焦磷酸测序法定量检测人DMBT1基因特异性位点甲基化水平的引物

摘要

本发明公开了一种焦磷酸测序法定量检测人DMBT1基因特异性位点甲基化水平的引物，包括PCR引物和测序引物，其中，所述PCR引物的正向引物序列为：5’-GTTGTGGAATTAGTGTGAGATTTAGAA-3’，反向引物序列为：biotin-5’-AAATAATTTTTCCTAACAAAACATACTCTC-3’；所述测序引物序列为：5’-AAAGTTATTATGGATTTATGGT-3’。本发明在六价铬暴露人群中筛查DMBT1基因的特异性位点，并针对该特异性位点设计焦磷酸测序PCR引物和测序引物，通过焦磷酸测序能对该特异性位点的甲基化水平进行快速准确的定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及基因甲基化检测领域，尤其涉及一种焦磷酸测序法定量检测DMBT1基因特异性位点甲基化水平的引物。

背景技术

DNA甲基化是目前表观遗传学研究的热点，它是在DNA甲基转移酶的作用下，将甲基供体（-CH₃，S-腺苷甲硫氨酸）加到胞嘧啶上的一种化学修饰过程。在DNA甲基化与肿瘤关系的研究中，发现癌基因多为低甲基化，导致其重新开放或异常表达；抑癌基因多为超甲基化，其表达往往受抑制。因此，DNA甲基化与癌症关系密切，对DNA甲基化的研究不仅可为揭示肿瘤发生机制提供重要依据，而且可能为肿瘤的发生提供有效的预测标记。

DMBT1基因位于10号染色体长臂，由高度同源的重复外显子和内含子序列构成，该基因具有至少54个外显子，并且覆盖长达8kb的基因组区域。大量研究显示DMBT1基因转录和／或表达的异常与神经系统肿瘤、消化系统肿瘤、肺癌、乳腺癌等均有关。DMBT1基因在许多恶性肿瘤中常表现为表达缺失或下调，故其被认为是一个候选的抑癌基因。

目前，单个基因DNA甲基化检测方法有：

（1）甲基化特异性PCR（MS-PCR），DNA在亚硫酸盐作用后，分别用一对甲基化引物和一对非甲基化引物进行PCR扩增，产物跑胶后定性分析是否出现甲基化。

（2）亚硫酸氢盐测序PCR（BSP），经过亚硫酸盐处理后，设计引物进行PCR扩增获得目的片段，并对PCR产物进行克隆测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。该方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但因为涉及到测序，要得到准确的结果需挑取大量克隆，操作繁琐。

（3）甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM），通过熔解曲线分析可以将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，因此DNA样本经过亚硫酸盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析来发现。但该方法只能对检测片段整体甲基化情况进行分析，并不能明确每个CpG位点的甲基化状态。

（4）联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法（COBRA），DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，进行PCR扩增；扩增产物经纯化后用限制性内切酶（BstUI）消化。该方法最大的优点就是相对简单，可进行快速定量，且需要的样本量少。然而，它的局限性也十分明显，只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，且阴性结果并不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。

（5）焦磷酸测序(Pyrosequencing)，Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种三磷酸脱氧核糖核酸(dNTP)，若该dNTP与模板配对，DNA聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔量的焦磷酸基团(PPi)。PPi最终转化为可见光信号，出现一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。该方法根据序列延伸过程中C和T的掺入量来定量确定单个CpG位点的C-T比例，能够快速地检测甲基化的频率，由于技术限制扩增的片段较短(约60bp)，所以引物设计是实验成功的关键。

发明内容

本发明提供了一种焦磷酸测序法定量检测人DMBT1基因特异性位点甲基化水平的引物，利用该引物可以准确检测人DMBT1基因特异性位点的甲基化水平。

一种焦磷酸测序法定量检测人DMBT1基因特异性位点甲基化水平的引物，包括PCR引物和测序引物，

其中，所述PCR引物的正向引物序列为：

5’-GTTGTGGAATTAGTGTGAGATTTAGAA-3’，

反向引物序列为：

biotin-5’-AAATAATTTTTCCTAACAAAACATACTCTC-3’；

所述测序引物序列为：

5’-AAAGTTATTATGGATTTATGGT-3’。

本发明利用Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip kit甲基化芯片筛查六价铬暴露人群与对照人群基因组DNA甲基化谱之间的差异，发现六价铬暴露人群的基因组DNA中，DMBT1基因启动子区一个位点（该位点在上述甲基化芯片中的编号为：CG17976473）的甲基化水平明显高于对照人群。

由于甲基化芯片的筛测结果时有偏差，为检验该筛测结果的正确性，本发明采用焦磷酸测序对该位点的甲基化水平进行检测。检测方法包括如下步骤：

（1）提取人基因组DNA，对所述人基因组DNA进行重亚硫酸盐转化；

分别提取六价铬暴露人群和普通人群的基因组DNA，分别对所有样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；

