公开/公告号CN103173456A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-06-26
原文格式PDF
申请/专利号CN201210543946.3
申请日2012-12-14
分类号C12N15/12(20060101);C12N15/113(20100101);C12N15/89(20060101);C12N15/85(20060101);A01K67/027(20060101);
代理机构广州天河恒华智信专利代理事务所(普通合伙);
代理人区长钊
地址 510642 广东省广州市天河区华南农业大学动物科学学院实验楼新楼317房
入库时间 2024-02-19 18:43:12
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-09-23
授权
授权
2015-03-11
著录事项变更 IPC(主分类):C12N15/12 变更前: 变更后: 申请日:20121214
著录事项变更
2015-03-11
专利申请权的转移 IPC(主分类):C12N15/12 变更前: 变更后: 登记生效日:20150209 申请日:20121214
专利申请权、专利权的转移
2013-07-31
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/12 申请日:20121214
实质审查的生效
2013-06-26
公开
公开
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及转基因工程技术,具体涉及一种提高猪克隆效率的方法。
背景技术
1938年,德国科学家Spemanm最早提出并进行细胞核移植实验,之后大量的科学家投入到核移植克隆动物的实验中来,直到1997年英国罗斯林研究所宣布克隆羊“多莉”成功培育,表明体细胞可作为供核细胞进行细胞核移植,为克隆技术的大力发展提供了理论依据,翻开了动物克隆史新的一页。随后大量的克隆动物陆续诞生,而于2000年成功获得了世界上首例用猪胎儿成纤维细胞作为供核细胞的体细胞核移植猪。现已获得的克隆动物有小鼠、绵羊、兔、猪、牛、猴、猫、大鼠、骡子、马、狗、雪貂等。这标志着哺乳动物的核移植克隆技术已日趋成熟。
同时,动物克隆技术在农业、生物学和医药学等领域有十分广泛的用途。克隆技术可利用优良品种的体细胞作为核供体来克隆动物,可大大缩短育种年限,得到优质动物种群,加速动物育种进程;可利用克隆技术拯救濒危动物,保护珍稀物种、保护生物多样性。克隆技术与转基因技术相结合,对解决人类器官移植来源、改善动物品种、疾病治疗等有重要意义。而猪作为人类疾病治疗的模式生物,其克隆技术对解决人类异种器官移植尤为重要。
但是,动物克隆技术仍面临一个重要难题,就是克隆效率低的问题。有研究报道,哺乳动物的克隆效率一般不超过3%(出生个体数/核移植重构胚数),而猪的克隆效率更低为1-2%,这大大限制了 动物克隆技术的研究与应用。提高动物克隆效率的研究较多,主要表现在核供体、核受体的选择、供受体间的相互作用和核移植的操作方法等传统方法的研究,但是效果却并不明显,克隆成功率仍不超过3%。
现有技术基本上是通过供核细胞和受体细胞的选择、供受体细胞间的相互关系及核移植的操作方法等方面来探索如何提高猪的克隆效率,这些技术一定程度上受地域、时间和个体因素差别的影响,因此可重复性差、效果不明显,不适用于大规模的制备克隆动物。
Xist基因被认为是调控X染色体失活的关键基因,它启动X染色体的失活,在X染色体失活中心开始转录,转录产物通过包围整条X染色体使其沉默,从而实现哺乳动物的剂量补偿效应。而近年来发现Xist基因在克隆动物(或胚胎)中异常表达,推测其与克隆动物(或胚胎)的异常发育或死亡有关。但是目前在猪上,尚未报道有人做过类似的实验,且猪的Xist基因序列并未公布。
发明内容
本发明目的通过生物信息学方法获得了完整的猪Xist基因序列,为今后进一步研究猪X染色体失活机制及其对克隆动物的正常发育的影响提供了基础。
本发明的另一目的是提供一种猪anti-Xist siRNA序列。
本发明的另一目的是提供一种提高猪克隆胚胎的发育质量、继而提高猪的克隆效率的方法,猪克隆效率的提高,可缩短育种年限,培育优良品种。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的:
一种猪Xist基因序列,所述序列为如序列表SEQ ID NO:1所述。
一种猪anti-Xist siRNA序列,所述序列为如序列表SEQ ID NO:2和3所述。
一种猪anti-Xist siRNA序列,所述序列为如序列表SEQ ID NO: 4和5所述。
一种猪anti-Xist siRNA序列,所述序列为如序列表SEQ ID NO:6和7所述。
一种猪anti-Xist siRNA序列,所述序列为如序列表SEQ ID NO:8和9所述。
一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法,所述方法通过以下步骤实现:
1)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析,获得相似性90%以上的表达序列标签;对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析,延伸EST序列,得到Xist RNA序列;
2)有效anti-Xist siRNA序列的筛选:以母猪cDNA为模版,设计引物,进行定量PCR反应,筛选有效的anti-Xist siRNA序列;
3)anti-Xist siRNA1显微注射猪早期核移植胚胎;
4)anti-Xist-siRNA1转染核移植的供核细胞,用anti-Xist siRNA1抑制克隆胚胎中Xist基因表达,提高体外培养猪克隆胚胎的囊胚内细胞数。
本发明提供了另一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法,所述方法为用anti-Xist siRNA显微注射激活后猪的核移植重构胚,具体步骤如下:
1)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析,获得相似性90%以上的表达序列标签;对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析,延伸EST序列,得到Xist RNA序列;
