磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石三级仿生骨组织工程支架及其制备方法

摘要

本发明提供了一种仿生骨组织工程支架材料及其制备方法，该支架材料具有与天然骨组织相似的成分，以及具有无机/有机/无机三级仿生的类骨网状三维结构；该复合物通过定制磷酸钙陶瓷多孔结构仿生天然骨微孔结构，将以模拟体液（SBF）调制的胶原蛋白填充到多孔磷酸钙陶瓷基体中，经低温陈化模仿生物矿化过程，在胶原蛋白有机大分子基质上原位成核并经自组装结晶形成第三级类骨磷灰石层结构。制备的复合支架材料在材料成分及微观结构上仿生天然骨组织，显著提升了材料的力学性能及生物活性，在骨科临床上具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种由磷酸钙陶瓷、胶原蛋白和类骨磷灰石复合而成的三级仿生骨组织工程支架材料及其制备方法，属于生物医学材料领域。 

技术背景

天然骨是一种具有精密分级结构的复杂生物复合材料，它通过有机、无机成分共同构建而成，其有机成分主要是I型胶原蛋白（Type I collagen），它赋予骨组织弹性及韧性，其无机成分主要由磷酸钙（Calcium phosphate），尤其是生物磷灰石（Biological aptite）构成，它赋予骨组织足够的刚度和强度。天然骨的最小骨单元始于纳米晶磷灰石在胶原蛋白纤维上的沉积，胶原纤维以规则排列的阵列结构提供磷灰石的矿化形核位点并控制其取向，定向沉积形成长度大约为30-50 nm，宽度为10-30 nm，厚度为2-10 nm的骨晶体单元，无数的基本骨单元通过有序组装形成骨组织基本结构，赋予天然骨独特的材料结构和力学性能。 

理想的骨组织“修复”或者“替换”策略需要满足植入体的材料成分与受损组织相当或者接近，植入体材料结构尽量符合受损组织的解剖结构，同时具有足够的生物活性，容易整合修复周围骨组织，并有可能具有主动诱导、修复、重建骨再生的生物学功能。为此，理想的骨组织工程支架材料应当具有三维多级网络结构。其中一级基底结构可为成分与天然骨相似的可降解磷酸钙盐，同时要求具有特定的约几百微米大小的贯通孔隙，为支架提供初始强度和细胞生长及组织重建的空间；二级结构为支架内部复合的胶原基质，对支架起到有效地增韧补强和提高生物活性；三级结构为矿化纳米羟基磷灰石网络结构，它是支架/组织交接的重要生物活性界面，为骨组织的生长提供有效位点和所需的钙源。因此通过对天然骨自身的成分、结构特征及矿化过程进行仿生合成，进而获得具有较好生物学功能的仿生骨修复材料被视为硬组织修复的发展重点之一。 

由于天然骨在本质上主要是由磷酸钙和胶原蛋白复合而成，因此从仿生的角度，磷酸钙/胶原复合材料是骨组织修复替代材料的极佳选择。胶原蛋白是一种天然的聚合物，它是人体皮肤和骨头的主要有机成分，是骨基质中含量最丰富的蛋白质。胶原蛋白具有优良的生物相容性及低免疫力，适合作为新骨细胞贴附生长的基质，是一种用于骨组织修复的理想材料。最近已有研究致力于开发制备胶原蛋白基或以其作为添加相的生物材料用作骨组织的修复，但所得材料的综合性能以及仿生程度离应用要求尚有较大差距。 

因此，本发明提供了一种磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石三级仿生的骨组织工程支架材料及其制备方法。该支架材料通过定制一级多孔磷酸钙陶瓷赋予支架材料优异的力学性能和孔结构，灌注复合二级胶原纤维及矿化形成三级类骨磷灰石可高度仿生天然骨成分及结构，进一步提升支架生物活性，有望促进承力部位骨组织的修复重建。 

  

发明内容

本发明提供一种三级仿生的骨组织工程支架复合材料及其制备合成方法。 

本发明通过以下技术方案来实现： 

一种三级仿生的骨组织工程支架材料，主要由多孔磷酸钙陶瓷、胶原蛋白，类骨磷灰石层复合而成，具有无机/有机/无机三级仿生结构。所述的仿生支架材料由三级网络结构构成，其一级结构为定制的多孔磷酸钙陶瓷（作为基体材料），二级结构为复合于陶瓷孔结构中的胶原蛋白纤维，三级结构为通过仿生物矿化形成的类骨磷灰石层。所述三级结构高度模仿天然骨组织解剖结构。

