一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒

摘要

本发明公开了一种一管PCR式鉴别诊断鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID NOs：1-3。本发明的试剂盒适合鉴定鹅或番鸭动物的肝、脾和肾脏组织样品、泄殖腔棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物样品中的GPV和MDPV。所述试剂盒在使用时包括下述步骤：(1)从待检鹅或番鸭动物获取待检样品，并对待检样品提取基因组DNA；(2)将步骤(1)获得的待检样品的基因组DNA与三种引物SEQ ID NOs：1-3一起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和(3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物大小鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒，其中约700bp的特异性DNA条带表示存在鹅细小病毒，约300bp的特异性DNA条带表示存在番鸭细小病毒，同时存在约700bp和约300bp的条带表示同时存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一管PCR式鉴别鹅细小病毒 和番鸭细小病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、 PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID NOs：1-3。本发明还提供 SEQ ID NOs：1-3所示的引物在制备一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细 小病毒的试剂盒中的应用。

背景技术

鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)可引起雏鹅急性或亚急性败血性 传染病^[1]，它不仅侵害雏鹅和4-8周龄小鹅，也感染雏番鸭^[2]，危害极为严 重；番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV) 引起并且以雏番鸭为易感群体的一种急性传染性病毒病，临床表现为腹 泻、呼吸困难、脚软、渗出性肠炎等，死亡率和发病率都很高^[3]。GPV和 MDPV在理化特性、形态结构包括基因组结构以及免疫学特性等方面非常 接近，但二者在致病性上却有较大差异：MDPV只能感染番鸭及番鸭源细 胞，GPV既能感染鹅又可以感染番鸭及其体外培养细胞。二者均属于细小 病毒科细小病毒属，在形态上难以鉴别，同时在血清学上又有交叉反应^[4]， 目前急需一种特异性强、快速灵敏且能够区分这两种疾病的诊断方法。NS 蛋白为病毒的非结构蛋白，在进化过程中较为保守，主要参与DNA的复 制和转录的调节^[5]。

根据GenBank中GPV和MDPV NS基因序列保守区设计1个通用上 游引物，在根据GPV和MDPV毒株序列各自特异性保守区设计两个下游 引物；获得扩增片段为部分NS2蛋白的基因序列，根据扩增片断长短不同 进而达到快速鉴别感染病毒GPV和MDPV的目的。

发明内容

本发明的目的是通过一管PCR来鉴别鹅细小病毒(Goose parvovirus， GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)。

为实现上述目的，本发明提供一种一管PCR式鉴别诊断鹅细小病毒 (Goose parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV) 的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用 说明。

本研究在引物设计过程中充分考虑了引物的普适性，包括了GenBank 中所有的国家和地区的代表性毒株。例如，GPV病毒包括了匈牙利、德国、 中国和台湾地区，病毒分离株时间跨度为30余年(1960s年代至-2009年)。 由于GenBank MDPV病毒只有中国和匈牙利报道过3个毒株，时间跨度 为1988年至1996年间的代表性毒株。GPV和MDPV的NS基因具有细 小病毒普遍存在的高度保守区，和针对不同型病毒特异性保守区；根据 GenBank收录的GPV和MDPV的NS基因保守区(见图1、图2、图3)， 设计合成了3个特异性引物。其中上游引物依据GPV和MDPV高度保守 区设计了GPV  和MDPV  的通用引物pGDP： 5’CTATTGCCCATGCTGTACCCTTCTATGGCTG3’(图1，SEQ ID NO：1)， pGDP引物序列对于GPV和MDPV都高度保守，表明该引物序列可用于 GPV和MDPV毒株的PCR扩增；另外根据GPV和MDPV各自毒株序 列的特异性分别合成了各自的下游特异性引物：MDPV的下游引物为 pDPR：5’CCTTCCAGCTTATGGGAAAGA3’(图2，SEQ ID NO：2)，引 物序列对于MDPV毒株高度保守，但对于GPV则差异性较大，因此该引 物序列只适用于MDPV的PCR扩增；GPV的下游引物为pGPR：5’ ACATCCATAGAATTGTCATAAG3’(图3，SEQ ID NO：3)，引物序列对 于GPV毒株高度保守，而对于MDPV则差异性较大，表明该引物只适用 于GPV毒株的PCR扩增检测，不能扩增或检测MDPV毒株。因此，该3 对引物可以用于GPV和MDPV的鉴别诊断。