2)设计合成anti-Xist siRNA序列;
3)筛选出有效的anti-Xist siRNA;
4)制备猪的核移植重构胚,将有效的anti-Xist siRNA序列显微 注射到激活后的核移植重构胚中;
5)将处理后的重构胚移植到代孕母猪体内,提高克隆效率。
本发明提供了又一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法,所述方法为用anti-Xist siRNA直接转染核移植的供体细胞,具体步骤为:
1)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析,获得相似性90%以上的表达序列标签;对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析,延伸EST序列,得到Xist RNA序列;
2)设计合成anti-Xist siRNA序列;
3)筛选出有效的anti-Xist siRNA;
4)用有效的siRNA转染核移植的供核细胞;
5)用处理后的供核细胞制备克隆胚胎以期提高克隆效率。
本发明还提供了一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法,所述方法为直接敲除核移植的供体细胞中Xist基因,具体步骤为:
1)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析,获得相似性90%以上的表达序列标签;对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析,延伸EST序列,得到Xist RNA序列;
2)设计同源重组打靶质粒制备敲除Xist序列的细胞系;
3)用第2)步骤的细胞系作为核移植的供核细胞制备克隆猪,以提高克隆效率。
本发明还提供另一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法,所述方法为制备抗Xist基因的转基因猪,具体步骤为:
1)猪Xist基因的电子克隆:对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析,获得相似性90%以上的表达序列标签;对匹配 分数高的EST序列进行片段整合分析,延伸EST序列,得到Xist RNA序列;
2)设计合成anti-Xist siRNA序列;
3)筛选出有效的anti-Xist siRNA;
4)用有效的anti-Xist siRNA构建anti-Xist shRNA质粒;
5)用anti-Xist shRNA质粒制备转基因细胞系;
6)用第5)步骤的细胞系作为核移植的供核细胞制备克隆猪,以提高克隆效率。
本发明首次获得完整的猪Xist序列及anti-Xist siRNA序列,为今后研究猪X染色体失活机理,及研究Xist基因表达与猪克隆胚胎发育的关系提供了基础。同时,此技术可提高猪克隆胚胎体外发育的质量,为提高猪克隆效率的进一步研究提供了理论依据。而猪克隆效率的提高无论是在畜牧生产领域、科研领域还是医学领域都将具有十分重要的意义。相对于已有方法,本发明提供的方法具有更好的重复性,简便快捷,更适合规模化生产克隆猪。
附图说明
图1为猪Xist基因RT-PCR鉴定电泳图;
其中M为DNA Marker,1为猪Xist基因PCR扩增产物,
图2为猪Xist基因3′RACE鉴定电泳图;
其中M为DNA Marker,1为猪Xist基因3′RACE扩增产物;
图3为猪Xist基因的结构图;
其中,方框表示Xist基因的外显子,方框之间的横线表示内含子;E1-E7分别表示外显子1-7;AG,GT表示内含子边界;在猪中各外显子序列E1:1-15214,E2:16675-16763,E3:19035-19170,E4:21307-21515;E5:21872-22200;E6:22591-22719;E7:23709-30223;
图4为anti-Xist siRNA靶质粒构建路线图;
图5为anti-Xist siRNA与靶质粒共转染293T细胞48h后相对的平均绿色荧光强度柱图;
图6为anti-Xist siRNA与靶质粒共转染293T细胞48h后表达绿色荧光细胞相对比率柱图;
图7为anti-Xist siRNA与靶质粒共转染293T细胞48h后荧光显微镜下观察结果;
图8为anti-Xist siRNA转染母猪成纤维细胞48h后Xist基因相对表达量柱图;
图9为anti-Xist siRNA1注射进猪早期核移植胚胎后荧光显微镜下观察结果;
图10为anti-Xist siRNA1转染供核细胞后荧光显微镜下观察结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述,但具体实施例并不对本发明做任何限定。
1、猪Xist基因的电子克隆
利用DNAStar(www.dnastar.com/)的MegAlign程序对GenBank中已公布的Bostaurus(牛,NCBI序列号:NR 001464.2)、Homo sapiens(人,NCBI序列号:NG 016172.1)、Mus musculus(小鼠,NCBI序列号:AJ421479.1)的Xist的核苷酸序列进行同源性分析,找到一段相对保守的序列。基于UCSC网站,以找到的相对保守的序列为基础,与猪Nov.2009(SGSC Sscrofa9.2/susScr2)数据库进行BLAST分析,将此段序列定位在猪的X染色体上,以此为基础前后延伸,得到一段约40kb的序列。将上述得到的40kb序列分别与牛、人和小鼠的XIST/Xist序列进行BLAST分析,进一步得到30kb的猪Xist基因序列。将得到的30kb序列,与猪EST文库和Unigene库进行BLAST分析,从猪EST数据库中挑选出全部相关的序列。然后,对匹配分数(Score) 较高的EST序列进行片段整合分析(即Contig分析),用序列拼接软件延伸EST序列。将新生序列再作为种子序列重复地进行上述过程,直到新生序列不能再被进一步延伸为止,得到Xist RNA序列。采用RT-PCR、3′RACE及测序验证,得到的猪Xist基因序列外显子与内含子序列正确,即猪Xist基因序列长度为30223bp,转录本长度为22621nt,共有7个外显子,其中第1、7外显子比较长,2-6外显子比较短。第1到7外显子的长度分别为:15214bp、89bp、136bp、209bp、329bp、129bp与6515bp,结果见图1、2、3。
