使用血液中的循环黑素瘤细胞为黑素瘤患者预测临床结果的方法

摘要

本发明提供了用于捕获并检测在具有黑素瘤的患者的血液中的循环黑素瘤细胞(CMC)的自动化方法。在外周血液肿瘤载荷中检测的循环黑素瘤细胞的绝对数目部分地为生存、进展时间以及对治疗的响应预测中的因素。

说明书

背景技术

晚期黑素瘤的治疗因其异质性组织病理学和在肿瘤进展期间积累的构 成变化而复杂化。对具有转移性乳癌或结肠直肠癌的患者的循环肿瘤细胞进 行计数和表征已显示可提供在临床上重要且能够用于监测患者管理的独立的 预后和预测信息。

循环肿瘤细胞(CTC)已显示是原发癌、可能治愈的疾病阶段以及持续为 大多数恶性肿瘤的主要死亡原因的转移性疾病之间的关键环节。临床研究已 表明，CTC是转移性乳癌的作用很强后和预测性生物标记，并且据报道在 前列腺癌和结直肠癌领域已有类似发现。这些数据显示，CTC代表了驱动 转移性癌的基础生物学，并且表明对这些细胞进一步的细胞和分子分析能够 揭示对癌细胞转移的分子调控和对治疗的响应的新认识。

捕获、计数和表征CTC的方法已进行修饰以捕获、计数和表征患者的 血液中的循环黑素瘤细胞(CMC)。参见于2008年10月20日提交的美国专 利申请号12/254188，Automated Enumeration and Characterization of  Circulating Melanoma Cells in Blood。本申请在此以引用方式并入。尽管 CMC通过这种方法被捕获、计数和表征，但关于具有转移性黑素瘤的患者 的短期生存的预测价值是未知的。本发明为具有转移性黑素瘤的患者提供预 测总体生存的方法。

附图说明

图1：从全血中回收已知数目的掺料的SK-Mel 28细胞。将SK-Mel28 细胞掺料到健康供体样品内(即，在2天中的每一天，将0、5、18、72、 280和1183细胞掺料到来自五个健康供体的7.5mL血液内，在每种细胞水 平具有总共5个不同样品。掺料的细胞的数目与观察到的回收的细胞的数目 比较进行标绘。

图2：行A-E代表通过CellTracks软件鉴定为在来自黑素瘤 患者的样品中具有DAPI和PE信号的物体。从右到左，索引图像代表Ki67 FITC信号、CD45和/或CD34APC信号、DAPI信号、HMW-MAA PE信 号、以及DAPI(紫色)和HMW-MAA(绿色)信号的重叠。行A中的细 胞排除作为黑素瘤细胞，因为它表达CD45和/或CD34，行B和行C中的细 胞分类为不表达Ki67的黑素瘤细胞，并且行D和行E中的细胞分类为的确 表达Ki67的黑素瘤细胞。

图3：来自从黑素瘤患者的7.5mL血液获得的CellTracks的 典型CMC图像的图库。

图4：来自44个转移性黑素瘤患者的79个样品在55个健康供体的 7.5mL血液中的CMC的流行程度，小图A，以及在来自16个黑素瘤患者的 19个样品中表达Ki67的CMC的百分比，小图B。

图5：对于具有＜2个循环黑素瘤细胞/7.5ml全血的那些和在7.5ml全血 中具有≥2个循环黑素瘤细胞的组中那些，在具有转移性黑素瘤的患者中的 总体生存的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)概率评估。OS时间从每次血液抽取时 开始计算。生存中值对于具有＜2个CMC的组的12.1个月与对于具有≥2个 CMC的人的2.0个月比较(通过时序检验P＝0.001；在具有≥2个细胞 /7.5ml的患者中的死亡风险比，3.2)。

具体实施方式

本发明包括预测具有转移性黑素瘤的患者的总体生存的方法，包括：

a)从具有转移性黑素瘤的患者获得7.5ml血样，所述样品包含怀疑含 有循环黑素瘤细胞的混合细胞群；

b)富集所述样品的级分，所述级分包含所述循环黑素瘤细胞；

c)确认所述稀有细胞的结构完整性为未受损的；

d)分析所述未受损的稀有细胞；其中所述分析关联疾病进展；

e)评估所述血样中的循环黑素瘤细胞的数目

其中如果所述数目大于或等于2，预测所述患者的总体生存为 低，并且

其中如果所述循环黑素瘤细胞的数目小于2，预测所述患者的 总体生存为高。

在此所用的术语“富集”是指从步骤(a)的血样中分离CMC。富集方法 包括但不限于使用偶联至磁性颗粒的抗CD146。优选的方法是使用偶联至 磁珠的针对存在于黑素瘤细胞上的抗原的抗体以捕获来自血样的细胞。术语 “确认”是指确定分离的细胞是CMC还是其它细胞组分。确认方法包括但 不限于使用核酸染料或对于黑素瘤细胞特异性的单克隆抗体。优选的确认方 法是用不同荧光标记的单克隆抗体(并且优选的抗体是CD45 & CD34，以 排除白细胞和内皮细胞)和高分子量黑素瘤相关抗原HMW-MAA染色 CMC以鉴定黑素瘤细胞。术语“分析”是指评估捕获的CMC以确定CMC 是否表达多种黑素瘤特异性标记，例如HMW-MAA、MART-1(由T细胞 识别的黑素瘤抗原)和其它标记例如Ki-67。优选的分析方法是指确定 CMC是否表达Ki-67和/或HMW-MAA。术语“评估”是指确定在样品中有 多少CMC，并且使用包括但不限于自动化图像分析的方法。优选的评估方 法使用CellTracks

