经修饰的核碱基。在某些实施方案中，靶向DMPK核酸的增宽 的空隙的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核碱基。在某些实施 方案中，经修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每一 个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。

用于配制药物组合物的组合物和方法

可将反义寡核苷酸与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制 备药物组合物或制剂。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许 多标准，包括但不限于施用途径、疾病的程度或待施用的剂量。

靶向DMPK核酸的反义化合物可通过将该反义化合物与适当的 药学上接受的稀释剂或载体组合来用于药物组合物。药学上可接受的 稀释剂包括磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。PBS为适用于待胃肠外递送的 组合物的稀释剂。因此，在一个实施方案中，本文中描述的方法使用 的是包含靶向DMPK核酸的反义化合物和药学上可接受的稀释剂的 药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂为PBS。在 某些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸。

包含反义化合物的药物组合物包含任何药学上可接受的盐、酯或 此类酯的盐或任何其它寡核苷酸，在给动物（包括人）施用后，所述 寡核苷酸能够提供(直接或间接地)生物活性代谢物或其残基。因此， 例如，本公开内容也被吸引至反义化合物的药学上可接受的盐、前体 药物、此类前体药物的药学上可接受的盐和其它生物等同物。适当的 药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。

前体药物可包括在反义化合物的一个或两个末端上并另外的核 苷，该核苷可被体内的内源核酸酶裂解以形成活性反义化合物。

缀合的反义化合物

可将反义化合物共价地连接于一个或多个部分或缀合物，所述部 分或缀合物可增强所得的反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸 收。典型的缀合基团包括胆固醇部分和脂质部分。另外的缀合基团包 括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧 光素、罗丹明、香豆素和染料。

还可修饰反义化合物以具有一个或多个通常联接于反义化合物 的一个或两个末端以增强性质（例如核酶酶稳定性）的稳定化基团。 稳定化基团中包括的是帽状结构。此类末端修饰保护具有末端核酸的 反义化合物免受外切核酸酶降解，并且帮助细胞内的递送和/或定位。 帽可存在于5′-末端(5′-帽)或3′-末端(3′-帽)或可存在于两个末端上。帽 结构在本领域是公知的，并包括（例如）反向脱氧无碱基帽。可用于 在反义化合物的一个或两个末端上加帽以赋予核酸酶稳定性的其它 3′和5′-稳定化基团包括2003年1月16日公开的WO03/004602中公 开的那些3′和5′-稳定化基团。

细胞培养和反义化合物处理

可在体外在多种细胞类型中测试反义化合物对DMPK核酸的水 平、活性或表达的作用。用于此类分析的细胞类型可从商业提供商(例 如美国典型培养物保藏中心,Manassus,VA；Zen-Bio,Inc.,Research  Triangle Park,NC；Clonetics Corporation,Walkersville,MD)获得，并使 用商购可得的试剂(例如Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)按 照提供商的说明书培养细胞。举例说明性细胞类型包括但不限于 HepG2细胞、Hep3B细胞、原代肝细胞、A549细胞、GM04281成纤 维细胞和LLC-MK2细胞。

反义寡核苷酸的体外测试

本文中描述的是利用反义寡核苷酸处理细胞的方法，所述方法可 经适当地改进以利用其它反义化合物进行处理。

一般地，当细胞在培养中达到约60-80%的汇合时，利用反义寡 核苷酸处理细胞。

通常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞的一种试剂包括阳离子 脂质转染试剂LIPOFECTIN(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核 苷酸与OPTI-MEM1中的LIPOFECTIN(Invitrogen,Carlsbad,CA) 混合以获得期望的反义寡核苷酸的终浓度和通常在2至12ug/mL/100 nM反义寡核苷酸的范围内的LIPOFECTIN浓度。

用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞的另一种试剂包括 LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸 与OPTI-MEM1减血清培养基中的LIPOFECTAMINE  2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)混合以获得期望的反义寡核苷酸浓度 和通常在2至12ug/mL/100nM反义寡核苷酸的范围内的 LIPOFECTAMINE浓度。

用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞的另一种试剂可包括 Cytofectin(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与 OPTI-MEM1减血清培养基中的Cytofectin(Invitrogen,Carlsbad, CA)混合以获得期望的反义寡核苷酸浓度和通常在2至12ug/mL/100 nM反义寡核苷酸的范围内的Cytofectin浓度。

用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞的另一种技术包括电穿孔。

通过常规方法利用反义寡核苷酸处理细胞。通常在反义寡核苷酸 处理后16-24小时收获细胞，在该时间上通过本领域已知的方法和本 文中公开的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质水平。一般地，当多次 重复进行处理时，数据表示为重复处理的平均值。

所使用的反义寡核苷酸的浓度在细胞系间可变化。测定用于特定 细胞系的最佳反义寡核苷酸浓度的方法在本领域是公知的。当利用 LIPOFECTAMINE2000、Lipofectin或Cytofectin转染时，通常以1nM 至300nM的浓度使用反义寡核苷酸。当使用电穿孔转染时，通常以 更高的625至20,000nM的浓度使用反义寡核苷酸。

RNA分离

可对总细胞RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离 的方法在本领域是公知的。使用本领域公知的方法，例如按照制造商 推荐的方案使用TRIZOL试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)制备RNA。

靶水平或表达的抑制的分析

可以以本领域已知的多种方法测定DMPK核酸的水平或表达的 抑制。例如，可以通过例如Northern印迹分析、竞争性聚合酶链式反 应(PCR)或定量实时PCR定量靶核酸水平。可对总细胞RNA或 poly(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法在本领域是公知的。 Northern印迹分析在本领域也是常规的。可按照制造商的说明书使用 商购可得的ABI PRISM7600、7700或7900序列检测系统(可获自 PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)方便地进行定量实时PCR。

靶RNA水平的定量实时PCR分析

可按照制造商的说明书，使用ABI PRISM7600、7700或7900 序列检测系统(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)通过定量实时 PCR实现靶RNA水平的定量。定量实时PCR的方法在本领域是公知 的。

在实时PCR之前，将分离的RNA经历逆转录酶(RT)反应，该反 应产生随后用作实时PCR扩大的底物的互补DNA(cDNA)。在相同的 样品孔中连续进行RT和实时PCR反应。RT和实时PCR试剂获自 Invitrogen(Carlsbad,CA)。利用本领域技术人员公知的方法进行RT、 实时-PCR反应。

使用其表达是恒定的基因（例如亲环素A）的表达水平来标准化 或使用RIBOGREEN(Invitrogen,Inc.Carlsbad,CA)通过定量总RNA 来标准化通过实时PCR获得的基因(或RNA)靶的量。亲环素A的表 达可利用实时PCR(通过与靶同时地、多通路地或分开地运行)来定 量。使用RIBOGREENRNA定量试剂(Invitrogen,Inc.Eugene,OR) 定量总RNA。在Jones,L.J.,等人,(Analytical Biochemistry,1998,265, 368-374)中教导了利用RIBOGREEN进行RNA定量的方法。 CYTOFLUOR4000仪(PE Applied Biosystems)用于测量 RIBOGREEN荧光。

设计与DMPK核酸杂交的探针和引物。用于设计实时PCR探针 和引物的方法在本领域是公知的，并且可包括软件（例如PRIMER  EXPRESS软件(Applied Biosystems,Foster City,CA)）的使用。

蛋白质水平的分析

DMPK核酸的反义抑制可通过测量DMPK蛋白水平来评估。可 以本领域公知的多种方式（例如免疫沉淀、Western印迹分析(免疫印 迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定 (例如，半胱天冬酶活性测定)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光 激活细胞分选术(FACS)）来评估或定量DMPK的蛋白质水平。鉴定 针对靶的抗体以及从多种来源（例如抗体的MSRS目录(Aerie  Corporation,Birmingham,MI)）获得所述抗体，或可通过本领域公知 的常规单克隆或多克隆抗体产生方法制备所述抗体。

反义化合物的体内测试

测试动物中的反义化合物（例如反义寡核苷酸）以评估它们抑制 DMPK的表达和产生表型改变的能力。可在正常动物中，或在实验性 疾病模型（例如肌强直性营养不良(DM1)HSA^LR小鼠模型中）进行测 试。

HSA^LR小鼠模型为已建立的DM1的模型(Mankodi,A.等人 Science.289：1769,2000)。小鼠具有插入在基因的3′UTR中的220 CTG重复的人骨骼肌动蛋白(hACTAl)转基因。hACTAl-CUG^exp转录物 在骨骼肌的细胞核聚集点中积累并且导致与人DM1的肌强直相似的 肌强直(Mankodi,A.等人Mol.Cell10：35,2002；Lin,X.等人，Hum. Mol.Genet.15：2087,2006)。因此，预期通过hACTAl转基因的反义 抑制产生的HSA^LR小鼠的DM1症状的改善可预测通过DMPK转录 物的反义抑制产生的人患者的相似症状的改善。

小鼠中CUG^exp RNA的表达引起肌肉转录组的广泛重塑，所述重 塑的大部分通过消除MBNL1得到重现。因此，预期HSA^LR小鼠的转 录组的标准化可预测通过DMPK转录物的反义抑制产生的DM1患者 的人转录组的标准化。

为了给动物施用，将反义寡核苷酸配制于药学上可接受的稀释剂 （例如磷酸盐缓冲盐溶液）中。施用包括胃肠外施用途径。在利用反 义寡核苷酸治疗一段时间后，从组织分离RNA，并测量DMPK核酸 表达的改变。还测量DMPK蛋白水平的改变。