2、有效anti-Xist siRNA序列的筛选
2.1通过荧光显微镜观察和流式细胞仪检测筛选有效的anti-XistsiRNA序列
anti-Xist siRNA的设计与合成均由上海吉玛制药技术有限公司完成,共设计和合成了4对anti-Xist siRNA分别记为siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4及一对阴性对照siRNA记为Nc-siRNA,其序列为:
表1anti-Xist siRNA序列
将4对siRNA作用的靶序列两端加入酶切位点Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ,与pEGFP-N1质粒进行酶切、连接、转化,并进行菌液PCR鉴定、质粒酶切鉴定及测序鉴定,得到筛选anti-Xist siRNA序列的靶质粒,该质粒靶序列与EGFP绿色荧光蛋白融合表达,构建流程件图4。
将得到的靶质粒与siRNA共转染293T细胞,转染方法参照 Invitrogen公司LipofectamineTM LTX and PLUSTM Reagents kit说明书进行。转染48h后,在荧光显微镜下观察各组荧光表达情况,同时进行流式细胞仪检测。实验表明siRNA1对猪Xist基因的干扰效果最好,结果见图5、6、7。
2.2通过荧光定量PCR的筛选有效的anti-Xist siRNA序列
以母猪cDNA为模版,设计引物,进行定量PCR反应,反应程序为:95℃30s;(95℃5s;60℃35s;共40个循环);95℃15s;60℃1min;95℃15s。定量PCR数据统计分析采用△△Ct法来度量各siRNA处理组内Xist基因的表达差异。具体做法是将每个样品的Ct平均值减去对应样品的β-actin平均Ct值得到各处理组的△Ct值,即△Ct=样品目的基因Ct均值-样品β-actin Ct均值,然后以Nc-siRNA作为参照,同理得到参照样品△Ct值,用其它siRNA处理组的△Ct值减去参照样品组织的△Ct值得到各组织的△△Ct,即△△Ct=其他样品△Ct值-参照样品△Ct值,最后将每个处理组相对参照组的Xist基因表达量用2-△△Ct表示。实验表明siRNA1对Xist基因的移植效果最好,结果见图8。
3、anti-Xist siRNA1显微注射猪早期核移植胚胎
实验分为三组:注水组(对照组),注射20μM anti-XistsiRNA1组(实验组1)与注射80μM anti-Xist siRNA1组(实验组2)。核移植的供核细胞来源于杜洛克公猪成纤维细胞。在核移植细胞融合激活后,分别向实验组胚胎内显微注射10pL浓度分别为20μM与80μM anti-XistsiRNA1,向对照组胚胎注射10pL胚胎级别注射水(sigma),然后置于培养基中体外培养,观察胚胎的卵裂率、囊胚率,并计算囊胚平均细胞数。结果表明anti-Xist siRNA1显微注射猪早期胚胎对胚胎发育时的卵裂率和囊胚率无显著效果(p﹥0.05)(表2);但注射80μM anti-XistsiRNA1组囊胚内平均细胞数显著高于20μM组与对照组(p﹤0.05),80μM组相对于对照组囊胚内平均细胞数可提高47.51%(表2和图9)。 而囊胚内平均细胞数是衡量胚胎发育质量的一个重要指标,说明显微注射anti-Xist siRNA1抑制Xist基因表达可显著提高克隆囊胚发育质量。
表2anti-Xist siRNA1显微注射对猪克隆胚胎体外发育的影响
4、anti-Xist-siRNA1转染核移植的供核细胞
实验分为三组:只转染脂质体组(对照组),转染20nM anti-XistsiRNA1(实验组1)与转染40nM anti-Xist siRNA1组(实验组2),核移植的供核细胞来源于杜洛克公猪成纤维细胞。转染核移植的供核细胞。转染后48h,各组细胞分别作为核移植的核供体,进行核移植观察胚胎的卵裂率、囊胚率,并计算囊胚平均细胞数。结果表明anti-XistsiRNA1转染处理供核细胞时,转染20nM anti-Xist siRNA1组克隆胚胎卵裂率显著降低(p﹤0.05)(表3);各组间囊胚率无显著差异(p﹥0.05)(表3),但转染20nM anti-Xist siRNA1组囊胚率偏低;转染20nManti-Xist siRNA1组的囊胚内平均细胞数显著高于其它两组(p﹤0.05),20nM组相对于对照组囊胚内平均细胞数可提高17.99%(表3和图10)。而囊胚内平均细胞数是衡量胚胎发育质量的一个重要指标,说明显微注射anti-Xist siRNA1抑制Xist基因表达可显著提高克隆囊胚发育质量。
表3anti-Xist siRNA1转染供核细胞对猪克隆胚胎体外发育的影响
用anti-Xist siRNA1抑制克隆胚胎中Xist基因表达,可提高体外培养猪克隆胚胎的囊胚内细胞数,而囊胚内细胞数越多其胚胎质量发育越好。因此,本技术表明抑制早期猪克隆胚胎中Xist基因表达,可提高胚胎质量。为进一步进行猪克隆胚胎体内培养的实验奠定了基础,以期达到提高克隆效率的目的。也为提高其他物种克隆效率,提供了思路和做了初步探索与尝试。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明实施例,在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 芳, 吴 珍
聪, 李 紫
<120> 猪Xist基因序列、猪anti-Xist
siRNA序列及通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法
<130> 1
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30223
<212> DNA
<213> 猪
<220>
<221> misc_feature
<222> (2959)..(3058)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 1
atgagaggga gaaggtttag gcgcagggtt caaaatggcg attttgactt tgcagcattg 60