本发明通过下列方法和实施例加以证实。这些实施例和方法并不旨在 限制本发明的范围。

实施例

提供下列方法以有利于本发明的实践。

患者和血液收集。将血液从健康志愿者和具有恶性黑素瘤的患者中抽 取到抽成真空的10mL血液CellSave保存血液抽取管内(新泽西州拉里坦的 维里德克斯有限责任公司(Veridex LLC，Raritan，NJ))，并且在72小时内 加工。

患者均从牛津大学医学肿瘤学系(Department of Medical Oncology of the  University of Oxford)在邱吉尔医院(Churchill Hospital)加入，其使用研究伦理 委员会批准的方案。所有患者均提供书面知情同意书。44个患者加入，25 个男性和19个女性，并且他们的年龄范围为31-81岁(平均59岁)。在第 一次血液抽取时，39/44个(86％)具有转移性疾病，并且5个患者具有未切除 的III期疾病。具有转移性疾病的38/44个(78％)患者具有内脏病，5/44个 (11％)无内脏牵涉，并且对于1个患者，未记录转移部位。随访持续时间中 值是10.1个月。在静脉内疗法施用前或最低限度7天后，始终从癌症患者 中抽取血液。55个健康志愿者包括作为对照，并且在抽取时无已知疾病或 发热，并且无恶性疾病史。

细胞培养和细胞掺料。将黑素瘤细胞系SK-Mel28在包含补充有10％胎 牛血清的RPMI 1640的烧瓶中培养，并且随后无需胰蛋白酶化收获。细胞 悬液仅在如通过台盼蓝排除评估的其活力超过90％时使用。为了确定实际 细胞的数目，将200μL缓冲液和包含总共约20,000粒珠的20μL荧光珠(佛 罗里达州迈阿密的贝克曼库尔特有限公司(Beckman-Coulter，Inc.，Miami， FL))加入SK-Mel28细胞的50μL等分试样中。将SK-Mel28细胞用偶联至 PE的抗HMW-MAA染色用于检测。仅包含珠的一式两份管在流式细胞仪 (FACSCalibur；加利福尼亚州的圣约瑟的BD Biosciences(BD Biosciences， San Jose，CA))上运行，直至抽吸100％的样品。这提供了存在于20μL中 的珠的数目的准确评估量。实验管随后一式三份地在流式细胞仪上测试，直 至在每个管中计数10,000粒珠。使用已知数目的珠/单位体积确定SK-Mel28 细胞的数目。

样品制备将7.5mL血液转移至15mL样品管，并 且与6.5mL缓冲液混合，以800g离心10分钟，并且随后置于 (维里德克斯有限责任公司(Veridex LLC))上用于自动 化样品制备。将试剂最佳化用于黑素瘤细胞的捕获和检测，并且所述试剂由 下列组成：用免疫磁性富集黑素瘤细胞和内皮细胞的CD146抗体包被的铁 磁流体，使捕获效率达到最大的捕获增强试剂，与高分子量黑素瘤相关抗原 (HMW-MAA)(克隆9.2.27，维里德克斯有限责任公司(Veridex LLC))结合 以鉴定黑素瘤细胞的藻红蛋白偶联的抗体，鉴定白细胞(CD45，克隆 HI30，维里德克斯有限责任公司(Veridex LLC))和内皮细胞(CD34，克隆 581，BD Biosciences)的两种别藻蓝蛋白偶联的抗体的混合物，鉴定Ki-67 蛋白质(克隆B56，加利福尼亚州的圣约瑟的BD Biosciences(BD  Biosciences，San Jose，CA))的FITC偶联的抗体，鉴定有核细胞的核染料 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，以及洗涤、渗透化处理和重悬细胞的缓冲 液。在最后一个加工步骤中，将细胞重悬于细胞呈现装置(Cell  Presentation Device)(维里德克斯有限责任公司(Veridex LLC))中。通过 MagNest装置生成的磁场引起磁性标记的细胞均匀地分布在料筒的分析表面 上，准备用于使用CellTracks分析。

样品分析。将MagNest置于CellTracks四色半自动化荧 光显微镜上。捕获覆盖四个荧光滤光片立方各自的料筒的整个表面的图像 帧。包含PE以及DAPI阳性事件的图像呈现于图库中，用于通过用户基于 细胞荧光和形态来分类事件。关于物体待定义为黑素瘤细胞的标准包括圆形 至卵形形态、可见的核(DAPI阳性的)、关于HMW-MAA的正染色，以 及关于CD45和CD34的负染色。黑素瘤细胞分成KI67+和Ki67-细胞。细 胞计数的结果始终表示为细胞的数目/7.5mL血液。

