高效液相色谱法分离纯化植物内生细菌菌株抗菌肽的方法

摘要

一种高效液相色谱法分离纯化植物内生细菌菌株抗菌肽的方法，是以短短芽孢杆菌B-011为基础菌株，该菌株于2013年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7466，制备该菌株的发酵滤液，加入乙腈，混匀静置，离心，上清液经蒸发并浓缩，得抗菌粗提物；再采用高效液相色谱进行二次分离，得到抗菌肽活性单峰组分。本发明菌株B-011发酵滤液中的抑菌活性物质（抗菌肽）对番茄早疫病菌的孢子萌发有抑制作用，并表现出对芽管及菌丝有致畸效果。采用本发明的高效液相色谱法分离纯化该菌株发酵滤液中抑菌活性组分并对该物质进行鉴定，有助于明确该菌株抑制番茄早疫病菌的根本原因及开发新型抗菌药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌活性物质抗菌肽的分离纯化方法，具体涉及一种以高效液相色谱法分离纯化植物内生细菌菌株抗菌活性物质（抗菌肽）的方法。

背景技术

目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。

但是，现有抗菌肽的主要获取手段是化学合成和基因工程。化学合成肽类，成本较高。而通过基因工程，在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种高效液相色谱法分离纯化植物内生细菌菌株抗菌肽的方法，本发明人在烟草青枯病区采取健康烟草植株，从其茎杆内分离得到短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)B-011，并采用高效液相色谱法从短短芽孢杆菌B-011的发酵液中分离纯化得到抗菌活性物质即抗菌肽。

本发明所述的短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)B-011，已于2013年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCCNo.7466。

本发明菌株B-011具有如下性质：

菌株形态：将本发明菌株B-011在NA培养液中于28℃摇床（180r/min）培养30h，为杆状、产芽孢、周生鞭毛、革兰氏染色为阳性。菌株菌落圆形或不规则形、边缘呈波状；菌株芽孢呈柱状、中生或次端生。

生理生化特性：本发明菌株B-011的葡萄糖产酸、酪朊水解、明胶水解、接触酶试验均为阳性，葡萄糖产气、硝酸盐还原、淀粉水解、VP反应、厌氧生长、苯丙氨酸脱氨酶试验均为阴性。本发明菌株对碳源和氮源没有严格要求，适应性很强。

通过分析本菌株遗传特征的保守序列16S rDNA，发现本发明菌株B-011与短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)的同源性为99%，结合本发明菌株的菌株形态观察及生理生化性状检测结果，可以判定本发明菌株为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)的一个新种，命名为短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)B-011。

本发明菌株B-011发酵滤液中的抑菌活性物质（抗菌肽）对番茄早疫病菌的孢子萌发有抑制作用，并表现出对芽管及菌丝有致畸效果，是一个有生防潜力的菌株。采用高效液相色谱法分离纯化该菌株发酵滤液中抑菌活性组分并对该物质进行鉴定，有助于明确该菌株抑制番茄早疫病菌的根本原因及开发新型抗菌药物。

上述提及的采用高效液相色谱法分离纯化本发明菌株发酵滤液中抗菌活性物质（抗菌肽）的方法如下：

A、以短短芽孢杆菌B-011为基础菌株，该菌株于2013年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7466，制备短短芽孢杆菌CGMCC No.7466的发酵滤液；

B、取发酵滤液加入乙腈，使乙腈体积浓度为80%，充分混匀后静置20-25min，离心，上清液经旋转蒸发并浓缩（蒸发以去除液体，剩余物质用蒸馏水溶解才浓缩），得抗菌粗提物；

C、将抗菌粗提物采用高效液相色谱进行初步分离：SinoChrom ODS-BP柱，上样量为10mL，流速为20mL/min，检测波长为270nm，0.2%甲酸水和乙腈的混合洗脱液进行梯度洗脱，根据色谱峰收集对应的洗脱液，旋转蒸发除去有机溶剂，冷冻干燥，制得活性组分；

D、将制得的活性组分采用XAqua C18柱进行高效液相再次分离：上样量为100μl，流速为3mL/min，检测波长为270nm，0.2%甲酸水和乙腈的混合洗脱液进行梯度洗脱，根据色谱峰收集每个峰所对应的洗脱液，旋转蒸发除去有机溶剂，冷冻干燥，得到抗菌肽活性单峰组分。

上述步骤A中的发酵滤液是将短短芽孢杆菌CGMCC No.7466的种子液以1-4%接种量接种到BPY培养基中，初始pH7.0、28-30℃、180-200r/min振荡发酵培养48-56h；再将经发酵培养得到的液体培养物于常温以10000r/min离心10-15min，经孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤得到。

附图说明

图1是本发明菌株的发酵液对番茄早疫病菌孢子萌发的影响图(40×)。

其中：A表示50%发酵液处理(形成囊泡ap)、B表示10%发酵液处理(芽管成串珠状ap’)、C为对照(芽管p均匀细长)。

图2是本发明菌株发酵液对番茄早疫病菌菌丝的作用图(40×)。

其中：A为受到抑制的菌丝、B为正常菌丝。

图3是经初步分离得到的活性组分的HPLC分离图谱。

图4是经HPLC分离得到的活性组分对番茄早疫病菌孢子萌发的抑制作用。

图5是经HPLC分离得到的活性组分的纯度检测。

图6是HPLC洗脱峰活性组分的一级正离子质谱图。

图7是HPLC洗脱峰活性组分的一级负离子质谱图。

图8是HPLC洗脱峰活性组分的二级正离子质谱图。

图9是HPLC洗脱峰活性组分的二级负离子质谱图。

具体实施方式

实施例1本发明菌株B-011的制备

将从湖南省长沙市烟草青枯病区采集的健康烟草植株样品用无菌水冲洗干净，然后用灭菌滤纸吸干水分，再用70%的酒精清洗，把样品放在酒精灯上表面灭菌，用无菌刀把植株茎的表皮切去，切取小量木质部放入盛有10ml无菌水的试管中，静置30min后，梯度稀释10^-1-10^-4，每个梯度取1ml菌液涂抹于BPA平板培养基上，每个浓度涂1个平皿，重复3次，置于28-30℃恒温箱中培养。培养3天后，挑取不同形态的菌落重新于平板上划线纯化，即得本发明菌株。最后移入试管斜面保存备用。