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tgacccctcc cgttagtttg ggatcccatc ctcacctaat tctctctgca ttaccaggga 5280
ggatacaagg gactcttaat gtgcttaaat gaaggtacag tccttttttt taaacctagg 5340
atttcattcc catgtaactc catttgcact accacagagg gtacaagggg cgaatgagcc 5400
taaaagcagc tacagtccct tatgttaacc taaggatcct gtctcctagg aactcccttt 5460
tcctggctgc agaggatact tgggactgtt agtgagattt actgtagcta cagtctcttt 5520
tattagtcta gattcccatt accatcctag atgttttgca ttaccacgga ctatacaagg 5580
gaccattata gggcttaaat gcagctccag tcccttatta acctagaatc tcatccccac 5640
ctacagcctt tttcatgctg cagagggtac ttgggactgt tgattggctt tattgcagct 5700
gcagtccctt ctgttagtct agaatctgtt tccatcctac tccatttgca ttaccacaga 5760
ggggacaagg gactgttaat gtgcttaaat agaaccacag tcccttatgt taaatgagga 5820
tcccatcccc aactaactct cttttcatta ctgcagagct taagtaggac ttgttaatag 5880
actattgcat tactgttctg ttattctata ggttcccatc cctcattcta tttgcattac 5940
cctagagtgt aaagggactg ttaatgagct tctatggctc tacagaccct tacgttacct 6000
atgatctttt tgccacttaa ctcccttttc atgcctatag agagtacttg ggactgttaa 6060
tgggctttat tatggctaca gtcccttctg tttgtccaga atttgttact tttctactcg 6120
acttgcacag atggtacaag ggactgttaa tgtgcttaaa tgaagctact gtctcttatg 6180
tttaaataaa atcccattcc ccacctaaaa ctcttgcatg gctgtagaag gtacttggga 6240
cagttaatgg ctttaattag agctacagtc ccttctattg gtcaatattc ccatgcccat 6300
actccatttg cattaccaaa gggagtacaa gagactgttg gtatgcttca atgcaattac 6360
agtctcttat gttaacctac gatctgatac ccaactatct ccctttttat taatgcagaa 6420
gctacatggg acttgttaac ggctttaatt gcactactgt ccttccatta gtctaagatc 6480
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gtgcttaaat gcaattacag tcccttttaa attttaccca ggatcccatt cccccttatc 6600
tcccttttca acactacaga gggtacaatt gacttactgt gcttaaaaga agctatagtc 6660
cctcatgtta acctaaggat ctcatcccca actaactctc ctttcatgac tacagagagt 6720
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atttactaca tgatttgcat taccacagaa tatgcaaggg actgttactg cgcttaaatg 6840
cagttacaga cccttatgtt aatctagaat cccatcccca actatctctc ttcattaatg 6900
cagagcctgc ataggactta ttaacaacct ttattgcact acagtctctt ctgttagtct 6960
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tgggcttaaa tacaactact gtccgttatg ttaacctagg atcccatctc cacctgaatc 7080
cgtttgcatg actgcagagg gaccttaggc tttattacgg gcggctacag ccccttctgg 7140
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tgttaatggg cttcattgct cttctctgtc ccttctacta gtctagattc ccaagctctc 7740
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ggtcttaatt gcactgctgt ccctttcgtt agtctaggat tctatcccct cataaagaat 8040
tacattaccg tagaggtttc aagggaatgg taatgtgcta aatgcacata gtccccctct 8100
ttttgtaacc taggatccca ttccacctaa ctccctttgc attatcacca actgtacaag 8160
tgactggtaa tgggcttaaa agcagctatt gttaacctag gatcccatcc ccattcaact 8220
tcctttgcat gagtgcagag gacacttggg actgttaatg agttgtattg ctgctacagt 8280