黑素瘤细胞检测的准确度、灵敏度和线性。对于准确度、线性和灵敏 度实验，将SK-Mel28细胞以6种不同的细胞水平(0、5、18、72、280和 1183)掺料到7.5mL血液内，所述血液收集到CellSave保存管内。通过流 式细胞术确定掺料到血液内的确切细胞的数目。在掺料血液后，将样品在 CellTracks上加工24小时，并且用CellTracks分析。 样品测试经过不同的两天执行，在每种细胞水平上具有总共5个不同样品。

统计分析

主要终点为总体生存，测量为从取样日期到由于任何原因的死亡日期 的时间。丧失随访或在研究结束时仍活着的患者在他们已知活着的最后一个 日期或在研究日期结束时进行检查。如果每个患者存在多个样品，则最后一 个样品用于生存分析。使用卡普兰-迈耶法计算总体生存，并且生成生存曲 线图。Cox回归模型用于确定死亡风险比(HR)。结果在SPSS 16.0(美国伊 利诺伊州芝加哥的SPSS有限公司(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA))中进行 分析。

实旋例1

掺料的组织培养黑素瘤细胞系(SK-Mel28)的回收

在这个实施例中，描述了使用由SK-Mel28细胞掺料的全血的测定性 能。用于这个研究的方案如下。将全血从健康志愿者中抽取到CellSave管 内，并且用组织培养的黑素瘤SK-Mel28细胞掺料。将不同数目的SK- Mel28细胞掺料到血液内，并且测量回收。针对在样品中观察到的SK- Mel28细胞实际数目标绘的掺料到健康供体样品内的SK-Mel28细胞的期望 数目(即，0、5、18、72、280和1183细胞)显示于图1中，并且结果概 括于表1中。掺料细胞的平均回收是88％，伴随在最高掺料时74％的回收 与在5SK-Mel28掺料时的88％比较。皮尔森R²系数是0.99。可以预知，变 异系数(CV)随着掺料的细胞的数目下降而增加，范围为在1,183细胞掺料时 的7％至在5细胞掺料时的31％。SK-Mel28细胞的回收范围为64-120％，并 且不伴随更低的细胞的数目而下降。

表1：

方法准确度通过掺料到五个健康供体的7.5mL血液内的SK-Mel 28细 胞的回收进行测量。

循环黑素瘤细胞的鉴定将HMW-MAA PE和HMW-MAA PE，DAPI、 CD45/CD34APC和Ki67的重叠的索引图像呈现给操作者用于审查。核的存 在、HMW-MAA的表达、细胞形态、以及CD45或CD34表达的缺乏是 CMC的必需特征。图2显示呈现给审阅者的来自一个黑素瘤患者的6个事 件。小图A显示由DAPI和HMW-MAA以及由CD34和/或CD45染色的细 胞，并且因此不分类为CMC。小图B、C、D和E显示由DAPI和HMW- MAA但不由CD34或CD45染色的细胞，并且分类为CMC。在小图B和C 中的CMC不表达Ki67，而在小图D和E中的CMC表达Ki67。注意到在小 图B中的CMC包含两个核，并且不由Ki67染色，而在小图D中的CMC看 起来是主动分裂的，并且实际上表达Ki67。CMC的大小及其核质比在黑素 瘤患者内和之间的CMC之间极大地不同。图3显示具有特征性圆形至卵形 形状和未受损的核的来自不同患者的CMC图像图库。细胞大小经过从4μm 至30μm的广泛范围改变。还观察到小细胞簇和具多核的CMC。

实施例2

循环黑素瘤细胞在健康志愿者和黑素瘤患者中的频率

在该实施例中，描述了循环黑素瘤细胞在健康志愿者和黑素瘤患者中 的频率。CMC在来自健康供体的55个血样和来自具有转移性黑素瘤的44 个患者的79个样品中进行计数。图4的小图A显示在对照组和患者的 7.5mL血液中检测到的CMC的数目。在来自在其中检测到CMC的17个患 者的19个样品中确定Ki67表达的评估。Ki67+CMC的百分比范围为34- 100％，具有84％的平均值(SD25)。图4的小图B显示在这些样品中检测到 的Ki67表达和CMC的数目。在55个健康供体中，三个细胞分类为CMC， 并且所有三个都不表达Ki67。

实施例3

在黑素瘤患者中的循环黑素瘤细胞和总体生存

在对照组中的个体无一已检测到2个或更多个CMC，并且选择这个截 止以区别患者组。关于具有＜2CMC的那些患者的平均OS时间是12.1个月 (95％CI 9.7.-14.4)，并且显著长于关于具有≥2CMC的那些患者的平均OS 时间的2.0个月(95％CI 0.-4.9)(图5)。时序p是0.001。通过Cox回归的 死亡风险比是3.2(95％CI 1.6-6.5)。在血液抽取后1个月内死亡的四个患者 具有相对高数目的CMC(2、8、10和8043CMC/7.5ml)。