剪接

肌强直性营养不良(DM1)是由DMPK基因的3′非翻译区中的 CTG重复扩大引起(Brook,J.D.等人，Cell.68：799,1992)。该突变 导致RNA显性，其中包含扩大的CUT重复的RNA的表达(CUGexp) 诱导细胞功能障碍的过程(Osborne RJ和Thornton CA.,Human  Molecular Genetics.,2006,75(2)：R162-R169)。此类CUGexp保留在 骨骼肌的细胞核聚集点中(Davis,B.M.等人Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.94:7388,1997)。CUGexp在细胞核聚集点中的积累导致 poly(CUG)-结合蛋白（例如盲肌-样1(MBLN1)）的隔离(Miller,J.W. 等人，EMBO J.19：4439,2000)。MBLN1为剪接因子并且调节基因 （例如Serca1、CIC-1、Titin和Zasp）的剪接。因此，CUGexp对 MBLN1的隔离触发MBLN1通常控制的基因的外显子的错调 (misregulate)选择性剪接(Lin,X.等人，Hum.Mol.Genet.15：2087, 2006)。显示此类失调的动物（例如DM1患者和HSALR小鼠模型） 中的选择性剪接的校正是治疗(包括利用反义寡核苷酸的治疗)的功 效的有用指标。

某些生物标志物

小鼠模型中的DM1严重性至少部分通过CUG^exp转录物在细胞核 或细胞核聚集点中的积累水平来测定。DM1严重度的有用生理标志 物为无意识动作电位(肌强直)的高频率运行的发展。

某些适应征

在某些实施方案中，本文中提供了治疗个体的方法，包括施用一 种或多种本文中描述的药物组合物。在某些实施方案中，个体患有1 型肌强直性营养不良(DM1)。

因此，本文中提供了用于改善有此需要的受试者的与1型肌强 直性营养不良相关的症状的方法。在某些实施方案中，提供了用于降 低与1型肌强直性营养不良相关的症状的发作率的方法。在某些实施 方案中，提供了用于减小与1型肌强直性营养不良相关的症状的严重 度的方法。在某些实施方案中，与DM1相关的症状包括肌肉僵硬、 肌强直、远端肢体无力、面部肌肉和颚肌无力、吞咽困难、举抬无力 (上睑下垂)、颈肌无力、手臂和腿部肌肉无力、持久性肌肉疼痛、嗜 睡症、肌萎缩、咽下困难、呼吸功能不全、心律不齐、心肌损伤、情 感淡漠、胰岛素抗药性和白内障。在儿童中，症状还可以是发育迟滞、 学习问题、语言和言语问题以及人格发展问题。

在某些实施方案中，该方法包括给有此需要的个体施用治疗有效 量的靶向DMPK核酸的化合物。

在某些实施方案中，靶向DMPK核酸的反义化合物的施用导致 DMPK表达减少至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、 至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、 至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、 至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%或由这些值的 任意两个确定的范围。

在某些实施方案中，包含靶向DMPK的反义化合物的药物组合 物用于制备用于治疗患有或易患1型肌强直性营养不良的患者的药 剂。

在某些实施方案中，本文中描述的方法包括施用包含经修饰的寡 核苷酸的化合物，所述经修饰的寡核苷酸具有SEQ ID NO：12-156、 160-770和774-792中引用的序列的本文中描述的连续核碱基部分。

施用

在某些实施方案中，胃肠外施用本文中描述的化合物和组合物。

在某些实施方案中，通过输注进行胃肠外施用。输注可以是长期 的或连续的或短暂的或间断性的。在某些实施方案中，输注的药物组 合物利用泵来递送。在某些实施方案中，通过注射(例如，单次快速 静脉注射)进行胃肠外施用。可利用注射器递送注射物。

胃肠外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、 腹膜内施用或颅内施用（例如，鞘内或脑室内施用）。施用可以是连 续的或长期的或短暂的或间断性的。

在某些实施方案中，该施用是皮肤、静脉内、大脑内、脑室内、 鞘内或导致寡核苷酸的全身性作用(全身性施用的特征在于全身性作 用，即在超过一种组织中的作用)或至CNS或至CSF的递送的另一种 施用。

通过在DM1的HSA^LR小鼠模型中抑制α1肌动蛋白和减少肌强 直测量的作用持续时间在肌肉组织包括四头肌、腓肠肌和胫骨前肌 (参见下文中的实施例)中被延长。持续4周的反义寡核苷酸的皮下注 射导致在终止给药后，HSA^LR小鼠的四头肌、腓肠肌和胫骨前肌中的 α1肌动蛋白被抑制至少70%，持续至少11周(77天)。持续4周的反 义寡核苷酸的皮下注射导致在终止给药后，HSA^LR小鼠的四头肌、腓 肠肌和胫骨前肌的肌强直被消除至少11周(77周)。

在某些实施方案中，本文中描述的组合物或化合物的递送导致靶 mRNA和/或靶蛋白质的至少70%的下调，持续至少77天。在某些实 施方案中，本文中描述的组合物或化合物的递送导致靶mRNA和/或 靶蛋白质的50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%或100%的下调，持续至少30天、至少35天、至少40天、至 少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少 70天、至少75天、至少76天、至少77天、至少78天、至少79 天、至少80天、至少85天、至少90天、至少95天、至少100天、 至少105天、至少110天、至少115天、至少120天、至少1年。

在某些实施方案中，每77天一次通过注射或输注递送反义寡核 苷酸。在某些实施方案中，每1个月、每2个月、每3个月、每6个 月一次，每年两次或每年一次通过注射或输注递送反义寡核苷酸。

某些组合疗法

在某些实施方案中，将包含本发明的经修饰的寡核苷酸的第一试 剂与一种或多种第二试剂共施用。在某些实施方案中，此类第二试剂 被设计来治疗与本文中描述的第一试剂相同的1型肌强直性营养不 良。在某些实施方案中，此类第二试剂被设计来治疗与本文中描述的 第一试剂不同的疾病、病症或病状。在某些实施方案中，此类第二试 剂被设计来治疗本文中描述的一种或多种药物组合物的不期望的副 作用。在某些实施方案中，将第二试剂与第一试剂共施用以治疗第一 试剂的不期望的作用。在某些实施方案中，将第二试剂与第一试剂共 施用以产生组合作用。在某些实施方案中，将第二试剂与第一试剂共 施用以产生协同作用。

在某些实施方案中，同时施用第一试剂与一种或多种第二试剂。 在某些实施方案中，在不同的时间施用第一试剂与一种或多种第二试 剂。在某些实施方案中，将第一试剂与一种或多种第二试剂一起配制 于单一药物制剂中。在某些实施方案中，单独配制第一试剂与一种或 多种第二试剂。

实施例

非限定性公开内容和通过引用并入

虽然已根据某些实施方案具体地描述了本文中描述的某些化合 物、组合物和方法，但下列实施例仅用于举例说明本文中的化合物并 且无意限定于所述实施例。本申请中引用的每一份参考资料通过引用 整体并入本文。

实施例1：人骨骼肌细胞(hSKMC)的人肌强直性营养障碍蛋白激 酶(DMPK)的反义抑制

在体外测试靶向人DMPK核酸的反义寡核苷酸对DMPK RNA转 录物的作用。使用电穿孔，利用100nM反义寡核苷酸转染密度为 20,000个细胞/孔的培养的hSKM细胞。约24小时后，从细胞分离 RNA，并利用人引物探针组RTS3164(正向序列 AGCCTGAGCCGGGAGATG，在本文中指定为SEQ ID NO：9；反向 序列GCGTAGTTGACTGGCGAAGTT，在本文中指定为SEQ ID NO： 10；探针序列AGGCCATCCGCACGGACAACCX，在本文中指定为 SEQ ID NO：11)通过定量实时PCR测量DMPK RNA转录物水平。 按照总RNA含量调节DMPK RNA转录物水平，如利用 所测量的。结果表示为相对于未处理的对照细胞的 hDMPK的百分比抑制。

表1和2中的反义寡核苷酸为5-10-5空隙聚物，其中空隙区段 包含10个2′-脱氧核苷并且每一个翼区段包含5个2′-MOE核苷。每 一个空隙聚物全长上的核苷间连接为硫代磷酸酯(P=S)连接。每一个 空隙聚物全长上的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“靶起始位点” 表示反义寡核苷酸所靶向的5′最末端核苷。“靶终止位点”表示反义 寡核苷酸所靶向的3’最末端核苷。表1中所列的所有反义寡核苷酸靶 向SEQ ID NO：1(GenBank登录号NM_001081560.1)。表2中所列的 所有反义寡核苷酸靶向SEQ ID NO：2(从核苷酸18540696至 18555106截断的GenBank登录号NT011109.15的互补序列)。

几种反义寡核苷酸显示在上文中指定的条件下人DMPK mRNA 水平被显著抑制。

表1:靶向SEQ ID NO：1的5-10-5空隙聚物对hSKMC中的人 DMPK RNA转录物的抑制

表2：靶向SEQ ID NO：2的5-10-5空隙聚物对hSKMC中的人 DMPK RNA转录物的抑制

也在测定中利用上述相似的条件测试来自表1和2的反义寡核苷 酸，并利用人引物探针RTS3162(正向序列CGGGCCGTCCGTGTT， 在本文中指定为SEQ ID NO：157；反向序列 CTTTGCACTTTGCGAACCAA，在本文中指定为SEQ ID NO：158； 探针序列CATCCTCCACGCACCCCCACCX，在本文中指定为SEQ  ID NO：159)测量mRNA水平。结果示于表3中。也利用靶向3′UTR 附近的DMPK基因的RTS3162评估DMPK mRNA表达。将第二引 物探针用于确认完整DMPK基因的表达已被抑制。

表3:使用引物探针组RTS3162测量的5-10-5空隙聚物对hSKMC 中人DMPK RNA转录物的抑制

实施例2：靶向CUG重复的反义寡核苷酸的设计

设计靶向包含多个CUG重复的mRNA转录物的反义寡核苷酸。 此类寡核苷酸的化学组成以及其序列示于表4中。指示糖类型的符号 标示于碱基之后并且如下：b=2′-O-N-[2-(二甲基氨基)乙基]乙酰氨基 核糖；d=2′-脱氧核糖；e=2′-O-甲氧基乙基核糖；f=2′-α-氟代-2′- 脱氧核糖；g=2′-O-2[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基核糖；h=3′-氟 代-HNA；k=(S)-cEt；1=LNA(锁核酸)；n=2′-O-(N-甲基乙酰胺)核 糖；o=2′-O-二甲基氨基氧乙基(DMAOE)核糖；p=PNA；r=丙基 核糖；和x=氨基酸核心。杂环名称利用腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶 和鸟嘌呤的标准符号来定义，“mC”为5-甲基胞嘧啶，且“K”为赖 氨酸侧链。连接体标示于糖类型之后并且利用下列符号来表示：g= 完全PNA-甘氨酸；a=氨基酸；和s=硫代酯(thioate ester)。

