高效液相色谱-串联质谱法同时测定细菌群感效应AHLs类分子的方法

摘要

本发明涉及分析化学领域，公开了一种同时测定细菌群感效应AHLs类分子的方法，将待测样品加入高效液相色谱串联质谱联用仪中梯度洗脱；洗脱条件为：用A相（含10mmoI/L乙酸铵、0.2%甲酸的甲醇）和B相（含有10mmoI/L乙酸铵、0.2%甲酸的水溶液）进行洗脱；梯度洗脱的参数为：0min：A相20%、B相80%，瞬间达到设定的比例；0～8min，两种流动相均速变化到A相100%、B相0%；8～10.1min，A相100%、B相0%；10.1min时，瞬时调整为A相20%、B相80%；洗脱至15min。本方法线性关系好，检出限0.1～1.0ng/L，准确度灵敏度高、操作简单。

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体为一种细菌群体感应分泌AHLs类信号分子 的测定方法。

背景技术

信号分子（N-酰基高丝氨酸内酯，N-acyl-homoserine lactones,简称AHLs） 又称自诱导剂，是微生物之间发生群体感应效应(Quorum sensing)的关键物质， 微生物通过信号分子的分泌、释放、感应进行种内及种间的相互交流并完成某种 特性的表达。群体感应效应是指微生物细胞通过相应的感应系统感应细胞外的小 分子自诱导剂的浓度，从而感知菌群密度的大小。当菌群密度达到一定的阈值时， 激活一系列的目的基因并表达相应特性的方式。研究发现，很多细菌中都存在着 类似的机制，例如革兰氏阴性菌所释放的AHLs类信号分子与其弹性蛋白酶、绿 脓菌素、鼠李糖脂等的含量、凝集素及溶血素等因素有关。

目前，对细菌信号分子的分析方法包括薄层层析与细菌生物感应器相结合 (TLC-Biosensor)的方法，GC-MS法及HPLC-MS法。其中TLC-Biosensor法目前广 泛采用，但不同的细菌生物感应器对不同酰基侧链长度的AHLs敏感性不同，如 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)对酰基侧链C-3羰基取代的AHLs敏感性 最强，而紫色杆菌（chromobacterium violaceum CVO26）对短链的C-3没有取代 基的AHLs比较敏感，因此不能准确地定性AHLs的种类，此方法也无法进行精密 的定量分析。GC-MS及HPLC-MS的分析技术发展较快，能够对细菌所释放AHLs 进行定性分析，但其在混合进样及微量定量分析上无法满足实验的需求。目前， 有关HPLC-MS/MS对AHLs类信号分子进行定性及定量分析的研究鲜有报道， Daniele Morin等利用HPLC-MS/MS对AHLs类信号分子进行了分析，但其检测方 法分析时间较长（约为40min），操作繁琐，灵敏度低。本研究使用HPLC-MS/MS， 采用MRM模式，可在低浓度领域快速同时定性，定量11种信号分子，并在实际 应用中对铜绿假单胞菌培养液中AHLs类信号分子进行了定性与定量的分析。

发明内容

本发明旨在提供一种分析方法，能同时测定细菌群体感应分泌的11种AHLs 类信号分子。

技术方案为，一种高效液相色谱-串联质谱法同时测定细菌群感效应AHLs 类分子的方法，包括如下步骤：

待测样品加入高效液相色谱串联质谱联用仪中，梯度洗脱；

所述的洗脱条件为：用A相和B相液体进行洗脱，所述的A相液体为含有 10mmoI/L乙酸铵，0.2%甲酸的甲醇；所述的B相液体为含有10mmoI/L乙酸 铵，0.2%甲酸的水溶液；

梯度洗脱的参数为：0min：A相20%、B相80%，瞬间达到设定的比例；0～ 8min，两种流动相均速变化到A相100%、B相0%；8～10.1min，A相100%、 B相0%；10.1min时，瞬时调整为A相20%、B相80%；再以这个比例洗脱至 15min；上述均为体积百分比。

用电喷雾离子源正离子模式，多反映监测模式，外标法进行质谱定量分析。

所用的色谱柱为C18柱；所述的色谱与质谱条件为：流速0.15～0.25mL/min； 进样量:8～20μL；分析时间:15min；柱温:24～26℃。

更优选的，所述的色谱与质谱条件为：流速0.2mL/min；进样量:10μL； 分析时间:15min；柱温25℃。

本发明利用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS），建立了同时测定细菌 群体感应分泌的11种AHLs类信号分子的分析方法。细菌所分泌AHLs类信号分 子经乙酸乙酯萃取后简单处理，可直接进样分析。本方法使用Phenomenex公 司Luna C₁₈色谱柱（2.0mm×100mm，3μm），甲醇和水（10mmol/L乙酸铵， 0.2％甲酸）梯度进样，采用电喷雾离子源正离子模式，MRM模式，外标法进 行质谱定量分析。分析时间为15min。本方法在1～500ng/L浓度范围内呈良好 的线性关系（r＞0.998），最低检出限为0.1ng/L～1.0ng/L，定量限为0.3ng/L～ 3.0ng/L。平均添加回收率为78%～99%，相对标准偏差2.8%～11.2%。本方法具 有操作简便、快速、准确、灵敏度高的优点，适用于多种AHLs类信号分子化合 物的同时定性、定量分析，为微生物群体感应的进一步研究提供了有效的，便利 的分析方法。