（2）以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，针对位点CG17976473的上下游序列设计所述PCR引物和测序引物；

（3）以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，利用所述PCR引物和测序引物进行焦磷酸测序，分析CG17976473位点的甲基化水平。

经检测，六价铬暴露人群中CG17976473位点的甲基化水平明显高于普通人群，与甲基化芯片的筛测结果一致。表明CG17976473位点是DMBT1基因中的特异性位点。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明在六价铬暴露人群中筛查DMBT1基因的特异性位点，并针对该特异性位点设计焦磷酸测序PCR引物和测序引物，通过焦磷酸测序能对该特异性位点的甲基化水平进行快速准确的定量检测。

附图说明

图1为人基因组DNA的电泳结果图；

图2为焦磷酸测序PCR引物和测序引物与DNA模板的结合位置图；其中，由于位点CG17976473处的碱基C是否发生“C-T”转化还不确定，故以“Y”表示；

图3为焦磷酸测序PCR引物扩增产物的电泳结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

1、特异性位点分析

用Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip kit甲基化芯片筛查六价铬接触人群与对照人群基因组DNA甲基化谱之间的差异，发现六价铬暴露人群的基因组DNA中，DMBT1基因启动子区一个位点（该位点在上述甲基化芯片中的编号为：CG17976473）的甲基化水平明显高于对照人群，该特异性位点所在的序列为（SEQ ID No.1）：

gttgtggaattagtgtgagacccagaagactgtggccaaagctattatggacccatggtctcCGtggaatcatccctcatgacttctgctctctgatcacatccacactcatgtcatcctcgttcttccaaggtgaggttactagtactgcacaggggctgatgagagcatgtcctgccaggaaaaaccatcc（下划线标示的为位点CG17976473）。

为检验该筛测结果的准确性，本具体实施方式设计相关引物，利用焦磷酸测序法对该特异性位点的特异性进行验证。

2人基因组DNA提取

（1）采集40位志愿者（20位六价铬暴露人群志愿者，20为普通人群志愿者）外周抗凝血，用OMEGA血液基因组DNA提取试剂盒提取每个志愿者的基因组DNA，操作按照试剂盒说明书进行。

（2）对获取的基因组DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳分析，部分样本的分析结果如图1所示，未显示的部分样本的分析结果与之相同。

3重亚硫酸盐转化

使用德国QIAGEN公司转化试剂盒(EpiTect Bisulfite Kit)进行重亚硫酸盐转化，转化步骤按照该试剂盒说明书进行，转化程序如表1所示。

表1.重亚硫酸盐转化程序

StepTimeTemperature变性5min95℃复性25min60℃变性5min95℃复性85min60℃变性5min95℃复性175min60℃Hold不定*20℃

4、引物设计

以经重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，使用QIANGEN公司PyroMark Q96ID焦磷酸测序仪软件设计焦磷酸测序PCR引物及测序引物，并由上海桑尼生物技术有限公司合成。引物序列如表2所示。

表2焦磷酸测序PCR引物及测序引物信息

反向引物的5'端用生物素标记；引物与DNA模板的结合位置如图2所示。

5焦磷酸测序

（1）PCR扩增

分别以重亚硫酸盐转化前后的基因组DNA为模板，利用表2中的PCR引物进行扩增，PCR反应体系如下：

H₂O                               34.8μL

MgCl₂(KAPABiosystems)             5μL

10×buffer(KAPABiosystems)        5μL

dNTP(10mM/each,KAPABiosystems)        1μL

Primer(up50pM/μL)                    1μL

Primer(down50pM/μL)                  1μL

Template(DNA)                         2μL

KAPA2G Robust热启动酶Taq(5U/μL)      0.2μL(1U)

PCR反应条件为：

反应完成后对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳并拍照，部分样本的电泳结果见图3，未显示的部分样本的电泳结果与之相同。由图3可见，扩增条带的长度与预期相符。

（2）焦磷酸测序

在德国QIAGEN PyroMark Q96ID平台上、利用表2中的测序引物进行，具体步骤按仪器说明书进行。

（3）DNA甲基化检测结果

表3六价铬暴露组与对照组人群CG17976473位点甲基化水平比较

由表3可见，对照组人群中CG17976473位点甲基化水平的平均值为7.8±11.2%，而六价铬暴露人群中该位点甲基化水平的平均值为23.0±15.6%，经独立样本T检验，暴露组CG17976473位点的甲基化水平明显高于对照组（P<0.01）。该结果与甲基化芯片的筛测结果一致，说明CG17976473位点是DMBT1基因的特异性位点。

（4）结论

研究结果发现六价铬暴露人群中CG17976473位点的甲基化水平明显高于对照。因此，本发明针对CG17976473位点设计的焦磷酸测序PCR引物和测序引物可用于对六价铬暴露人群基因组DNA中CG17976473位点的甲基化水平进行定量检测。