表4:靶向CUG重复的反义寡核苷酸的设计

实施例3：人骨骼肌细胞中人DMPK的剂量依赖性反义抑制

以不同剂量测试几种在hSKMC中显示DMPK的体外抑制的反 义寡核苷酸(参见实施例1)。以20,000个细胞/孔的密度涂铺细胞，使 用电穿孔，利用浓度为1,250nM、2,500nM、5,000nM、10,000nM 和20,000nM的每一种反义寡核苷酸转染细胞。在约16小时后，从 细胞分离RNA，并如上文中所述，使用引物探针组RTS3164，通过 定量实时PCR测量DMPK mRNA转录物水平。将DMPK mRNA转 录物水平针对总RNA含量(如利用测量的)进行标准 化。结果在表5中表示为相对于未处理的对照细胞的DMPK的抑 制%。

测试的反义寡核苷酸显示在上文中指定的条件下DMPK mRNA 水平的剂量依赖性抑制。

表5：利用引物探针组RTS3164测试的hSKMC中的人DMPK 的剂量依赖性反义抑制

如上文中所述，也利用引物探针组RTS3162测试来自表5的反 义寡核苷酸。结果示于表6中。也利用靶向3′UTR附近的DMPK基 因的RTS3162来评估DMPK mRNA的表达。将第二引物探针用于确 认整个DMPK基因的表达已被抑制。

表6:利用引物探针组RTS3164测试的hSKMC中的人DMPK的 剂量依赖性反义抑制

实施例4：人骨骼肌细胞中人DMPK的剂量依赖性反义抑制

以不同剂量测试几种在hSKMC中显示DMPK的体外抑制的反 义寡核苷酸(参见实施例3)。以20,000个细胞/孔的密度涂铺细胞，使 用电穿孔，利用浓度为1,250nM、2,500nM、5,000nM、10,000nM 和20,000nM的每一种反义寡核苷酸转染细胞。在约16小时后，从 细胞分离RNA，并如上文中所述，使用引物探针组RTS3164，通过 定量实时PCR测量DMPK mRNA转录物水平。将DMPK mRNA转 录物水平针对总RNA含量进行标准化，如利用测量 的。结果在表7中表示为相对于未处理的对照细胞的DMPK的抑 制%。

大部分测试的反义寡核苷酸显示在上文中指定的条件下DMPK mRNA水平的剂量依赖性抑制。

表7：利用引物探针组RTS3164测试的hSKMC中的人DMPK 的剂量依赖性反义抑制

实施例5：人骨骼肌细胞中人DMPK的剂量依赖性反义抑制

几种反义寡核苷酸被设计来靶向人DMPK mRNA，并且以不同 的剂量在hSKMC中进行测试。几种其它反义寡核苷酸被设计来靶向 人肌动蛋白mRNA并且也以不同剂量在hSKMC中进行测试。新设 计的空隙聚物为2-10-2MOE或3-10-3MOE空隙聚物。2-10-2MOE 空隙聚物在长度上为14个核苷并且其中空隙区段包含10个2′-脱氧 核苷并且每一个翼区段包含2个2′-MOE核苷。3-10-3MOE空隙聚 物在长度上为16个核苷并且其中空隙区段包含10个2′-脱氧核苷， 每一个翼区段包含3个2′-MOE核苷。每一个空隙聚物全长上的核苷 间连接为硫代磷酸酯(P=S)连接。每一个空隙聚物全长上的所有胞嘧 啶为5-甲基胞嘧啶。“靶起始位点”表示反义寡核苷酸所靶向的5′最 末端核苷。“靶终止位点”表示反义寡核苷酸所靶向的3’最末端核苷。 表8中所列的反义寡核苷酸靶向人DMPK基因组序列（在本文中指 定为SEQ ID NO：2(GenBank登录号NT_011109.15的从核苷酸 18540696至18555106截断的互补序列)）或人肌动蛋白序列，在本文 中指定为SEQ ID NO：801(GenBank登录号NM_001100.3)。

以20,000个细胞/孔的密度涂铺细胞，使用电穿孔，利用浓度为 1,250nM、2,500nM、5,000nM、10,000nM和20,000nM的每一种 反义寡核苷酸转染细胞。在约16小时后，从细胞分离RNA，如上文 中所述，并使用引物探针组RTS3162，通过定量实时PCR测量DMPK  mRNA转录物水平。将DMPK mRNA转录物水平针对总RNA含量(如 利用测量的)进行标准化。结果在表8中表示为相对于 未处理的对照细胞的DMPK的抑制%。还在相似条件下利用RTS6164 测试了反义寡核苷酸。结果示于表9中。

许多测试的反义寡核苷酸显示在上文指定的条件下DMPK  mRNA水平的剂量依赖性抑制。

表8:利用引物探针组RTS3162测试的hSKMC中的人DMPK和 人肌动蛋白的剂量依赖性反义抑制

表9：利用引物探针组RTS3164测试的hSKMC中的人DMPK 的剂量依赖性反义抑制

实施例6：在DM1成纤维细胞中的利用靶向人肌强直性营养障 碍蛋白激酶(DMPK)的反义寡核苷酸进行的剂量反应研究

具有大CUG重复的DMPK mRNA的突变形式被完全转录和多腺 苷酸化，但仍被捕获在细胞核中(Davis等人，1997,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.94,7388-7393)。此类突变的保留在细胞核中的mRNA为 肌强直性营养不良1(DM1)的最重要的病理学特征中的一个。研究 DM1成纤维细胞中突变的DMPK mRNA的反义抑制。

DMPK基因通常在3′非翻译区中具有5-37个CTG重复。在肌强 直性营养不良I型中，该数被显著扩大并且可在50至大于3,500个的 范围内(Harper,Myotonic Dystrophy(Saunders,London,ed.3,2001)； Annu.Rev.Neurosci.29：259,2006；EMBO J.19：4439,2000；Curr Opin  Neurol.20：572,2007)。以4,500个细胞/孔的密度涂铺DM1成纤维 细胞，使用Cytofectin试剂，利用浓度为9.4nM、18.8nM、37.5nM、 75.0nM、150.0nM和300.0nM的每一种反义寡核苷酸转染细胞。在 约16小时后，从细胞分离RNA，如上文中所述，并使用引物探针组 RTS3164通过定量实时PCR测量DMPK RNA转录物水平。将DMPK  RNA转录物水平针对总RNA含量(如利用测量的)进行 标准化。结果在表10中表示为相对于未处理的对照细胞的DMPK的 百分比抑制。

如上文中所述，利用靶向DMPK转录物的3′末端的引物探针组 RTS3162，利用相似条件进行测定。结果在表11中表示为相对于未 处理的对照细胞的DMPK的百分比抑制。

测试的反义寡核苷酸显示在上文中指定的条件下DMPK mRNA 水平的剂量依赖性抑制。

表10：利用RTS3164在DM1成纤维细胞中进行的DMPK mRNA 的剂量依赖性反义抑制

表11：利用RTS3162在DM1成纤维细胞中进行的DMPK mRNA 的剂量依赖性反义抑制

实施例7：人骨骼肌细胞(hSKMc)中人DMPK的反义抑制

在体外测试靶向人DMPK核酸的反义寡核苷酸对DMPK RNA转 录物的作用。使用电穿孔，利用10,000nM反义寡核苷酸转染密度为 20,000个细胞/孔的培养的hSKMc细胞。在约24小时后，从细胞分 离RNA，并利用定量实时PCR测量DMPK转录物水平。根据总RNA 含量调整DMPK RNA转录物水平，如利用所测量的。 结果表示为相对于未处理的对照细胞的DMPK的百分比抑制。

表12和13中的反义寡核苷酸为5-10-5空隙聚物，其中空隙区 段包含10个2’-脱氧核苷并且每一个翼区段包含5个2′-MOE核苷。 每一个空隙聚物全长上的核苷间连接为硫代磷酸酯(P=S)连接。每一 个空隙聚物全长上的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“靶起始位点” 表示反义寡核苷酸在人基因组基因序列中所靶向的5′最末端核苷。 “靶终止位点”表示反义寡核苷酸在人基因组序列中所靶向的3′最末 端核苷。表12中所列的所有反义寡核苷酸靶向SEQ ID NO： 1(GenBank登录号.NM_001081560.1)。表13中所列的所有反义寡核 苷酸靶向SEQ ID NO：2(GenBank登录号NT_011109.15的从核苷酸 18540696至18555106截断的互补序列)。

几种反义寡核苷酸显示在上文指定的条件下DMPK mRNA水平 的显著抑制。

表12：靶向SEQ ID NO：1的5-10-5空隙聚物对hSKMc中的人 DMPK RNA转录物的抑制

表13：靶向SEQ ID NO：2的5-10-5空隙聚物对hSKMc中的人 DMPK RNA转录物的抑制

实施例8：小鼠原代肝细胞中鼠DMPK的反义抑制

在体外测试靶向鼠DMPK核酸的反义寡核苷酸对DMPK RNA转 录物的作用。使用电穿孔，利用8,000nM反义寡核苷酸转染密度为 35,000个细胞/孔的培养的小鼠原代肝细胞。约24小时后，从细胞分 离RNA，并利用定量实时PCR测量DMPK转录物水平。根据总RNA 含量调整DMPK RNA转录物水平，如利用所测量的。 结果表示为相对于未处理的对照细胞的DMPK的百分比抑制。