作为优选方式，该仿生复合支架材料组分可灵活调整，各级成分的质量百分比（Wt%）为：磷酸钙陶瓷50%～90%，胶原蛋白9.5～45%，类骨磷灰石0.1～5%。 

作为优选方式，所述多孔磷酸钙陶瓷材料成分可为：羟基磷灰石、β相磷酸三钙或双相磷酸钙陶瓷。所述陶瓷的具有多级连通的仿生孔结构，可以采用双氧水发泡法或微球占位法或注浆法或其他方法设计定制。 

作为优选方式，所述多孔磷酸钙陶瓷孔隙结构特征为陶瓷总体孔隙率为60%～95%，大孔孔径为100～500微米，大孔之间有微孔相互贯通，大孔内壁布满毛细微孔。 

作为优选方式，所述胶原蛋白填充于陶瓷孔隙中形成三维胶原蛋白纤维网状结构。这种结构一方面有利于提高材料的力学性能，提升增韧补强的效果，另一方面与陶瓷基体材料的多孔结构形成锁合，使两者的结合更牢固，材料更稳定，同时也有利于细胞其上黏附生长。更重要的是所述三维网状结构胶原能够为钙磷离子的矿化沉积提供形核位点，同时为类骨磷灰石层的定向生长提供有机模板，促进生物矿化和类骨磷灰石层的形成，而且是所述类三级仿生结构均匀遍布于支架材料内部，而不是仅出现在材料表面。 

作为优选方式，所述胶原蛋白为I-型胶原蛋白。胶原蛋白是一种多糖蛋白，含有少量的半乳酸和葡萄糖，是细胞外基质的主要成分，同时也是人体中最重要的成分之一。它广泛存在于人体的皮肤、骨骼、肌肉、软骨、关节等组织之中。其中在人体硬骨组织中主要存在I-型胶原蛋白，它起着支撑、保护和修复等多重功效。I-型胶原蛋白主要由成纤维细胞或与 其来源类似的细胞如成骨细胞合成，它在促进骨细胞增殖、分化，诱导骨组织再生重建方面有着重要的生物功效。 

作为优选方式，所述胶原蛋白在与磷酸钙复合前采用与血清具有相同离子浓度的标准模拟体液（simulated body fluid，SBF）稀释。 

作为优选方式，所述SBF中各离子浓度为Na⁺=142 mM、K⁺=5.0 mM、Ca²⁺=2.5 mM、Mg²⁺=1.5 mM、HCO₃^-=4.2 mM、Cl^-=148.0 mM、HPO₄^2-=1.0 mM、SO₄^2-=0.5 mM，pH=7.2。 

作为优选方式，所述胶原蛋白在稀释前为20～50 mg/ml的水溶液，稀释后浓度为5～20 mg/ml。采用模拟体液稀释，为体系提供丰富的钙磷离子，有利于矿化过程中类骨磷灰石层的形成。 

作为优选方式，所述三级结构的类骨磷灰石层在胶原蛋白纤维上形成三维针状、片状纳米结构，此结构通过磷酸钙陶瓷基底及SBF提供的钙磷离子矿化沉淀形成。所述纳米结构更接近天然骨组织结构，高度模拟天然骨组织的形成过程。 

本发明的另一目的在于提供一种上述的三级仿生的骨组织工程支架材料的制备方法，其操作步骤包括： 

（a）制备互穿贯通多孔磷酸钙陶瓷，制备陶瓷多孔结构胚体，然后经烧结成瓷；

（b）配置胶原蛋白稀释液：以SBF溶液稀释配置胶原蛋白制备胶原蛋白稀释液；

（c）复合胶原蛋白/陶瓷二级结构：将步骤（a）中的多孔陶瓷浸没于步骤（b）中制备的胶原蛋白稀释液中，常温下抽真空灌注，从而将胶原蛋白以真空负压灌注的方式抽吸至多孔陶瓷孔中；

（d）静置矿化，将步骤（c）所得产物冷冻干燥，再静置1-3天，产品中水分挥发或蒸发的同时将以胶原蛋白纤维为模板定向结晶析出第三级纳米类骨磷灰石层；

（e）交联封装：将步骤（c）所得产物进行交联，最后对产品进行灭菌封装。

作为优选，所述步骤（a）中，陶瓷的孔结构采用双氧水发泡法或微球占位法或注浆法制备陶瓷多孔结构胚体，然后经马弗炉烧结成瓷，所述烧结的温度为1000～1200℃。 

作为优选，所述步骤（b）中，通过对所述胶原蛋白稀释液的PH值进行微调，使其PH在5.5～8.0，从而使所述类骨磷灰石层在胶原蛋白纤维上生长形成三维针状、片状纳米网络结构。 