表1.引物设计所用番鸭和鹅细小病毒信息

在本发明的试剂盒中，所用的引物是利用GPV和MDPV的NS基因(见 图1、图2和图3，SEQ ID NO：4-16提供了一些MDPV毒株和一些GPV 毒株的NS基因序列)进行设计的，其上游引物对GPV和MDPV是通用的， 下游引物是针对不同类型的毒株本身的特异性保守区进行设计的。引物设 计参考的GenBank毒株如下：

具体的，本发明的试剂盒共包含三条引物：上游通用引物SEQ ID NO： 1，对番鸭细小病毒特异性的下游引物SEQ ID NO：2和对鹅细小病毒特 异性的下游引物SEQ ID NO：3。

在本发明的试剂盒中，所用的处理待检样品的试剂主要是基因组DNA 提取试剂。一般地，待检样品可以为待检鹅或番鸭动物的肝脏、脾脏、棉 拭子、鸭或鹅尿囊液以及细胞培养物。本领域技术人员可以根据所用的待 检样品选择适当的基因组DNA提取试剂和基因组DNA提取方法，这是在 本领域技术人员的能力范围之内的。例如，常用的基因组DNA提取方法 是蛋白酶K提取方法[6]，其主要使用蛋白酶K，苯酚/氯仿/异戊醇(体积 比为1∶1∶1)混合液，醋酸钠和乙醇等。

在本发明的试剂盒中，所述PCR试剂包括PCR酶，例如，Taq，dNTP 储液等，这些PCR试剂均为市售试剂，对其没有特别的要求。

使用本发明的试剂盒检测待检样品时，首先利用基因组DNA提取试 剂对待检样品提取DNA，将提取的基因组DNA与试剂盒中的3个引物放 在同一个PCR管中，加入适量的PCR试剂，通过一次PCR，最后将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色显现PCR产物。根据PCR产物的大小 即可判断是否为水禽细小病毒感染，并区分感染的类型是GPV还是 MDPV。具体地，没有300bp和700bp的特异性扩增条带结果表示没有 GPV和MDPV的感染；扩增产物为300bp表示是番鸭细小病毒感染，扩 增产物为700bp表示是GPV感染；扩增产物300bp和700bp都有表示是 GPV和MDPV共感染。

表2.一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒中的引物序列

相应地，本发明还提供一种一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小 病毒感染的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)从待检鹅或番鸭动物获取待检样品，并对待检样品提取基因组 DNA；

(2)将步骤(1)获得的待检样品的基因组DNA与三种引物SEQ ID  NOs：1-3一起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和

(3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物鉴别鹅细小病毒和番鸭细 小病毒。

其中，步骤(1)的待检样品取自鹅或番鸭动物的肝脏、脾脏、棉拭 子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物。

步骤(2)的PCR扩增条件可以为94℃，2min；94℃40s，55℃30s， 72℃1min，25个循环；最后72℃，7min。

优选地，步骤(2)的PCR扩增条件为94℃预变性3min；94℃变性 30s，55℃退火30s；72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸7min。

步骤(3)所述的PCR鉴别方法具体可为：进行一次PCR反应，反应 结束后进行PCR样品凝胶电泳，紫外灯下观察电泳胶的特异DNA条带。 GPV阳性对照在约700bp处有一条特异的DNA条带；MDPV阳性对照在 约300bp处有一条特异的DNA条带，阴性对照则无相应的特异条带出现。

本领域技术人员应该理解，上述取样方法、PCR程序的选择以及鉴定 PCR产物的方法均为本领域的常规技术，本领域技术人员可以进行适当的 调整。

本发明还提供SEQ ID NOs：1-3所示的引物在制备一管PCR式鉴别 鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒的应用。

由此可见，本发明的优点是：提供了一种一管PCR式鉴别鹅和番鸭 细小病毒的试剂盒和方法，该试剂盒和方法具有快速、灵敏、特异、经济 和适用范围广的特点。具体地，一方面，只需合成3个引物，上游引物为 通用引物；另一方面，只需一管一次PCR反应，2-3小时后，即可判定是 否为GPV或MDPV感染，无需多次重复PCR反应，据有经济和节省时间 的优点。再一方面，可从肝脏、脾脏、肾、棉拭子、鹅或鸭胚尿囊液以及 细胞培养物中鉴定GPV和MDPV，范围广。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显， 其中：