表14、15和16中的反义寡核苷酸为5-10-5空隙聚物，其中空 隙区段包含10个2’-脱氧核苷并且每一个翼区段包含5个2′-MOE核 苷。每一个空隙聚物全长上的核苷间连接为硫代磷酸酯(P=S)连接。 每一个空隙聚物全长上的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“靶起始 位点”表示反义寡核苷酸在鼠基因组基因序列中所靶向的5′最末端核 苷。“靶终止位点”表示反义寡核苷酸在鼠基因组序列中所靶向3′最 末端核苷。表12中所列的所有反义寡核苷酸靶向SEQ ID NO： 3(GenBank登录号NT039413.7从核苷酸16666001至16681000截断 的)。表13中所列的所有反义寡核苷酸靶向SEQ ID NO：4(GenBank 登录号NM_032418.1)。表14的反义寡核苷酸靶向SEQ ID NO： 5(GenBank登录号AI007148.1)、SEQ ID NO：6(GenBank登录号 AI304033.1)、SEQ ID NO：7(GenBank登录号BC024150.1)、SEQ ID  NO：8(GenBank登录号BC056615.1)、SEQ ID NO：793(GenBank登 录号BC075715.1)、SEQ ID NO：794(GenBank登录号BU519245.1)、 SEQ ID NO：795(GenBank登录号CB247909.1)、SEQ ID NO： 796(GenBank登录号CX208906.1)、SEQ ID NO：797(GenBank登录 号CX732022.1)、SEQ ID NO：798(GenBank登录号S60315.1)或SEQ  ID NO：799(GenBank登录号S60316.1)。此外，靶向SEQ ID NO： 800(GenBank登录号NM_001081562.1)的人反义寡核苷酸ISIS 451421也包括在该测定中并且列于表14中。

表14、15和16的鼠寡核苷酸还可与人基因序列交叉反应。“错 配”表示鼠寡核苷酸籍以与人基因序列错配的核碱基的数目。鼠寡核 苷酸与人序列之间的互补性越大，鼠寡核苷酸越可能与人序列交叉反 应。将表14、15和16中的鼠寡核苷酸与SEQ ID NO：800(GenBank 登录号NM_001081562.1)相比较。“人靶起始位点”表示空隙聚物在 人基因组基因序列中所靶向的5′最末端核苷。“人靶终止位点”表示 空隙聚物在人基因组序列中所靶向的3′最末端核苷。

几种测试的反义寡核苷酸显示在上文指定的条件下DMPK mRNA水平的显著抑制。某些测试的反义寡核苷酸与人基因序列交叉 反应。

表14:靶向SEQ ID NO：800的5-10-5空隙聚物对小鼠原代肝细 胞中鼠DMPK RNA转录物的抑制

表15：靶向SEQ ID NO：800的5-10-5空隙聚物对小鼠原代肝 细胞中鼠DMPK RNA转录物的抑制

表16：靶向SEQ ID NO：5-8和793-799的5-10-5空隙聚物对小 鼠原代肝细胞中鼠DMPK RNA转录物的抑制

实施例9：小鼠原代肝细胞中鼠DMPK的剂量依赖性反义抑制

以不同剂量测试在小鼠原代肝细胞中显示DMPK的体外抑制的 几种反义寡核苷酸(参见实施例8)。以35,000个细胞/孔的密度涂铺 细胞，并利用浓度为1,000nM、2,000nM、4,000nM、8,000nM和 16,000nM的每一种反义寡核苷酸，使用电穿孔转染细胞。约16小时 后，从细胞分离RNA，并使用引物探针组RTS3181(正向序列 GACATATGCCAAGATTGTGCACTAC,在本文中指定为SEQ ID  NO：771；反向序列CACGAATGAGGTCCTGAGCTT,在本文中指定 为SEQ ID NO：772；探针序列AACACTTGTCGCTGCCGCTGGCX, 在本文中指定为SEQ ID NO：773)通过定量实时PCR测量DMPK转 录物水平。按照总RNA含量调节DMPK转录物水平，如利用 所测量的。结果在表17中表示为相对于未处理的对照 细胞的DMPK的百分比抑制。

大部分测试的反义寡核苷酸显示在上文中指定的条件下DMPK mRNA水平的剂量依赖性抑制。

表17:小鼠原代肝细胞中鼠DMPK的剂量依赖性反义抑制。

实施例10：HepG2细胞中人α1骨骼肌动蛋白的反义抑制

在体外测试靶向人α1骨骼肌动蛋白核酸(当插入小鼠模型时能够 引起DM1的症状的可具有扩大的CTG重复的基因)的反义寡核苷酸 对α1肌动蛋白RNA转录物的作用。使用电穿孔，利用10,000nM反 义寡核苷酸转染密度为20,000个细胞/孔的培养的HepG2细胞。在约 24小时后，从细胞分离RNA，通过定量实时PCR测量α1肌动蛋白 RNA转录物水平。根据总RNA含量调整αl肌动蛋白RNA转录物水 平，如利用测量的。结果表示为相对于未处理的对照 细胞的α1肌动蛋白的百分比抑制。

表18中的反义寡核苷酸为5-10-5空隙聚物，其中空隙区段包含 10个2’-脱氧核苷并且每一个翼区段包含5个2′-MOE核苷。每一个 空隙聚物全长上的核苷间连接为硫代磷酸酯(P=S)连接。每一个空隙 聚物全长上的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“靶起始位点”表示 反义寡核苷酸所靶向的5′最末端核苷。“靶终止位点”表示反义寡核 苷酸所靶向的3’最末端核苷。表18中所列的所有反义寡核苷酸靶向 SEQ ID NO：801(GenBank登录号NM_001100.3)。

测试的反义寡核苷酸序列显示在上文指定的条件下α1肌动蛋白 mRNA水平的剂量依赖性抑制。

表18：靶向SEQ ID NO：801的5-10-5空隙聚物对HepG2细胞 中人α1肌动蛋白mRNA转录物的抑制

施例11：HepG2细胞中人α1肌动蛋白的剂量依赖性反义抑制

以不同剂量测试几种在HepG2细胞中显示α1肌动蛋白的体外抑 制的反义寡核苷酸(参见实施例8)。以20,000个细胞/孔的密度涂铺细 胞，使用电穿孔，利用浓度为625nM、1,250nM、2,500nM、5,000nM、 10,000nM和20,000nM的每一种反义寡核苷酸转染细胞。在约16小 时后，从细胞分离RNA，并使用引物探针组RTS3154(正向序列 CCACCGCAAATGCTTCTAGAC，在本文中指定为SEQ ID NO：785； 反向序列CCCCCCCATTGAGAAGATTC,在本文中指定为SEQ ID  NO：786；探针序列CTCCACCTCCAGCACGCGACTTCTX,在本文 中指定为SEQ ID NO：787)通过定量实时PCR测量α1肌动蛋白RNA 转录物水平。将α1肌动蛋白RNA转录物水平针对总RNA含量进行 标准化，如利用测量的。结果在表19中表示为相对于 未处理的对照细胞的α1肌动蛋白的百分比抑制。

几种反义寡核苷酸显示在上文中指定的条件下α1肌动蛋白 mRNA水平的剂量依赖性抑制。

表19：HepG2细胞中人α1肌动蛋白的剂量依赖性反义抑制

实施例12：在转基因小鼠中肌内施用的人α1肌动蛋白的体内反 义抑制

为了测试反义抑制对于肌强直性营养不良的治疗的作用，需要适 当的小鼠模型。HSA^LR小鼠模型是已建立的DM1的模型(Mankodi,A. 等人Science.289：1769,2000)。小鼠具有在基因的3′UTR中具有220 个CTG重复的人骨骼肌动蛋白(hACTAl)转基因。hACTAl-CUGexp 转录物在骨骼肌的细胞核聚集点中积累，并且导致与人DM1中的肌 强直相似的肌强直(Mankodi,A.等人Mol.Cell10：35,2002；Lin,X. 等人Hum.Mol.Genet.15：2087,2006)。因此，预期通过hACTAl转 基因的反义抑制产生的HSA^LR小鼠的DM1症状的改善可预测通过 DMPK转录物的反义抑制产生的人患者的相似症状的改善。

通过将在人骨骼肌动蛋白的3′UTR中具有250个CUG重复的转 基因插入FVB/N小鼠产生HSA(人骨骼肌动蛋白)^LR(长重复)DM1小 鼠。转基因在小鼠中表达为CUG重复RNA，所述RNA保留在细胞 核中，形成核内包函体(nuclear inclusion)或聚集点，与在患有肌强直 性营养不良(DM1)的患者的人组织样品中看到的相似。

评估在体外显示统计上显著的剂量依赖性抑制(参见实施例11) 的ISIS190403和ISIS445238在体内减少人α1肌动蛋白RNA转录 物的能力。

处理

将HSA^LR小鼠维持在12-小时光/暗周期并且随意喂食正常普瑞 纳小鼠食物(Purina mouse chow)。在开始实验之前，使动物在研究设 施中适应至少7天。在PBS中制备反义寡核苷酸(ASO)，并通过将其 通过0.2微米过虑器过滤来进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9%PBS 中以用于注射。

将小鼠分成两个处理组。两个组接受剂量为0.8nM的ISIS 190403或ISIS445238至一侧上的胫骨前肌内的直接肌内注射。每一 只小鼠的对侧胫骨前肌接受单次剂量的PBS的肌内注射。将PBS注 射的肌肉用作对照。

α1肌动蛋白RNA的抑制

在最后一次给药后24小时，处死动物，并从两侧的胫骨前肌分 离样品。分离RNA以用于α1肌动蛋白的实时PCR分析，并将其针 对18s RNA进行标准化。如表20中所示，利用反义寡核苷酸的处理 减少人α1肌动蛋白RNA转录物表达。结果表示为相对于PBS对照 的α1肌动蛋白转录物的百分比抑制。

结果显示利用ISIS190403和ISIS445238的处理导致小鼠中α1 肌动蛋白RNA水平的抑制。

表20：HSA^LR小鼠中人肌动蛋白RNA转录物的百分比抑制

ISIS编号 抑制% 190403 38 445238 40

实施例13：在转基因小鼠中肌内施用的人α1肌动蛋白的剂量依 赖性反义抑制

在体内评估在体外显示统计上显著的剂量依赖性抑制(参见实施 例11)的ISIS445236减少人α1肌动蛋白RNA转录物的能力。

处理

将HSA^LR小鼠维持在12-小时光/暗周期并且随意喂食正常普瑞 纳小鼠食物(Purina mouse chow)。在开始实验之前，使动物在研究设 施中适应至少7天。在PBS中制备反义寡核苷酸(ASO)，并通过将其 通过0.2微米过虑器过滤来进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9%PBS 中以用于注射。