作为优选，所述步骤（b）中，所配置的胶原蛋白稀释液浓度为5～20 mg/ml。 

作为优选，所述步骤（c）中，所述负压灌注过程，真空度要求0～10 Pa，保压1～3 小时。从而保证三维胶原蛋白纤维网状结构的形成确保复合质量。 

作为优选，所述步骤（c）中，所述负压灌注过程在超声波震荡辅助下进行，从而提高产品复合的均匀性。 

作为优选，所述步骤（c）至少重复进行一次。增加胶原蛋白的复合量，并进一步确保三维胶原蛋白纤维网状结构的形成，同时提高材料结合的牢固程度，保证复合物的稳定性。 

作为优选，步骤（e）中所述交联采用物理交联方法进行。作为优选方式，所述的交联方法为紫外交联(J Biomed Mater Res.1995,29(11):1373-1379)、辐照交联 (Radiat Res.1964,22(4):606-621)、干热交联(中国修复重建外科杂志.2005,19(10):826-830)中的一种。采用物理方法不引入其他化学试剂，避免了有毒、有害物质对生物陶瓷的污染，确保产品的生物相容性和安全性。 

本发明还提供了一种所述三级仿生的骨组织工程支架材料的用途：将其用作人体硬组织缺损的修复或骨组织工程用支架材料。特别是将其用于承力部位骨组织创伤修复。 

作为优选，本发明所述三级仿生的骨组织工程支架材料还可与药物、基因、细胞等复合制备具有特殊药物、生物学功能的骨组织工程支架。 

本发明的有益效果： 

1、本发明所述的仿生骨组织工程支架材料以磷酸钙陶瓷及胶原蛋白为原料，从材料组分上模拟天然骨的基质成分，显著提升了材料的生物相容性和生物活性，促进了其骨组织修复再生功能。

2、本发明所述的支架材料通过磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石三级仿生结构，模仿天然骨组织解剖结构，这种结构一方面提高了材料的力学性能，另一方面可以为细胞提供与天然骨相类似的微环境，有助于骨相关细胞的粘附、增殖及诱导新骨组织生成。 

3、本发明所述的仿生支架材料采用分级制作复合的途径，利于在材料各级制备工艺中控制、定制材料特性，如在多孔陶瓷制备阶段优化材料孔结构，在复合胶原阶段定制材料组分，在三级类骨磷灰石层合成阶段优化材料表面/界面生物学特性，从而使材料高度仿生天然骨，具备良好的骨诱导性和骨生成能力，迅速诱导新骨组织生成，增强骨连接和愈合功能。 

4、本发明所述的仿生支架材料的整个制备工艺中，无化学反应及有机溶剂参与，避免了有毒、有害物质对生物陶瓷的污染。产品具有良好的结构完整性和较好的力学性能，可按骨受损的修复要求，加工成各种形状，满足多种应用需求。 

  

附图说明

图1为本发明的制备工艺流程图； 

图2实施例中部分样品的扫描电镜(SEM)照片。其中 (a)为实施例中纯多孔磷酸钙陶瓷材料的SEM形貌图； (b)为实施例中多孔磷酸钙陶瓷材料内部孔隙中复合的胶原蛋白纤维SEM形貌图； (c)为实施例中多孔磷酸钙陶瓷材料内部孔隙中胶原蛋白纤维模板上生成的片状类骨磷灰石SEM形貌图。

图3为体外细胞培养结果。其中(a)为纯多孔β-TCP陶瓷（实验对照组)的骨髓间充质干细胞（MSCs）体外共培养2周激光共聚焦显微图；(b)为β-TCP/Collagen二元复合支架与骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外共培养2周的激光共聚焦显微图。(c)为本发明开发的三级仿生骨组织工程支架与骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外共培养2周的激光共聚焦显微图。 

图4为动物体内实验结果。其中(a)为实验平行对照样（纯多孔β-磷酸三钙陶瓷）经2.5个月兔子背部肌肉植入结果；(b)为β-TCP/Collagen二元复合支架动物实验结果；(c)为本发明开发的三级仿生骨组织工程支架的新骨组织形貌切片图。 

具体实施方法： 

为达上述目的，本发明按照下述方法制备磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石三级仿生骨组织工程支架材料，下面结合附图对本发明工艺作进一步详述。

