一种绵羊山羊甾体激素抗原双胎苗生产工艺

摘要

本发明公开了一种绵羊山羊甾体激素抗原双胎苗生产工艺，包括以下步骤：(1)盐酸羧甲基羟胺的合成；(2)睾酮抗原的合成；(3)加入佐剂。使用本发明的技术方案可以明显的提高羊的产羔率，一般提高在30％以内，平均提高20％左右。它是通过免疫效应来启动母羊体内内在的繁殖潜能诱导产双胎，与自然状态下的妊娠和产羔的正常繁殖生理机能相协调，对母羊以后的生产性能不会造成不良影响。生产中应用简便易行，不需专业技术人员，不需特殊的设备器械，农牧民技术员只需注射器就可完成操作。

说明书

技术领域

本发明属于畜牧业繁殖免疫技术领域，涉及一种绵羊山羊甾体激素抗原双胎苗生产工 艺。

背景技术

我国绵山羊存栏数已超过3亿只，按数量计算居世界首位，按人均占有数计却仅有0.2 只，我国羊的出栏率已达到50％以上，基本接近畜牧业发达国家。但由于人均占有的绝对数 量太低，所以人均羊肉占有量也低于世界平均水平，平均每人不到3公斤。随着我国经济的 快速发展，国民的收入大幅度上升，人们的消费需求也日益上升，由过去的温饱改变为追求 营养。由于羔羊肉具有鲜嫩多汁、脂肪少、味道好、容易消化吸收且胆固醇低等优点，受到 人们普遍欢迎，这一需求的改变促使了我国羊肉生产也从过去的以大羊肉为主转变为以生产 羔羊肉，尤其是生产肥羔肉为主。生产羔羊肉成本低，资金周转快，经营有利，发展迅速。 随着市场需求的改变，我们也对传统的养羊业生产模式作出相应的改变，提高我国养羊的生 产力，以适应市场经济的发展。

目前，尽管养羊业的形势很好，需求很旺，但由于目前养羊业的生产方式落后，长期以 来“靠天养羊”、“头数养羊业”等传统观念影响深远，沿袭至今。我国肉羊胴体重只有世界 水平的79％，高档羊肉的比重不足5％。在羊肉生产方面，长期以来我国的肉羊生产状况令人 无法满意，至今尚未培育出专门化的肉羊品种，更没有规模化的肉羊繁育体系和肉羊的产业 化生产，致使我国肉羊产肉性能差，羊肉质量不高。

从生态现状看，草原资源既是构成生态系统的主体，也是至今遭到破坏最严重的生态要 素。要从更本上消除超载过牧这一造成草原“三化”的人为因素，使草原有了休息生息的机 会，植被得以再生和恢复，从而加快我国生态环境治理的进程。从牧业生产方式看，实施禁 牧舍饲是改变传统饲养方式的客观要求。过去多年来，由于单纯注重畜牧业数量型增长，致 使我国的牲畜总量超常发展，放牧强度远远超出了草原的适宜载畜能力。超载过牧必然导致 草畜矛盾激化，严重阻碍畜牧业发展。

随着退耕还林、还草工程的实施，以及人们对羊肉产品的需求增长，提高我国养羊业的 生产力日益得到重视。提高养羊生产力的途径一是提高个体生产性能，二是增加羊只数量提 高养羊业整体生产性能。前者靠遗传育种、引进外来优秀品种和饲养管理措施，后者则靠繁 殖手段。提高绵山羊的繁殖效率以适应当前形势的发展，是养羊生产的一个主要目标，而实 现这个目标的最直接最有效的措施就是提高母羊的产羔率。但是，也不是母羊的产羔率越高 越好，除了个别多胎品种外，从生产实际情况看，其它以单胎为主的品种如果能用一定的方 法促使其产双羔是最好的，因为这是母羊妊娠所能承受的，也是母羊哺乳或人工辅助哺乳所 能承受的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种绵羊山羊甾体激素抗原双胎苗生产 工艺，不增加基础母羊数量的基础上生产出更多的羔羊，生产出更多的羊肉，提高了生产者 的经济利益，对草原资源的保护和保护生态环境有积极的作用。使用甾体激素抗原双胎苗， 可以做到高产优质高效，用控制数量，提高单位效益的思路。在保持和降低现有羊群数量的 同时，增加养羊效益，减轻草场压力，保护植被，建设生态牧业，增加生态效益。