将小鼠分成三个处理组。所述组接受剂量为0.2nM、0.4nM或 0.8nM的ISIS445236至一侧上的胫骨前肌内的直接肌内注射。每一 只小鼠的对侧胫骨前肌接受单次剂量的PBS的肌内注射。将PBS注 射的肌肉用作对照。

α1肌动蛋白RNA的抑制

在最后一次给药后24小时，处死动物，并从两侧的胫骨前肌分 离样品。分离RNA以用于α1肌动蛋白的实时PCR分析，将其针对 18s RNA进行标准化。如表21中所示，利用ISIS445236的处理在所 有剂量上减少人α1肌动蛋白RNA转录物表达。结果表示为相对于 PBS对照的α1肌动蛋白转录物的百分比抑制。

结果显示利用ISIS445236的处理在上文中指定的条件下导致α1 肌动蛋白mRNA水平的显著抑制。

表21：HSA^LR小鼠中ISIS445236对人α1肌动蛋白RNA转录物 的百分比抑制

剂量(nM) 抑制% 0.2 70 0.4 54 0.8 78

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

肌强直是指归因于肌纤维的延迟的放松的重复动作电位。在具有 肌强直性营养不良的患者中以及在HSA^LR小鼠中观察到该现象。当 将EMG针插入肌强直的肌肉时，电活动性被延长直到当插入活动通 常应当停止后数秒。肌强直性放电的频率在50至100个脉冲/秒的范 围内。

通过肌电描记术测量肌强直，并以下列方式将其分级：0级表示 通过任何针插入没有引发肌强直(0%)；1级表示通过低于50%的针插 入引发的肌强直；2级表示通过超过50%的针插入引发的肌强直；以 及3级表示通过100%的针插入引发的肌强直。

在进行肌电描记术之前，通过腹膜内注射100mg/kg氯胺酮、10 mg/kg赛拉嗪和3mg/kg乙酰丙嗪的混合物来麻醉小鼠。如先前所述 (Kanadia等人，2003,Science,302：1978-1980)，通过对每一块肌肉 使用30规同心针状电极和最少10次针插入对左右四头肌、左右腓肠 肌、左右胫骨前肌和腰椎旁肌进行肌电描记术。数据在表22中显示 为在每一组的4只小鼠中观察到的平均肌强直等级，并且显示了利用 ISIS445236处理的小鼠的肌强直的显著减少。

表22：反义寡核苷酸处理的HSA^LR小鼠的不同肌肉中肌强直的 平均减少

选择性剪接的校正

在DM1/HSA^LR小鼠模型中，扩大的CUG RNA在细胞核中的积 累导致多(CUG)-结合蛋白例如盲肌-样1(MBLN1)的隔离(Miller,J.W. 等人EMBO J.19：4439,2000)。控制Serca1基因的选择性剪接的剪 接因子MBNL1被隔离在扩大的CUG聚集点中。这触发了该基因的 选择性剪接的失调。为了评估人α1肌动蛋白的反义抑制对此类选择 性剪接的作用，按照制造商的说明书，使用RNeasy Lipid Tissue Mini 试剂盒(Qiagen)从胫骨前肌、腓肠肌和四头肌纯化总RNA。使用用于 cDNA合成和PCR扩增的基因特异性引物，利用Superscript III  One-Step RT-PCR系统和Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)进行 RT-PCR。用于Serca-1的正向和反向引物已描述于Bennett和 Swayze(Annu.Rev.Pharmacol.2010；50：259-93)中。在琼脂糖凝胶上 分离PCR产物，用SybrGreen I核酸凝胶染色剂(Invitrogen)染色，然 后使用Fujifilm LAS-3000智能暗盒进行成像。

PBS对照中Serca1剪接的PCR产物显示作为MBLNl的失调的 结果的外显子22排斥。利用ISIS445236的处理导致外显子22包含 和胫骨前肌、腓肠肌和四头肌中的Serca1基因的选择性剪接的标准 化。

因此，α1肌动蛋白的反义抑制校正了Serca1剪接失调，这表示 利用反义寡核苷酸的处理减少了CUGexp在细胞核聚集点中的积累。 CUGexp在细胞核聚集点中的积累减少校正了MBLNl隔离，从而允 许正常剪接发生。

实施例14：在转基因小鼠中皮下施用的人α1肌动蛋白的体内反 义抑制

评估ISIS190403、ISIS445236和ISIS445238在体内减少人α1 肌动蛋白RNA转录物的能力。

处理

将HSA^LR小鼠维持在12-小时光/暗周期并且随意喂食正常普瑞 纳小鼠食物(Purina mouse chow)。在开始实验之前，使动物在研究设 施中适应至少7天。在PBS中制备反义寡核苷酸(ASO)，并通过将其 通过0.2微米过虑器过滤来进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9%PBS 中以用于注射。

将小鼠分成四个处理组。每周2次以25mg/kg的剂量给前三个 组皮下注射ISIS190403、ISIS445236或ISIS445238，进行4周。每 周2次给第四组皮下注射PBS，进行4周。将PBS注射组用作与寡 核苷酸处理的组相比较的对照组。

α1肌动蛋白RNA的抑制

在最后一次给药后24小时，处死动物，并分离来自四头肌(左和 右)、腓肠肌(左和右)和胫骨前肌(左和右)的组织。分离RNA以用于 α1肌动蛋白的实时PCR分析，并将其针对18s RNA进行标准化。如 表23中所示，利用反义寡核苷酸的处理在所有剂量上减少人α1肌动 蛋白RNA转录物表达。结果表示为相对于对照的α1肌动蛋白转录物 的百分比抑制。

ISIS445236和ISIS445238都显示在上文中指定的条件下α1肌 动蛋白mRNA水平的显著抑制。

表23：HSA^LR小鼠中人α1肌动蛋白RNA转录物的百分比抑制

肌肉类型 ISIS190403 ISIS445236 ISIS445238 四头肌 16 83 72 腓肠肌 0 85 73 胫骨前肌 2 81 71

肌肉中α1肌动蛋白的荧光原位杂交

将冷冻的肌肉组织切片于新鲜的3%的PBS溶液中的多聚甲醛中 固定15-20分钟，随后用PBS将其冲洗2次达5分钟。利用0.5%Triton X-100透化细胞核，随后利用正常山羊血清封闭组织，进行30分钟。 用利用德克萨斯红(Integrated DNA Technologies)5′标记的靶向α1肌动 蛋白的2′-O-甲基RNA温育切片。利用DAPI对切片进行复染色以标 记细胞核。安装切片，并利用标准荧光显微镜进行观察。利用Metavue 软件采集图像，利用Autoquant软件实现重叠合法(deconvolution)。

来自利用ISIS445236和ISIS445238处理的小鼠的所有肌肉组织 切片都在核糖核聚集点(ribonuclear foci)上显示减少的的α1肌动蛋白 信号的荧光强度，这表明人α1肌动蛋白mRNA的反义抑制和细胞核 聚集体中RNA的减少。

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

肌强直是指归因于肌纤维的延迟的放松的重复动作电位。在患有 肌强直性营养不良的患者中以及在HSA^LR小鼠中观察到该现象。当 将EMG针插入肌强直的肌肉时，电活动性被延长达到当插入活动通 常应当停止后数秒。肌强直性放电的频率在50至100个脉冲/秒的范 围内。

通过肌电描记术测量肌强直，并以下列方式将其分级：0级表示 通过任何针插入没有引发肌强直(0%)；1级表示通过低于50%的针插 入引发的肌强直；2级表示通过超过50%的针插入引发的肌强直；以 及3级表示通过100%的针插入引发的肌强直。

在进行肌电描记术之前，通过腹膜内注射100mg/kg氯胺酮、10 mg/kg赛拉嗪和3mg/kg乙酰丙嗪或250mg/kg2,2,2-三溴乙醇的混合 物来麻醉小鼠。如先前所述(Kanadia等人，2003,Science,302： 1978-1980)，通过对每一块肌肉使用30规同心针状电极和最少10次 针插入对左右四头肌、左右腓肠肌、左右胫骨前肌以及腰椎旁肌进行 肌电描记术。数据在表24中显示为在每一组的4只小鼠中观察到的 平均肌强直等级，并且显示了用ISIS445236和ISIS445238处理的小 鼠的肌强直的显著减少。

表24：反义寡核苷酸处理的HSA^LR小鼠的不同肌肉中肌强直的 平均减少

选择性剪接的校正

控制Serca1剪接、m-Titin剪接、CIC-1氯离子通道基因(Clcnl) 剪接和Zasp剪接的剪接因子MBNL1被隔离在扩大的CUG聚集点 中。MBNL1的隔离触发了这些基因的每一个基因的失调剪接。为了 评估人α1肌动蛋白的反义抑制对剪接的作用，按照实施例13中所述， 从胫骨前肌、腓肠肌和四头肌纯化总RNA并进行RT-PCR。用于 Serca-1、m-Titin、Clcnl和ZASP的正向和反向引物已描述于Bennett 和Swayze，Annu.Rev.Pharmacol.2010；50：259-93中。

在PBS处理的HSA^LR小鼠中，Serca1剪接失调，如通过外显子 22排斥所证明的。用ISIS445236和ISIS445238的每一种的处理导 致外显子22包含以及胫骨前肌、腓肠肌和四头肌的Serca1基因的选 择性剪接的正常化。

在PBS处理的HSA^LR小鼠中，m-Titin剪接失调，如通过外显子 5包含所证明的。用ISIS445236和ISIS445238的每一种的处理导致 外显子5的跳跃以及胫骨前肌、腓肠肌和四头肌的m-Titin基因的选 择性剪接的正常化。