本发明的制备工艺流程如图1所示。原材料的准备分为三个方面，其一是设计定制多孔磷酸钙陶瓷体；其二是I型胶原蛋白溶液的配制准备，它包括胶原蛋白的提取、纯化和对其免疫原性的清除；其三是配置标准模拟体液。本发明所适用的多孔磷酸钙陶瓷主要包括下列三类：羟基磷灰石（Hydroxyapatite,HA）、磷酸三钙陶瓷(beta-Tricalcium phosphate,β-TCP)、以及双相磷酸钙陶瓷(Biphasic calcium phosphate,BCP)，其中多孔陶瓷的制作可经由双氧水发泡法 (中国专利：CN1903384)、微粒占位法(中国专利：CN 1268583C)、注浆法（美国专利：No.3090094）或其他方法设计定制具有特定孔隙结构特征的多孔陶瓷胚体，然后经马弗炉煅烧成多孔磷酸钙陶瓷。本发明实施例使用的陶瓷由双氧水发泡法制备胚体，陶瓷总体孔隙率为60%～95%，大孔孔径为100～500微米，大孔之间有微孔相互贯通。本发明适用的胶原蛋白为所有种类胶原蛋白，本发明实施例使用经灭菌、纯化、去免疫端氨基酸的小牛牛皮I型胶原蛋白来示范本发明，其初始状态为20～50 mg/ml高纯浓度，经标准模拟体液稀释配置成5～20 mg/ml以灌注复合多孔磷酸钙陶瓷，合成后支架材料的各组分质量 百分比（Wt%）为：磷酸钙陶瓷50%～90%，胶原蛋白9.5～45%，类骨磷灰石0.1～5%。 

以下所列为本发明的几个最佳实施例，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。 

实施例1 

以羟基磷灰石多孔陶瓷为基底合成的三级仿生骨组织工程支架。其制作具体步骤如下：

1）定制多孔磷酸钙陶瓷产品。产品孔隙要求：整体孔隙率85%±5%、大孔孔径400±50μm、互穿贯通微孔孔径为80±20μm，切割为Φ15×2 mm的薄圆片；

a）将经湿法反应制得的羟基磷灰石粉末用标准型号筛子，筛选出直径为80～160μm的羟基磷灰石干粉，随后采用双氧水发泡法制备出20×20×50 mm多孔陶瓷胚体，低温＜100 ℃烘干；

b）将陶瓷胚体放入马弗炉中烧结，从常温以5 ℃/min的速率升温至1100 ℃持续2小时烧结，然后随炉冷却。随后分切割为Φ15×2 mm的薄圆试片；

2）配置胶原蛋白稀释液。将经灭菌、纯化、去免疫端氨基酸的小牛牛皮I型胶原蛋白，以标准溶液（SBF）稀释调制为5 mg/ml浓度；

3）真空灌注复合多孔陶瓷、胶原蛋白。以配制好的胶原蛋白稀释液浸没多孔陶瓷，常温抽真空至＜10 Pa进行灌注，保压3小时，再经超声波震荡搅拌10分钟，重复抽真空负压灌注过程一次。

4）静置矿化合成类骨磷灰石层。将灌注好胶原蛋白的试样静置24-72小时，干燥、挥发材料中的水分，在胶原纤维模板的诱导形核和介导下，材料体系中的无机矿物离子将结晶形成类骨磷灰石三维网络结构。 

5）交联。采用紫外交联的方法交联试样8小时，灭菌，储存。 

实施例2： 

以多孔β-磷酸三钙（β-TCP）陶瓷为基体合成三级仿生骨组织工程支架。多孔陶瓷基体孔隙率为85%±5%、大孔孔径为400±50μm、互穿贯通微孔孔径为80±20μm，其余产品制备工艺及步骤与实施例1相同。所得的多孔β-磷酸三钙陶瓷的扫描电镜图片如图2中（a）所示，图2中(b)为多孔磷酸钙陶瓷材料内部孔隙中复合的胶原蛋白纤维SEM形貌图，图2中(c)为多孔磷酸钙陶瓷材料内部孔隙中胶原蛋白纤维模板上生成的片状类骨磷灰石SEM形貌图。其中的磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石各级成分的质量百分比（Wt%）为：磷酸钙陶瓷～85%，胶原蛋白～14.5%，类骨磷灰石～0.5%。