其技术方案如下：

一种绵羊山羊甾体激素抗原双胎苗生产工艺，包括以下步骤：

(1)盐酸羧甲基羟胺的合成

11)A液的配制：将122.4g溴乙酸与200g碎冰混合，再加入40％氢氧化钠100ml；

12)B液的配制：将58.4g丙酮肟置于冰水浴中，加入40％氢氧化钠100ml；

13)待氢氧化钠完全溶解后，将AB液混合，混合液明显呈碱性，让混合液逐滴通过用 蒸汽加热的直型冷凝管，收集与放在冰水浴的三角瓶中，直型冷凝管内管长度70cm，放置 倾角20度，液滴通过时间2～3秒；

14)步骤13)所得溶液用乙醚洗三次，每次100ml，水相放冰水浴中加浓盐酸100ml， 然后用氯化钠饱和，立即用乙醚提取6次，每次200ml，蒸发提取液中的乙醚，保留剩余 物；

15)将步骤14)的剩余物加200ml水、微量对苯二酚和200ml浓盐酸，减压浓缩至 无液体流出时取出，加30ml的异丙醇，放4℃冰箱过夜，析出晶体用布氏漏斗过滤，并用 冷的异丙醇洗涤，收集产物，自然干燥，过滤后的母液减压浓缩后，再加异丙醇，还可得到 3-4g产物，得到的产物为带有光泽的白色针状晶体，将产物溶解于二倍体积的50℃热水中， 再加二倍体的异丙醇进行重结晶；

(2)睾酮抗原的合成

21)睾酮-3-羧甲基肟的合成：

将2.68g睾酮和2g盐酸羧甲基羟胺溶解与400ml无水乙醇，加5％氢氧化钠40ml，加热 回流1.5小时，减压浓缩至30ml左右，用50ml蒸馏水稀释，用乙醚洗涤两次，每次100ml， 水相用浓盐酸调PH到1，再用乙醚提取5次，每次100ml，提取液用蒸馏水洗3次，加3-5ml 无水硫酸钠脱水过夜，蒸去乙醚，冷却后的白色结晶，烘干后得产品2.96g，产率87％，

22)睾酮-3-羧甲基肟·BSA的制备：

秤5.3g睾酮-3-羧甲基肟加140ml二氧六环，溶解后加3.5ml三正丁胺，冷却到10℃， 加2ml氯甲酸异丁脂，4℃反应30分钟，秤20g牛血清白蛋白溶于500ml水-二氧六环(1∶1 V/V)和1N氢氧化钠20ml，将睾酮-3-羧甲基肟溶液加入牛血清白蛋白溶液中，4℃搅拌反 应4小时，反应时应随时测PH，并随时滴加1N氢氧化钠，使PH维持在8.5～9.0，将反应 液透析24小时，透析液用1N盐酸调制PH至4.5，调节时有沉淀产生，放置4℃冰箱，四天 后离心收集沉淀，沉淀物用5％碳酸氢钠溶解，完全溶解后进行冷冻干燥，冻干后的产品 20.2g，产率达99％以上，

(3)加入佐剂

采用进口的206佐剂。

进一步优选，步骤12)中加入氢氧化钠时的温度≤20℃。

进一步优选，步骤14)中加浓盐酸时的温度≤15℃。

本发明的有益效果：

使用本发明的技术方案可以明显的提高羊的产羔率，一般提高在30％以内，平均提高20％ 左右。它是通过免疫效应来启动母羊体内内在的繁殖潜能诱导产双胎，与自然状态下的妊娠 和产羔的正常繁殖生理机能相协调，对母羊以后的生产性能不会造成不良影响。生产中应用 简便易行，不需专业技术人员，不需特殊的设备器械，农牧民技术员只需注射器就可完成操 作。

附图说明

图1为盐酸羧甲基羟胺的合成路线图；

图2为睾酮抗原的合成中睾酮肟化路线图；

图3为睾酮抗原的合成中睾酮-3-羧甲基肟与牛血清白蛋白(BSA)缩合耦联路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

一种绵羊山羊甾体激素抗原双胎苗生产工艺，包括以下步骤：

(1)盐酸羧甲基羟胺的合成

盐酸羧甲基羟胺是合成甾体激素抗原双胎苗的必须原料，用量较大，目前国内没有厂家 生产，虽然可以从国外进口，但手续复杂，价格昂贵。进过多次试验研究，已得到产品，其 质量合格，成本低廉。

合成路线如图1所示。

11)A液的配制：将122.4g溴乙酸与200g碎冰混合，再加入40％氢氧化钠100ml；

12)B液的配制：将58.4g丙酮肟置于冰水浴中，加入40％氢氧化钠100ml(加碱时T ≤20℃)。

13)待氢氧化钠完全溶解后，将AB液混合，混合液明显呈碱性，让混合液逐滴通过用 蒸汽加热的直型冷凝管，收集与放在冰水浴的三角瓶中，直型冷凝管内管长度70cm，放置 倾角20度，液滴通过时间2～3秒，反应速度控制非常重要，混合液加热温度不易控制，通 过以上措施，反应在2～3秒瞬间完成，可以提高产率，减少副产品；