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gtgcttaagt gtgggtacaa tccccatttt ttcttttttc agcctaggat ccctttccca 8700
cccaattgcc tttggatgac tgcagagaat actggggact gttaatgggc tttattgtag 8760
ccatagtcct ttttcttagt ctgagatccc atctcctcct aagtgattaa cattacccca 8820
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atcccatccc cacctaaatc cctttacatt atcacagggg atagatacaa gggactgttg 8940
tgcttaaatg taggtacagc cccccccccc cttttaaccc taagatatct ttcccacata 9000
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agtctctttc catagtctgg gatcccatcc cctcttaaat gatttacatt atcgcagagg 9120
gcgcaaggaa ctgcaaaggt gcttaaatgc aggtagttgg tttttaaacc taggatccca 9180
ttcccagcct gacttgcttt gaattactaa agaggctaca agggactctt atgtgtttaa 9240
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tctaggatcc cattccctcc tatttgattt gcattacccc agagggtaca agggactttt 9420
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tgaggtttgg ggttcaatcc ctggccttgc tcagtgggtt caggatccag cgttgccctg 9540
ggctgtggtg taggtcgcag acgctgctcg gatctggcat tgctgtggct gtggtgtagg 9600
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cactatagtc ccttatgtta tctaggaccc cattcccatc taacttttca tgactgcaga 9780
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tagtctgggg tccatgcccc cagctttgtt tgcattacca cagagggtac ttggaactgt 10860
gaatgtgctt aaattcaggt gtggtccctt ttaatttagg attcctcaac tccttttacc 10920
agggagggca tttgggactg tcaaggtggt aagggcacct gcgttccttt ctttctgttc 10980
atctaggatc ccattccctc ctactccctt tgtattgcat gggaggattt ggggggctct 11040
taaggtgctt aactgcagct gtggtccctc ctattagttt ccaatccctt tctactccct 11100
ttgcattacc acagagggta cttgggactg ttgtagtaca tcccattctc tcatgcctgt 11160
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atttcatttg tccctcatct tctgcagtat ttatagacct cactcatttc ccttgtattt 11280
agtggtgaat gccctttact caagacctgt gtactaggat agttaaagtg agccatggta 11340
attgacccca aataatgtct ttcacttaag tcccttgtat tctttgtttt acaagaagat 11400
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tggccccttt ctttaaacta atacccctcc ttttttatat tcaggggatg ttagtgaccc 11520
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ttcagggatt actgactacc caagtctttt tttggtgggg gtgggggaca gttaatgtgc 11640
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gtggctgctt ctcctgtaca gtttaaatgc acataatttc agtaatccat gctcccttat 11760
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actgcttttt aggttaggac tcctttactt atttaagcac agcatactga ctaccttaaa 12060
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gcccctttct caaacagtaa tatatgtaat gacaattaca ttaggatcct tccccttcac 12240
attccctttg aagtaccaca aggattctga tccctaaggt cccatttctt gacctgttaa 12300
tgtacgtgat gtatttgtct gggttcttgt gcattccttt tctcttccag caggaagtgc 12360
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cagtcacctt ggatgttaat gtgtataact gcacatggct catcccatat gaataagatc 12480