在PBS处理的HSA^LR小鼠中，Clcnl剪接失调，如通过外显子 7a包含所证明的。用ISIS445236和ISIS445238的每一种的处理导 致外显子7a的跳跃以及胫骨前肌、腓肠肌和四头肌的Clcnl基因的 选择性剪接的正常化。

在PBS处理的HSA^LR小鼠中，Zasp剪接失调，如通过外显子11 例入所证明的。用ISIS445236和ISIS445238的每一种的处理导致外 显子11的跳跃以及胫骨前肌、腓肠肌和四头肌的Zasp基因的选择性 剪接的正常化。

因此，α1肌动蛋白的反义抑制校正Serca1、m-Titin、Clcnl和Zasp 剪接失调，这表示用反义寡核苷酸的处理减少了CUGexp在细胞核聚 集点中的积累。CUGexp在细胞核聚集点中的积累减少校正了MBLNl 隔离，从而允许正常剪接发生。

实施例15：转基因小鼠中人α1肌动蛋白的体内反义抑制

进一步在HSA^LR小鼠中评估人α1肌动蛋白RNA转录物通过ISIS 445236和ISIS445238对肌强直的反义抑制。

处理

将小鼠分成三个处理组。每周2次以25mg/kg的剂量给前二个 组皮下注射ISIS445236或ISIS445238，进行2周。每周2次给第三 组第三组皮下注射PBS，进行2周。将PBS注射组用作与寡核苷酸 处理的组相比较的对照组。

α1肌动蛋白RNA的抑制

在最后一次给药后24小时，处死动物，并分离来自四头肌、腓 肠肌和胫骨前肌的组织。分离RNA以用于α1肌动蛋白的实时PCR 分析，并将其针对18s RNA进行标准化。如表25中所示，利用反义 寡核苷酸的处理减少人α1肌动蛋白RNA转录物表达。结果表示为相 对于PBS对照的α1肌动蛋白转录物的百分比抑制。

ISIS445236和ISIS445238都显示在上文中指定的条件下α1肌 动蛋白mRNA水平的显著抑制。

表25：HSA^LR小鼠中人α1肌动蛋白RNA转录物的百分比抑制

肌肉类型 ISIS445236 ISIS445238 四头肌 61 64 腓肠肌 68 37 胫骨前肌 68 41

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

如先前所述(Kanadia等人，2003,Science,302：1978-1980)，通 过对每一块肌肉使用30规同心针状电极和最少10次针插入对左右四 头肌、左右腓肠肌、左右胫骨前肌以及腰椎旁肌进行肌电描记术。数 据在表26中显示为在每一组的4只小鼠中观察到的平均肌强直等级， 并且显示了利用ISIS445236和ISIS445238处理的小鼠的肌强直的显 著减少。

表26：反义寡核苷酸-处理的HSA^LR小鼠的不同肌肉中肌强直的 平均减少

选择性剪接的校正

为了评估ISIS190401对Serca1的选择性剪接的作用，在与实施 例13中描述的方法相似的方法中分析从胫骨前肌、腓肠肌和四头肌 纯化的总RNA。

在PBS处理的HSA^LR小鼠中，Serca1剪接失调，如通过外显子 22排斥所证明的。利用ISIS445236和ISIS445238的每一种的处理 导致胫骨前肌和四头肌中Serca1基因的外显子22的几乎完全包含和 选择性剪接的正常化。

因此，α1肌动蛋白的反义抑制校正了Serca1剪接失调，这表示 利用反义寡核苷酸的处理减少了CUGexp在细胞核聚集点中的积累。 CUGexp在细胞核聚集点中的积累减少校正了MBLNl隔离，从而允 许正常剪接发生。

实施例16：转基因小鼠中人α1肌动蛋白的剂量依赖性反义抑制

在HSA^LR小鼠中评估人α1肌动蛋白RNA转录物通过ISIS 445236和ISIS445238对对肌强直的反义抑制。

处理

每周2次以2.5mg/kg、8.5mg/kg或25.0mg/kg的剂量给HSA^LR小鼠皮下注射ISIS445236或ISIS445238，进行4周。每周2次给对 照组皮下注射PBS，进行4周。将PBS注射的组用作与寡核苷酸处 理的组相比较的对照组。

α1肌动蛋白RNA的抑制

在最后一次给药后24小时，处死动物，并分离来自四头肌 （Quad）、腓肠肌（Gastroc）和胫骨前肌（TA）的组织。分离RNA 以用于α1肌动蛋白的实时PCR分析，并将其针对18s RNA进行标 准化。如表27中所示，利用反义寡核苷酸的处理减少人α1肌动蛋白 RNA转录物表达。结果表示为相对于PBS对照的α1肌动蛋白转录 物的百分比抑制。

两种反义寡核苷酸都显示在上文中指定的条件下四头肌、腓肠肌 和胫骨前肌中的α1肌动蛋白mRNA水平的剂量依赖性抑制。

表27：HSA^LR小鼠中人α1肌动蛋白RNA转录物的剂量依赖性 抑制

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

如先前所述(Kanadia等人，2003,Science,302：1978-1980)，通 过对每一块肌肉使用30规同心针状电极和最少10次针插入对左右四 头肌(Quad)、左右腓肠肌(Gastroc)、左右胫骨前肌(TA)以及腰椎旁肌 进行肌电描记术。数据在表28中显示为在每一组的4只小鼠中观察 到的平均肌强直等级，并且显示了利用ISIS445236和ISIS445238 处理的小鼠中肌强直的显著的剂量依赖性减少。

表28：反义寡核苷酸处理的HSA^LR小鼠的不同肌肉中肌强直的 平均减少

选择性剪接的校正

为了评估ISIS190401对Serca1的选择性剪接的作用，在与实施 例13中描述的方法相似的方法中分析从胫骨前肌、腓肠肌和四头肌 纯化的总RNA。

在PBS处理的HSA^LR小鼠中，作为MBLN1失调的结果，Serca1 剪接失调，如通过外显子22排斥所证明的。每周2次以8.5mg/kg 或25.0mg/kg的剂量(或17.0mg/kg/周和50.0mg/kg/周)用ISIS445236 或ISIS445238进行处理导致所有三种肌肉类型的Serca1基因的外显 子22的选择性剪接的完全包含和正常化。

因此，α1肌动蛋白的反义抑制校正了Serca1剪接失调，这表示 利用反义寡核苷酸的处理减少了CUGexp在细胞核聚集点中的积累。 CUGexp在细胞核聚集点中的积累减少校正了MBLNl隔离，从而允 许正常剪接发生。

实施例17：靶向HAS编码区的寡核苷酸对转基因小鼠的人α1 肌动蛋白的体内反义抑制

评估在HSA^LR小鼠中人α1肌动蛋白RNA转录物通过ISIS 190401(5′-GCGGTCAGCGATCCCAGGGT-3′(SEQ ID NO：788)，SEQ  ID NO：1的靶起始位点1028)对肌强直的反义抑制。

处理

每周2次以25mg/kg的剂量给HSA^LR小鼠皮下注射ISIS190401， 进行4周。每周2次给对照组皮下注射PBS，进行2周。将PBS注 射组用作与寡核苷酸处理的组相比较的对照组。

α1肌动蛋白RNA的抑制

在最后一次给药后24小时，处死动物，并分离来自四头肌、腓 肠肌和胫骨前肌的组织。分离RNA以用于α1肌动蛋白的实时PCR 分析，并将其针对18s RNA进行标准化。如表29中所示，利用反义 寡核苷酸的处理减少人α1肌动蛋白RNA转录物表达。结果表示为相 对于PBS对照的α1肌动蛋白转录物的百分比抑制。

用ISIS190401的处理在上文中指定的条件下导致四头肌、腓肠 肌和胫骨前肌中的α1肌动蛋白mRNA水平的显著抑制。

表29：HSA^LR小鼠中人α1肌动蛋白RNA转录物的反义抑制

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

如先前所述(Kanadia等人，2003,Science,302：1978-1980)，通 过对每一块肌肉使用30规同心针状电极和最少10次针插入对左右四 头肌、左右腓肠肌、左右胫骨前肌以及腰椎旁肌进行肌电描记术。数 据在表30中显示为在每一组的4只小鼠中观察到的平均肌强直等级， 并且显示了利用ISIS190401处理的小鼠的肌强直的显著减少。

表30：反义寡核苷酸处理的HSA^LR小鼠的不同肌肉中肌强直的 平均减少

选择性剪接的校正

为了评估ISIS190401对Serca1的选择性剪接的作用，在与实施 例13中描述的方法相似的方法中分析从胫骨前肌、腓肠肌和四头肌 纯化的总RNA。

在PBS处理的HSA^LR小鼠中，作为MBLN1失调的结果，Serca1 剪接失调，如通过外显子22排斥所证明的。利用ISIS190401的处理 导致全部三种肌肉类型的Serca1基因的外显子22的完全包含和选择 性剪接的正常化。

因此，α1肌动蛋白的反义抑制校正了Serca1剪接失调，这表示 利用反义寡核苷酸的处理减少了CUGexp在细胞核聚集点中的积累。 CUGexp在细胞核聚集点中的积累减少校正了MBLNl隔离，从而允 许正常剪接发生。

实施例18：在转基因小鼠中靶向人α1肌动蛋白的寡核苷酸的反 义抑制的作用的持续时间

评估在HSA^LR小鼠中人α1肌动蛋白RNA转录物通过ISIS 445236的反义抑制的持续时间。

处理

每周2次以25mg/kg的剂量给HSA^LR小鼠皮下注射ISIS445236， 进行4周。每周2次给对照组皮下注射PBS，进行2周。将PBS注 射的组用作与寡核苷酸处理的组相比较的对照组。在最后一次剂量施 用后6周分析小鼠。

α1肌动蛋白RNA的抑制

在最后一次给药后6周，处死动物，并分离来自四头肌、腓肠肌 和胫骨前肌的组织。分离RNA以用于α1肌动蛋白的实时PCR分析， 并将其针对18s RNA进行标准化。如表31中所示，利用ISIS445236 的处理减少人α1肌动蛋白RNA转录物表达，并且该作用持续至少6 周。结果表示为相对于PBS对照的α1肌动蛋白转录物的百分比抑制。