14)步骤13)所得溶液用乙醚洗三次，每次100ml，水相放冰水浴中加浓盐酸100ml (加浓盐酸时T≤15℃)，然后用氯化钠饱和，立即用乙醚提取6次，每次200ml，蒸发提 取液中的乙醚，保留剩余物；

15)将步骤14)的剩余物加200ml水、微量对苯二酚和200ml浓盐酸，减压浓缩至 无液体流出时取出，加30ml的异丙醇，放4℃冰箱过夜，析出晶体用布氏漏斗过滤，并用 冷的异丙醇洗涤，收集产物，自然干燥，过滤后的母液减压浓缩后，再加异丙醇，还可得到 3-4g产物，得到的产物为带有光泽的白色针状晶体，结晶体的大小与减压浓缩后的浓度及 加入异丙醇的量有关。如果将产物溶解于二倍体积的50℃热水中，再加二倍体的异丙醇进 行重结晶，所得产物非常均一，而且几乎不影响产率；

(2)睾酮抗原的合成

睾酮抗原(T-3-BSA)是制作甾体激素抗原双胎苗的主要原料，它由睾酮和牛血清白蛋 白耦联而成。实际上，许多雄激素和雌激素的蛋白结合物都有促进动物排卵的效用，从而提 高动物的产羔率。

睾酮肟化的合成路线如图2所示。

睾酮-3-羧甲基肟与牛血清白蛋白(BSA)缩合耦联的合成路线如图3所示。

一个BSA分子有59个赖氨酸的自由氨基可以与睾酮连接，但由于BSA立体构型的原因， 暴露在外的自由基才可与睾酮连接，有报道最高连接为36个。我们研究显示，连接数达到 18个就有明显的效果。我们合成的连接个数在18个以上。

21)睾酮-3-羧甲基肟的合成：

将2.68g睾酮和2g盐酸羧甲基羟胺溶解与400ml无水乙醇，加5％氢氧化钠40ml， 加热回流1.5小时，减压浓缩至30ml左右，用50ml蒸馏水稀释，用乙醚洗涤两次，每次 100ml，水相用浓盐酸调PH到1，再用乙醚提取5次，每次100ml，提取液用蒸馏水洗3次， 加3-5ml无水硫酸钠脱水过夜，蒸去乙醚，冷却后的白色结晶，烘干后得产品2.96g，产率 87％，

22)睾酮-3-羧甲基肟·BSA的制备：

秤5.3g睾酮-3-羧甲基肟加140ml二氧六环，溶解后加3.5ml三正丁胺，冷却到10℃， 加2ml氯甲酸异丁脂，4℃反应30分钟，秤20g牛血清白蛋白溶于500ml水-二氧六环(1∶1 V/V)和1N氢氧化钠20ml，将睾酮-3-羧甲基肟溶液加入牛血清白蛋白溶液中，4℃搅拌反 应4小时，反应时应随时测PH，并随时滴加1N氢氧化钠，使PH维持在8.5～9.0，将反应 液透析24小时，透析液用1N盐酸调制PH至4.5，调节时有沉淀产生，至PH4.5时沉淀最 多，放置4℃冰箱，四天后离心收集沉淀，沉淀物用5％碳酸氢钠溶解，完全溶解后进行冷冻 干燥，冻干后的产品20.2g，产率达99％以上，

(3)加入佐剂

采用进口的206佐剂。乳化效果最好，乳化后抗原制剂在4℃冰箱保存2年后仍质地均 匀，没有出现分层，且不影响效果，这一结果将甾体激素抗原双胎苗的有效期至少延长至2 年。

步骤12)中加入氢氧化钠时的温度≤20℃。

步骤14)中加浓盐酸时的温度≤15℃。

实施方法：

1、注射双胎苗的母羊必须健康无疾病，具有正常的繁殖能力，体格较大，膘情中等以上， 最好为经产母羊，以3～5岁最佳。

2、使用双胎苗前一个月及使用期间应将公母羊分开饲养。

3、双胎苗的保存温度应保持在0℃～8℃之间，运输时间尽量要短，温度不应超过30℃， 最好在4℃冰箱保存，保质期为两年。

4、注射部位为颈部皮下。共免疫注射两次，每次1ml，配种前42天，第一次注射，过21 天再进行第二次注射，再过21天即可配种，本交或人工授精均可。配种期可为2个月。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本 技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，通过技术方案的简单变化或等效替换均落 入本发明的保护范围内。