本发明的方法，能同时分离检测11种细菌群感效应AHLs类分子本方法具有 操作简便、快速、准确、灵敏度高等优点，适用于多种AHLs类信号分子化合物 的同时定性与定量分析，为微生物群体感应的进一步研究提供了有效的且便利的 分析方法。

附图说明

图1～图3为11种AHLs信号分子标准品的色谱图

图4～图7为四种AHLs（3-oxo-C₆-HSL、3-oxo-C₁₀-HSL、C₄-HSL和C₈-HSL） 二级质谱图

图8为荧光假单胞菌培养16h分泌6种AHLs选择离子流图

图9为Waters2695Quattro micro型液相色谱串联质谱联用仪的梯度洗脱曲 线图。

具体实施方式

仪器与试剂：

Waters2695Quattro micro型液相色谱串联质谱联用仪（美国Waters公司）， MassLynxV4.1软件。R250型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司），SupRa22K 型高速冷冻离心机（上海民仪电子有限公司）。

乙酸乙酯（分析纯），甲醇（HPLC级），冰乙酸（分析纯）购于国药集团， LB培养基、营养琼脂等购于上海生工公司，实验室用水为Milli-Q超纯水。AHLs 类信号分子标准品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、 3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C10-HSL、3-oxo-C12-HSL、3-oxo-C14-HSL） 均购于Sigma公司（纯度≥98%）。用甲醇溶解标准品，配制成100mg/L标准原 液，-20℃存储备用。荧光假单胞菌（上海市工业微生物研究所）。

实施例1样品的前处理

取荧光假单胞菌单菌落培养于含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，在 28℃摇床培养12h，制备种子培养液。培养12h后，取种子培养液1mL于含有 100mL LB培养液的500mL三角瓶中培养，分别培6、10、12小时养。

将上述培养液放于50mL离心管，在4℃以27000g离心20min。取上清液 用等量含0.02moL/L冰乙酸的乙酸乙酯萃取3次，弃水相，混合有机相。将上 述得到的乙酸乙酯抽提液置于旋转蒸发仪内，进行旋转蒸干。用无水甲醇溶解上 述蒸干的蒸发瓶，定容至5mL。取0.5mL此溶液，加0.5mL超纯水后，过0.45μm 滤膜，进样测定。

实施例2高效液相色谱-串联质谱法同时测定细菌群体感应AHLs类信号分子

1、色谱与质谱条件：

色谱柱:Phenomenex C₁₈（2.0mm×100mm3μm）；流速:0.2mL/min；进 样量:10μL；分析时间:15min；柱温:25℃；流动相梯度条件：A相：含10 mmoI/L乙酸铵、0.2%（体积浓度）甲酸的甲醇；B相为水相，是含10mmoI/L乙 酸铵、0.2%（体积浓度）甲酸的水溶液。梯度条件见表1。

液相梯度：本方法使用Waters2695Quattro micro型液相色谱串联质谱联用仪 自带11条梯度曲线类型，如图9所示。inlet method编辑中可更改curve，从而实现 液相梯度的调整。

曲线1表示：瞬间达到设定的洗净色谱柱两种流动相比例，使其在最佳洗净 流动相比例保持时间长；曲线6表示：两种流动相均速变化到设定比例，得到最 好的分离。

表1梯度洗脱参数

2、荧光假单胞菌LB液体培养基检测

检测实施例1中经过处理的得到的样品，荧光假单胞菌分泌6种AHLs的量 如表2。荧光假单胞菌培养16h分泌6种AHLs选择离子流图如图8。

表2利用本方法检测得到菌株纯培养样品检测结果（ng/L）

3、荧光假单胞菌LB液体培养基中添加回收试验

取实施例1中经过处理所得到的样品进行回收添加试验，结果如表3。

表3细菌LB液体培养基中添加回收试验结果

注：低浓度添加回收率低于高浓度添加回收率，添加回收率在70%-120%。

低浓度添加时RSD%高于高浓度添加时RSD%（相对标准偏差），RSD%在0-20之内。

实施例3

配制十一种AHLs信号分子1、10、100、250ng/L混合标准溶液（每一种信 号分子的浓度分别为1、10、100、250ng/L）进行测定，以定量离子（m/z102） 的峰面积（Y）和对应的标准浓度（X，ng/L）作标准工作曲线图，11种AHLs信 号分子的相关系数r均大于0.996，在1(10)～250ng/L范围内有良好的线性关系。 以S/N=3,S/N=10的计算方法得出检出限和定量限，结果如表4。11种AHLs信号 分子标准品的色谱图如图1～图3所示。四种AHLs（3-oxo-C₆-HSL、3-oxo-C₁₀-HSL、 C₄-HSL和C₈-HSL）二级质谱图如图4～图7所示。检测结果同标准图谱。

表411种AHLs信号分子的线性关系和检出限及定量限

对比实施例

采用如表5的梯度洗脱参数时，对含有十一种AHLs信号分子的1、10、 100、250ng/L混合标准溶液（每一种信号分子的浓度分别为1、10、100、 250ng/L）进行测定，相关系数均低于0.95，检出限为5.0～30.0ng/L。

检测A相：甲醇（含10mmoI/L乙酸铵、0.2％体积浓度甲酸）B相为 水相，是含10mmoI/L乙酸铵、0.2％体积浓度甲酸的水溶液。

表5对比实施例的梯度洗脱参数