利用ISIS445236的处理在上文中指定的条件下导致四头肌、腓 肠肌和胫骨前肌中的α1肌动蛋白mRNA水平的显著抑制。

表31：HSA^LR小鼠中人α1肌动蛋白RNA转录物的反义抑制

肌肉类型 百分比

  抑制 四头肌 88 腓肠肌 76 胫骨前肌 67

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

如先前所述(Kanadia等人，2003,Science,302:1978-1980)，通过 对每一块肌肉使用30规同心针状电极和最少10次针插入对左右四头 肌、左右腓肠肌、左右胫骨前肌以及腰椎旁肌进行肌电描记术。数据 在表32中显示为在每一组的4只小鼠中观察到的平均肌强直等级， 并且显示了利用ISIS445236处理的小鼠的肌强直的显著减少。因此， ISIS445236对α1肌动蛋白的反义抑制的作用持续至少6周。

表32：反义寡核苷酸处理的HSA^LR小鼠的不同肌肉中肌强直的 平均减少

实施例19：在转基因小鼠中通过肌内施用的具有CUG重复的 mRNA的反义抑制的体内作用

评估在HSA^LR小鼠中包含多个CUG重复的mRNA转录物对肌 强直的反义抑制的作用。测定3种靶向CUG重复并且具有不同长度 的反义寡核苷酸在抑制小鼠中的肌强直的效率。ISIS  444745(AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA(SEQ ID NO：789) 为长度为25个核苷酸并且具有硫代磷酸酯主链的均一2′-O-甲氧基乙 基寡核苷酸。ISIS444746(AGCAGCAGCAGCAGCAGCAG(SEQ ID NO：790)为长度为20个核苷酸并且具有硫代磷酸酯主链的均一2′-O- 甲氧基乙基寡核苷酸。ISIS444749(GCAGCAGCAGCAGCA(SEQ ID  NO：791)为长度为15个核苷酸并且具有硫代磷酸酯主链的均一2′-O- 甲氧基乙基寡核苷酸。ISIS445236被包括在测定中作为阳性对照。

处理

将HSA^LR小鼠分成三个处理组。所述组接受剂量为0.4nM的ISIS  444745、ISIS444746或ISIS444749至胫骨前肌内的直接肌内注射。 每一只小鼠的对侧胫骨前肌接受单次剂量的PBS的肌内注射。将PBS 注射的肌肉用作对照。

α1肌动蛋白RNA的抑制

在最后一次给药后24小时，处死动物，并从胫骨前肌(左和右) 分离样品。分离RNA以用于α1肌动蛋白的实时PCR分析，并将其 针对18s RNA进行标准化。如表33中所示，仅利用ISIS444745的 处理减少人α1肌动蛋白RNA转录物表达。结果表示为相对于PBS 对照的α1肌动蛋白转录物的百分比抑制。

表33：HSA^LR小鼠中人α1肌动蛋白RNA转录物的百分比抑制

实施例20：在转基因小鼠中通过肌内施用的具有CUG重复的 mRNA的剂量依赖性抑制

进一步评估ISIS444745和ISIS444746体内减少人α1肌动蛋白 mRNA的能力。

处理

将HSA^LR小鼠维持在12-小时光/暗周期并且随意喂食正常普瑞 纳小鼠食物。在开始实验之前，使动物在研究设施中适应至少7天。 在PBS中制备反义寡核苷酸(ASO)，并通过将其通过0.2微米过虑器 过滤来进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9%PBS中以用于注射。

将小鼠分成六个处理组。其中三个组接受剂量为0.2nM、0.5nM 或1.0nM的ISIS444745至一侧上的胫骨前肌内的直接肌内注射。另 外三个组接受剂量为0.2nM、0.5nM或1.0nM的ISIS444746至一 侧上的胫骨前肌内的直接肌内注射。每一只小鼠的对侧胫骨前肌接受 单次剂量的PBS的肌内注射。将PBS注射的肌肉用作相应的利用ISIS 寡核苷酸处理的肌肉的对照。

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

如先前所述(Kanadia等人，2003,Science,302：1978-1980)，通 过对每一块肌肉使用30规同心针状电极和最少10次针插入对左右四 头肌、左右腓肠肌、左右胫骨前肌以及腰椎旁肌进行肌电描记术。数 据在表34中显示为在每一组的4只小鼠中观察到的平均肌强直等级， 并且显示了利用ISIS444745或ISIS444746处理的小鼠的肌强直的显 著减少。ISIS444745和444746对α1肌动蛋白的反义抑制的作用持 续至少6周。

表34：反义寡核苷酸处理的HSA^LR小鼠的肌肉中肌强直的剂量 依赖性减少

  0.2nM 0.5nM 1.0nM PBS 3.0 3.0 2.33 ISIS44745 1.67 1.00 0.33 PBS 2.50 2.00 3.00 ISIS44746 200 000 100

实施例21：在转基因小鼠中通过肌内施用的具有CUG重复的 mRNA的反义抑制的体内作用

评估HSA^LR小鼠包含多个CUG重复的mRNA转录物对肌强直 的反义抑制的作用。ISIS445236被包括在测定中作为阳性对照。

处理

将HSA^LR小鼠分成五个处理组。每周2次以25mg/kg的剂量给 前三组皮下注射ISIS444745、ISIS444746或ISIS444749，进行4周。 每周2次给第四组皮下注射PBS，进行4周。每周2次以25mg/kg 的剂量给第五组皮下注射ISIS445236，进行4周。将PBS注射的组 用作与寡核苷酸处理的组相比较的对照组。

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

如先前所述(Kanadia等人，2003,Science,302：1978-1980)，通 过对每一块肌肉使用30规同心针状电极和最少10次针插入对左右四 头肌、左右腓肠肌、左右胫骨前肌以及腰椎旁肌进行肌电描记术。数 据在表35中显示为在每一组的4只小鼠中观察到的平均肌强直等级。

利用ISIS445236的处理导致肌强直减少。利用ISIS444745和 ISIS444746的处理也在一些测试的组织中导致肌强直减少。

表35：反义寡核苷酸处理的HSA^LR小鼠的不同肌肉中肌强直的 平均减少

实施例22：在转基因小鼠中通过皮下施用的长CUG重复 mRNA(HSA^LR小鼠)和短CUG重复(HSA^SR小鼠)的剂量依赖性抑制

评估包含长CUG重复(HSA^LR小鼠)和短CUG重复(HSA^SR小鼠) 的mRNA的剂量依赖性抑制。HSA-短重复(HSA^SR)小鼠表达除5个 而非250个CUG重复被插入3′UTR外与HSA^LR小鼠相同的转基因。 HSA^SR小鼠不具有肌强直、剪接改变或任何其它可观察的肌强直表 型。将ISIS445236用于本测定。

处理

将HSA^LR小鼠分成四个处理组。每周2次以2.5mg/kg、8.5mg/kg 或25.0mg/kg的剂量给前三组皮下注射ISIS445236，进行4周。每 周2次给第四组皮下注射PBS，进行4周。将PBS注射的组用作与 寡核苷酸处理的组相比较的对照组。将HSA^SR小鼠也分成四组并且 进行类似处理。

α1肌动蛋白RNA的抑制

在最后一次给药后24小时，处死动物，并分离来自四头肌(左和 右)、腓肠肌(左和右)和胫骨前肌(左和右)的组织，分离RNA以用于 α1肌动蛋白的实时PCR分析，并将其针对18s RNA进行标准化。结 果示于表36和37中并且表示为相对于对照的α1肌动蛋白转录物的 百分比抑制。将HSA^LR小鼠的肌肉中保留在细胞核中的长重复的更 大抑制与HSA^SR小鼠的肌肉中非细胞核保留的短重复相比较。

表36：HSA^LR小鼠中人α1肌动蛋白RNA转录物的百分比抑制

表37：HSA^SR小鼠中人α1肌动蛋白RNA转录物的百分比抑制

实施例23：转基因小鼠中人DMPK的体内反义抑制

LC15小鼠品系A为包含完整人DMPK3′UTR的转基因小鼠(由 Wheeler等人，University of Rochester开发)。小鼠为与FVB背景回 交的小鼠的第二代。转基因在小鼠中表达为CUG重复RNA，其被保 留在细胞核中，形成与在患有肌强直性营养不良(DM1)的患者的人组 织样品中看到的相似的核内包函体或聚集点。在DMPK转基因中存 在350-400个CUG重复。此类小鼠显示DM1的早期体征并且在其肌 肉组织中未显示任何肌强直。

在体内评估在体外显示统计上显著的剂量依赖性抑制(参见实施 例5)的ISIS445569、ISIS444404、ISIS444436和ISIS473810的减 少人DMPK RNA转录物的能力。

处理

将LC15品系A小鼠维持在12-小时光/暗周期并且随意喂食正常 普瑞纳小鼠食物。在开始实验之前，使动物在研究设施中适应至少7 天。在PBS中制备反义寡核苷酸(ASO)，并通过将其通过0.2微米过 虑器过滤来进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9%PBS中以用于注射。

将小鼠分成五个处理组。每周2次以25mg/kg的剂量给前三个 组皮下注射ISIS445569、ISIS444404或ISIS444436，进行4周。每 周2次以12.5mg/kg的剂量给第四组皮下注射ISIS473810，进行4 周。每周2次给第五组皮下注射PBS，进行4周。将PBS注射的组 用作与寡核苷酸处理的组相比较的对照组。

DMPK RNA的抑制

在最后一次给药后24小时，处死动物，并分离来自四头肌的组 织。分离RNA以用于DMPK的实时PCR分析，并将其针对18s RNA 进行标准化。如表38中所示，利用反义寡核苷酸的处理减少人DMPK RNA转录物表达。结果表示为相对于PBS对照的DMPK转录物的百 分比抑制。