图1显示MDPV和GPV毒株NS基因共有序列分析，阴影部分为 MDPV和GPV通用性引物pGDP序列选择区。

图2显示MDPV和GPV毒株NS基因序列分析。阴影部分为MDPV 特异性引物pDPR序列选择区。

图3显示MDPV和GPV毒株NS基因序列分析。阴影部分为GPV特 异性引物pGPR序列选择区。

图4显示鹅细小病毒和番鸭细小病毒一管PCR扩增结果，其中，泳 道1：DNA分子量标准(DL2000)；泳道2：鹅细小病毒D3LV株扩增产 物；泳道3：鹅细小病毒广东株扩增产物；泳道4：番鸭细小病毒HLJ-5 扩增产物；泳道5：番鸭细小病毒WDPV3扩增产物；泳道6：番鸭细小 病毒Guangdong-2扩增产物；泳道7：番鸭细小病毒HE扩增产物；8： DNA分子量标准(DL2000)；9：阴性对照。

具体实施方式

以下通过具体实施例描述本发明，然而，本领域技术人员应该理解， 所述实施例仅是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围。

除非另外说明，下述实施例中用到的试剂均为市售试剂。

实施例1：一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒

1.获取被检样品

以本领域的常规取样方式选用鹅或鸭的肝脏、脾脏、肾、棉拭子、鹅 或鸭胚尿囊液以及细胞培养物，被检样品应新鲜，或-20℃保存。

样品的预处理：

取3g肝脏、脾脏或肾样品加入3倍体积的PBS溶液研磨成悬浮液， -20℃冻融3次，常温下1000g离心10分钟，取上清用于DNA的提取； 棉拭子反复捻动后去拭子，样品1000g离心10分钟，取上清用于DNA的 提取；鹅或鸭胚尿囊液以及细胞培养物直接用于DNA的提取。

阴性样品：选取鸭胚或鹅胚尿囊液。阳性样品：GPV和MDPV接种 鹅胚或鸭胚后收取的尿囊液。

2.样品DNA的提取：

采用蛋白酶K的方法[6]提取病毒基因组DNA，方法如下：取上述经 过预处理的上清样品200μL，加入蛋白酶K(购自Merck生物技术有限公 司)并使蛋白酶K终浓度为100μg/mL，混匀后置50℃水浴1h后，将样 品用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比1∶1∶1)抽提2次，充分振摇， 12000rpm离心10min，取上清液并用1/3体积醋酸钠和2倍体积无水乙醇 混匀，置-20℃冰箱30min；后在12000rpm离心10min，弃上清，室温干 燥，加入20～30μL ddH₂O溶解沉淀，-20℃保存备用。

3.一管PCR反应鉴定GPV和MDPV

PCR  反应所需引物：上游通用引物pGDP： 5’CTATTGCCCATGCTGTACCCTTCTATGGCTG3’(SEQ ID NO：1)，MIDPV 特异性下游引物pDPR：5’CCTTCCAGCTTATGGGAAAGA3’(SEQ ID NO： 2)。(所用的引物均由哈尔滨博士生物技术公司合成)。GPV特异性下游引 物pGPR：5’ACATCCATAGAATTGTCATAAG 3’(SEQ ID NO：3)，

PCR反应体系：在0.5ml PCR管(购自弘博生物技术有限公司)中一 次加入双蒸水15.8μL，提取的待检样品基因组DNA 3μL，10×PCR缓冲液 2μL，dNTPs 1μL，引物pGDP、pGPR和pDPR各1μL，Ex-Taq酶0.2μL。 PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s；72℃延 伸1min，25个循环；最后72℃延伸7min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测(图1)，同时加入2kb DNA 标准分子量作为参照(泳道1和8)，取凝胶置于紫外灯下观察。

结果判定：GPV和MDPV阳性对照分别在约700bp和300bp处各有 一条特异的DNA条带，阴性对照则无相应的特异条带出现，待检样品在 700bp相应位置出现特异条带则判定分别为GPV感染(泳道2，3)，待检样 品在300bp相应的位置出现特异性条带则判定为MDPV感染(泳道4，5， 6，7)；如果待检样品在700bp和300bp没有相应的条带则证明无GPV 和MDPV感染(泳道9)。

进一步验证：将获得的样品700bp和300bp PCR产物进行胶回收(使 用购自上海华舜生物技术有限公司的胶回收试剂盒)后进行测序，将序列 提交GenBank进行BLAST比较分析。BLAST结果显示：700bp和300bp PCR产物序列分别与GenBank中的GPV和MDPV序列的同源性最高，进 一步验证检测结果的正确性。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地 显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权 利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式 和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

参考文献

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