实施例3 

其它条件及工艺同实施例2，不同之处在于采用高孔隙率的多孔β-磷酸三钙陶瓷为基体合成三级仿生骨组织工程支架。其陶瓷孔隙率95%±5%、大孔孔径为500±100μm、互穿贯通微孔孔径为100±20μm。所得的磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石各级成分的质量百分比（Wt%）为：磷酸钙陶瓷～80%，胶原蛋白～19%，类骨磷灰石～1%。陶瓷孔隙率的提升利于灌注复合更多的胶原蛋白，同时也有利于类骨磷灰石层的生成。

实施例4 

其它条件及工艺同实施例2，不同之处在于采用不同浓度的胶原蛋白进行制备，其胶原蛋白经模拟体液（SBF）调制为15 mg/ml浓度，所得的磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石各级成分的质量百分比（Wt%）为：磷酸钙陶瓷～85%，胶原蛋白～14.8%，类骨磷灰石～0.2%。该结果说明SBF溶液对合成无机/有机/无机三级结构生物支架材料的重要性，我们在其他实验中采用去离子水稀释胶原蛋白重复本发明步骤，无法得到三级结构的仿生支架材料。本实施例中下调了SBF含量导致材料体系中的钙、磷离子浓度降低，这不利于三级结构中的类骨磷灰石层形成。

实施例5 

将实施例2制备合成的三级仿生骨组织工程支架与骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外共培养2周，采用二乙酸荧光素/碘化丙啶(FDA/PI)对细胞进行染色，然后采用激光共聚焦显微镜观察并拍照，结果显示如图3中(c)所示，MSCs在该仿生骨组织工程支架材料中得到了明显的增殖、分化，相比实验对照组：纯多孔β-TCP陶瓷（如图3中a)及β-TCP/Collagen二元复合支架（如图3中b)，观察到的MSCs细胞数量及密度更大。此结果表明，这种三级仿生骨组织工程支架材料具有更好的生物相容性和生物活性，利于成骨相关细胞的增殖和分化。

实施例6 

将实施例2制备的三级仿生骨组织工程支架材料进行动物体内实验测试。将Φ3×6 mm的试样植入新西兰大白兔背部肌肉2.5个月取出，进行脱钙处理，染色、硬组织切片观察新生骨组织形貌，结果如图4中(c)所示，相比实验对照组：纯多孔β-TCP陶瓷（如图4中a)以及β-TCP/Collagen两级复合支架（如图4中b)所示结果，实验显示经2.5个月兔子背部肌肉植入，本实施例中的试样中有新生骨组织形成，新生骨组织的形成状况和成骨速度明显优于实验平行对照样，此结果表明，这种三级仿生骨组织工程支架材料具有诱导骨组织再生和增快骨缺损修补重建的功能。

以本发明的方法，制备出的磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石仿生骨组织工程支架材料，从材料的空间结构和组分上高度仿生天然骨组织，合成的三级仿生复合物支架材料不但具有 良好的生物活性，同时材料的力学性能得到了显著提升，在骨科临床上具有广阔的应用前景。 

实施例7 

将孔隙率为60%的多孔β-TCP陶瓷浸没于5mg/ml的胶原蛋白稀释液，常温下抽真空灌注，真空度为10Pa，保压1小时，冷冻干燥后，静置2天，对产物进行交联，灭菌封装。所得的磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石各级成分的质量百分比（Wt%）为：磷酸钙陶瓷～90%，胶原蛋白～9.5%，类骨磷灰石～0.5%。

实施例8 

将孔隙率为95%的多孔β-TCP陶瓷浸没于20mg/ml的胶原蛋白稀释液，常温下抽真空灌注，真空度为0.01Pa，保压3小时，所述负压灌注过程在超声波震荡辅助下进行，重复上述浸没和灌注过程5次，冷冻干燥后，静置3天，对产物进行交联，灭菌封装。所得的磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石各级成分的质量百分比（Wt%）为：磷酸钙陶瓷～50%，胶原蛋白～45%，类骨磷灰石～5%。

实施例9 

将孔隙率为82%的多孔β-TCP陶瓷浸没于10mg/ml的胶原蛋白稀释液，常温下抽真空灌注，真空度为5Pa，保压2小时，所述负压灌注过程在超声波震荡辅助下进行，重复上述浸没和灌注过程2次，冷冻干燥后，静置1天，对产物进行交联，灭菌封装。所得的磷酸钙/胶原蛋白/类骨磷灰石各级成分的质量百分比（Wt%）为：磷酸钙陶瓷～84.9%，胶原蛋白～15%，类骨磷灰石～0.1%。

  

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。