表38：LC15小鼠中人DMPK RNA转录物的反义抑制

ISIS编号 mg/kg/周 抑制% 444404 50 20 444404 50 55 444436 50 41 473810 25 56

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

如先前所述(Kanadia等人，2003,Science,302:1978-1980)，通过 对每一块肌肉使用30规同心针状电极和最少10次针插入对左右四头 肌、左右腓肠肌、左右胫骨前肌以及腰椎旁肌进行肌电描记术。由于 LC15小鼠不具有肌强直，因此对照组和处理组在测试的任何肌肉中 都未显示任何肌强直。

实施例24：转基因小鼠中人DMPK的体内反义抑制

LC15小鼠品系D为包含完整人DMPK3′UTR的转基因小鼠(由 Wheeler等人，University of Rochester开发)。小鼠为与FVB背景回 交的小鼠的第三代。转基因在小鼠中表达为CUG重复RNA，其被保 留在细胞核中，形成与在患有肌强直性营养不良(DM1)的患者的人组 织样品中看到的相似的核内包函体或聚集点。在DMPK转基因中存 在350-400个CUG重复。此类小鼠显示DM1的早期体征并且在其肌 肉组织中未显示任何肌强直。

在体内进一步评估ISIS445569、ISIS444404、ISIS444436和ISIS  473810的减少人DMPK RNA转录物的能力。

处理

将LC15品系D小鼠维持在12-小时光/暗周期并且随意喂食正常 普瑞纳小鼠食物。在开始实验之前，使动物在研究设施中适应至少7 天。在PBS中制备反义寡核苷酸(ASO)，并通过将其通过0.2微米过 虑器过滤来进行灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9%PBS中以用于注射。

将小鼠分成六个处理组。每周2次以25.00mg/kg的剂量给前三 个组皮下注射ISIS445569、ISIS444404或ISIS444436，进行4周。 每周2次以12.5mg/kg的剂量给第四组皮下注射ISIS473810，进行4 周。每周2次以6.25mg/kg的剂量给第五组皮下注射ISIS473810， 进行4周。每周2次给第六组皮下注射PBS，进行4周。将PBS注 射的组用作与寡核苷酸处理的组相比较的对照组。

DMPK RNA的抑制

在最后一次给药后24小时，处死动物，并分离来自四头肌的组 织。分离RNA以用于DMPK的实时PCR分析，并将其针对18s RNA 进行标准化。如表39中所示，利用反义寡核苷酸的处理减少人DMPK RNA转录物表达。结果表示为相对于PBS对照的DMPK转录物的百 分比抑制。

结果显示利用反义寡核苷酸的处理导致小鼠中DMPK mRNA的 抑制。

表39：LC15小鼠中人DMPK RNA转录物的反义抑制

ISIS编号 mg/kg/周 抑制% 444404 50.00 24 444404 50.00 30 444436 50.00 17 473810 25.00 7 473810 1250 18

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

如先前所述(Kanadia等人，2003,Science,302:1978-1980)，通过 对每一块肌肉使用30规同心针状电极和最少10次针插入对左右四头 肌、左右腓肠肌、左右胫骨前肌以及腰椎旁肌进行肌电描记术。由于 LC15小鼠不具有肌强直，因此对照组和处理组在测试的任何肌肉中 都未显示任何肌强直。

实施例25：SXL转基因小鼠模型中人DMPK的体内反义抑制

通过使用靶向hDMPK的ASO444401和299471，在SXL小鼠 中测量比目鱼肌中的靶敲低。SXL小鼠为完整DMPK基因和启动子 的转基因并且在DMPK基因的3′UTR中包含1000个CUG重复序列。 每周2次以50mg/kg的剂量给小鼠给药，进行4周(n=3小鼠/组，除 对于盐水注射的对照n=2外)。Taqman测定的结果显示利用ISISI  444401或ISIS299471的处理显著降低mut-hDMPK mRNA水平但对 内源小鼠Dmpk mRNA水平具有可忽略的作用。

因此，ISIS444401和ISIS299471选择性靶向人DMPK mRNA 转录物。

实施例26：在转基因小鼠中靶向人α1肌动蛋白的寡核苷酸的反 义抑制的作用的持续时间

评估ISIS190401在HSA^LR小鼠中对人α1肌动蛋白RNA转录物 的反义抑制的作用的持续时间

处理

每周2次以25mg/kg的剂量给HSA^LR小鼠皮下注射ISIS190401， 进行4周。每周2次给对照组皮下注射PBS，进行4周。将PBS注 射的组用作与寡核苷酸处理的组相比较的对照组。在施用最后一个剂 量后15周分析小鼠。

α1肌动蛋白RNA的抑制

在最后一次给药后15周，处死动物，并分离来自四头肌、腓肠 肌和胫骨前肌的组织，分离RNA以用于α1肌动蛋白的实时PCR分 析，并将其针对18s RNA进行标准化。如表40中所示，利用ISIS 190401的处理减少人α1肌动蛋白RNA转录物表达，并且该作用持 续至少15周。结果表示为相对于PBS对照的α1肌动蛋白转录物的 百分比抑制。

利用ISIS190401的处理导致在上文中指定的条件下α1肌动蛋白 mRNA水平的显著抑制。

表40：HSA^LR小鼠中人肌动蛋白RNA转录物的反义抑制

肌肉类型 抑制% 四头肌 74 腓肠肌 81 胫骨前肌 75

利用肌电描记术进行的肌强直的评估

如先前所述(Kanadia等人，2003,Science,302:1978-1980)，通过 对每一块肌肉使用30规同心针状电极和最少10次针插入对左右四头 肌、左右腓肠肌、左右胫骨前肌以及腰椎旁肌进行肌电描记术。数据 在表41中显示为在每一组的4只小鼠中观察到的平均肌强直等级， 并且显示了利用ISIS190401处理的小鼠中肌强直的显著减少。因此， ISIS190401对α肌动蛋白的反义抑制的作用持续至少15周。

表41：反义寡核苷酸处理的HSA^LR小鼠的不同肌肉中肌强直的 平均减少

选择性剪接的校正

为了评估ISIS190401对Serca1的选择性剪接的作用，在与实施 例13中描述的方法相似的方法中分析从胫骨前肌、腓肠肌和四头肌 纯化的总RNA。

在PBS处理的HSA^LR小鼠中，Serca1剪接失调，如通过外显子 22排斥所证明的。利用ISIS190401的处理导致全部三种肌肉类型的 Serca1基因的外显子22的完全包含和选择性剪接的正常化，该作用 即使在15周后仍然得到保持。

因此，α1肌动蛋白的反义抑制校正了Serca1剪接失调，这表示 利用反义寡核苷酸的处理减少了CUGexp在细胞核聚集点中的积累。 CUGexp在细胞核聚集点中的积累减少校正了MBLNl隔离，从而允 许正常剪接发生。

实施例27：人肌动蛋白的反义抑制的转录组作用的微阵列分析

具有扩大的CUG重复的肌动蛋白mRNA的表达引起肌肉转录组 的广泛重塑。为了评估ISIS190401和ISIS445236的总体转录组作用， 将微阵列分析用于HSA^LR小鼠。

处理

每周2次以25mg/kg的剂量给HSA^LR小鼠皮下注射ISIS190401 或ISIS445236，进行4周。每周2次给对照组皮下注射PBS，进行4 周。将PBS注射的组用作与寡核苷酸处理的组相比较的对照组。

利用微阵列进行的转录组分析

从野生型或HSA^LR小鼠的四头肌分离RNA。使用Agilent  Bioanalyzer(RNA完整性指数>7.5)验证RNA完整性。按照制造商的 建议，使用MouseRef-8v2.0Expression BeadChip试剂盒(Illumina,San  Diego)将RNA加工成互补RNA(cRNA)，并且使其在微珠上杂交。使 用BeadStudio软件(Illumina)定量图象数据。将信号强度进行分位数 标准化。在标准化之前，使用行特异性偏移(Row-specific offset)以避 免任何值小于2。来自所有具有6或更多个核苷酸的CUG、UGC或 GCU重复的探针组的数据被禁用(suppress)以消除杂交混合物中的扩 大的重复(源自mRNA中CUG重复的cRNA中的CGA重复)可与探 针中的重复序列交叉杂交的概率。为了消除其表达在阵列上不易定量 的基因，在所有样品中禁用显示小于0.1的检测概率的P值的探针。 通过平均表达水平的倍数变化和t检验概括组间比较，并且对其进行 排序。软件包R(Butler等人，Diabetes.2002；51：1028-34)用于对野 生型、ISIS寡核苷酸处理的和PBS处理的微阵列样品进行主成分分 析(Levin等人，Antisense Drug Technology：Principles,Strategies,and  Applications,S.T.Crooke,Ed.(CRC Press,Boca Raton,2008),第 183-215页；Geary等人，DrugMetab.Dispos.2003；31：1419-28)。 主成分允许在三维内捕获每一个样品的大部分表达变化。将每一个样 品的前3个主成分作图。

未处理的野生型和HS A^LR小鼠的主成分分析显示HSA^LR与野生 型小鼠在相隔较远的簇中分离。相反地，反义寡核苷酸处理的HSA^LR小鼠与野生型小鼠更紧密地聚簇，这显示了转录组标准化的总体趋 势。HSA^LR转基因小鼠与野生型小鼠的比较鉴定了其表达水平改变超 过2倍(P<0.0001)的93种转录物，如下面表42中显示的。此类转录 物的失调的程度下降或将其针对反义寡核苷酸进行标准化(88%的失 调的转录物响应ISIS445236,P<0.05，对于ISIS445236对PBS对照， 然而90%响应ISIS190401)。

为了考虑具有脱靶敲低的转录物，鉴定了所有其表达在反义寡核 苷酸处理的HSA^LR小鼠中下降的转录物(被寡核苷酸降低至1/2以下， P<0.0001,n=41个转录物)。被此类标准下调的所有转录物在HSA^LR小鼠中显示上调。唯一例外，胶原6α2可以因脱靶裂解产生，因为 其被具有无重叠序列的两个反义寡核苷酸下调。

这些结果表明利用反义寡核苷酸的处理(进行4周)导致肌肉转录 组的总体提高而无任何脱靶作用的证据。

表42：HSA转基因小鼠与野生型小鼠的比较鉴定了93个转录物