实施例2本发明菌株B-011菌发酵滤液的制备

种子液制备：将斜面保存的本发明菌株接入BPY培养液中，装液量100mL/250mL、初始pH7.0、30℃、180r/min振荡培养24h。

发酵培养：以1%接种量将种子液接种到BPY培养基中，装液量100mL/250mL、初始pH7.0、30℃、180r/min振荡发酵培养48h。

发酵液处理：将经上述发酵培养得到的液体培养物于常温以10000r/min离心10min，上清液经孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，得到含有抑菌活性物质的发酵滤液。

BPY培养液/培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏5g，NaCl5g，葡萄糖5g，水1000mL，pH7.0。

实施例3本发明的发酵滤液对番茄早疫病菌孢子萌发的影响

将番茄早疫病菌于PDA上培养一定时间后使其产孢，用少量无菌水将病菌孢子洗下来，加无菌水稀释到40倍物镜下，每视野中40个孢子。取上述配制的孢子悬浮液加入等体积的不同浓度的上述发酵滤液，混均，以加无菌水为对照，取10μL滴加于凹玻片上。28℃保湿培养24h，观察孢子子萌发情况，每个处理3次重复。孢子芽管长度大于孢子直径视为萌发。

结果显示，对照组孢子形成细长、光滑、均匀的芽管(见图1C)。50%发酵滤液使孢子发芽点处出现囊泡(见图1A)，从而完全抑制孢子萌发。10%发酵滤液使芽管畸形，中间或顶端膨大，或成串珠状(见图1B)，而且受抑制的孢子芽管长度明显也小于对照组。同时，发酵滤液对番茄早疫病菌菌丝生长及菌丝形态有明显影响，在发酵滤液边缘处，病原菌菌丝不能向外生长，形成一条抑菌条带。挑取抑菌带边缘的番茄早疫病菌菌丝镜检发现，番茄早疫病菌菌丝生长异常，菌丝细胞畸形，菌丝节间变短变粗，粗细不均匀，细胞原生质收缩，出现空泡(见图2A)。正常菌丝光滑，透明，粗细均匀，原生质分布均匀(见图2B)。

实施例4本发明菌株抗菌活性物质抗菌肽的分离纯化

取发酵滤液加入乙腈，使乙腈体积浓度为80%。充分混匀后静置20min，10000r/min离心10min。上清液旋转蒸发去除液体，剩余物质用蒸馏水溶解，并浓缩100倍，得抗菌粗提物。

将抗菌粗提物采用SinoChrom ODS-BP柱(10.0mmφ×250mm，5μm）进行制备高效液相色谱（依利特P270双泵）初步分离。洗脱液A:0.2%甲酸水，洗脱液B:乙腈，上样量为10mL，流速为20mL/min，检测波长为270nm，梯度洗脱，洗脱梯度见下表1。根据色谱峰进行手动分部收集对应的洗脱液，旋转蒸发除去有机溶剂，冷冻干燥，平皿打孔法检测抑菌活性。

表1抗菌活性物质HPLC初步分离洗脱条件

梯度时间(min)A：B105:9522050:5033095:543595:5

将制得的活性组分采用XAqua C18柱(7.8mm×150mm,5μm)进行高效液相(美国安捷伦1100series)再次分离。条件：上样量为100μl，流速为3mL/min，检测波长为270nm，洗脱液A:0.2%甲酸水，洗脱液B:乙腈，梯度洗脱，洗脱梯度见下表2，该活性组分的HPLC分离图谱见图3。根据色谱峰进行手动收集每个峰所对应的洗脱液，旋转蒸发除去有机溶剂，冷冻干燥，得到具有活性的单峰组分E，采用孢子萌发法检测其抑菌活性，见图4，表明该活性组分E对番茄早疫病菌孢子萌发具有抑制作用。

表2活性组分HPLC分离洗脱梯度条件

梯度时间(min)A：B1090:1021070:3032550:5043040:6053510:90635.190:1074090:10

实施例5活性物质的检测

将XAqua C18柱分离后收集的具有活性的单峰组分E，采用XAqua C18柱(7.8mm×150mm,5μm)进行高效液相(美国安捷伦1100series)分析。洗脱液A:0.2%甲酸水,洗脱液B:乙腈，上样量为1μl，流速为1mL/min，检测波长为270nm，按上表2的洗脱梯度条件进行纯度检测，洗脱曲线为单一峰，表明其纯度已达到化学结构测定的要求，见图5。

并且，将XAqua C18柱分离后收集的具有活性单峰组份，进行质谱分析。质谱分析由中国药科大学分析测试中心完成。采用英国Micromass公司Micro MassQ-Tof Micro MS/MS质谱仪测定活性物质的相对分子质量，并对一级质谱的主要离子峰进行二级质谱分析。TOF MS ES+质谱图(见图6)[M+Na]⁺中质量数最高峰是m/z687；TOF MS ES-质谱图(见图7)中质量数最高峰是m/z663。图8是正离子对m/z687.4离子做的二级质谱图，图9是负离子对m/z663.1离子做的二级质谱图。根据两种模式的离子峰强度和质荷比，推测出活性组分化合物的分子质量为664，为抗菌肽。