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atggctagtt attgtacata atttgctttt gtacatgttc ctgtacacta aataaggatg 12600
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agtaggtggt tcccactgct aagaccttta tatttggaca gttaatgtgc agaattgcag 12960
ttttccacaa cccagttact tccaggactg ctgtatctcc tttgcaatac ctcaagggat 13020
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cttcatccat agactgagat aatatcccct cagctaacta tcatgacctc agctcttgga 13140
caattaatat tcaccaataa catatcaaaa gtactgatca ttagatagga cccctgttcc 13200
cttactgtat acatcaggga tactgactaa ggcccccttt tttgactgtt aatgcgaata 13260
tttgcaatta tctaattccc cttctattag agtaggacat tatttccttg caccccattc 13320
ggattactga aaggggctgc tgaccacaca aaacttctac tgggactgct gatgagcaca 13380
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atggactatt aatgctcaca attttcaggt gtccatgtat ccagataaga ttgtgctccc 13680
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tgtaatgcca attgccagga tacaaccaaa aagttgttat tttttaaatt ttttaaaacg 14400
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tataccatta ttcactttta gaaaaacaac ctgaacttcc taatccttaa atttcttcat 14700
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aaaacatatc ctgaagtgct ttttggaaac tgttgatcac tttgtttgat taatctgtta 14820
aataaaatgc gttacattaa attcttagcc taaagcacca cactgaagtg agggcttaga 14880
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cttttggata taggttttca ggagtgagat agctgcctgg ttaagatgaa taatagccta 15000
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taatcttttc cttattctcg tttctttctc ttagatacta ctcctagaaa agtcagagga 15300
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gaaacgatat agtcctatat gatctcatcc cccagatggc tgtattgtta aaggagctaa 15480
tataagtata cttgaaataa ttttaggaat tgatactcaa gtgctgtcat gtgaatttta 15540
agttttaaaa agggagtttt aaaagggagt tcaatagggt ttaaagttga tcagataagc 15600
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agagagcaaa cttaatgcct tgaaattatt tccactttcc ttggacagac tggtaagtgc 19560
tgaggatttg ttatgatctg tttcatagcc ttgttttggc aggcctaatt ccattgtcac 19620
tgtcatttcc ttgttttaag aagtggagga tttgttcatt tgaaaaacca tggaatggct 19680
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ccatacctta tttttccttt tgcatagatt tgcttagctg gggttttata tgcctgttgc 19800
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tgtgctgtga aatgatccaa gaccaataga aggcccaaga tctggactgg agttggatgg 24600
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cttaaaccag tttttttaaa cttccatttc tcttcacctc cactccactt gagagacaca 25020
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aucaaaggga augagucact t 21
机译: 用于猪的猪和泡沫饮用水制造装置的猪提高方法,用于猪的猪和泡沫塑料制造装置
机译: 减毒猪流感病毒,免疫原性制剂,药物制剂,在猪中免疫或诱导免疫应答,在猪中治疗猪流感病毒感染,在猪中治疗癌症以及生产免疫原性制剂,细胞的方法,猪细胞系和胚卵
机译: 表达人FasL蛋白抑制细胞免疫的转基因猪克隆体细胞系和使用该克隆的猪