用于促进生姜生长及防控连作生姜土传枯萎病的促生菌及其微生物有机肥料

摘要

本发明涉及用于促进生姜生长及防控连作生姜土传枯萎病的促生菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离得到了一株促生菌NJPRHSDAQ-1，接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕的微生物分解混合物中进行固体发酵制成微生物有机肥料，肥料中含有1×10

说明书

一、技术领域

本发明涉及用于促进生姜生长及防控连作生姜土传枯萎病的促生菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术领域。 

二、背景技术

生姜土传枯萎病是一种典型的土传病害，严重影响生姜的产量与质量。生姜枯萎病主要危害地下块茎，该病病原菌为姜尖孢镰刀菌和腐皮尖孢镰刀菌，在连作2～3茬后即可发病，连作5年后越发严重。如果没有防控该病害的方法与途径，生姜植株生长将难以维继。我们的研究结果表明，连作作物土传枯萎病的关键问题不是养分缺乏或不平衡，也不是土壤次生盐渍化问题，而是土壤中的微生物区系及其次生物质的致毒问题。 

我国作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥产品的原料；大量的养分资源流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因作物收获而带走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物高温发酵制备成腐熟堆肥，再将其用作制备生物(含特定有益微生物)有机肥料的载体将会有很好的应用前景。 

生物有机肥是指特定功能微生物与主要以动植物残体(如农作物秸秆、畜禽粪便等)为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。其本质特征是含有特定功能的、表现出一定肥料效应的有益微生物，这些特定有益微生物的生命活动是生物有机肥优于其它肥料的关键因素。大量研究表明：农业生产中生物有机肥在增强作物抗逆性、提供作物养分、增加肥效、改善作物对养分的吸收、调节土壤酸碱度等方面发挥着积极的作用。 

本研究拟从生姜土传枯萎病发病严重的田块中生长健康的生姜植株根系及根际土壤中筛选促生菌株，再与腐熟堆肥和其他合适载体采用合适的工艺生产促进生姜生长及防控连作生姜土传枯萎病的微生物有机肥料，为生姜规模化生产提供技术产品。 

三、发明内容

1.技术问题 

本发明的目的在于提供用于促进生姜生长及防控连作生姜土传枯萎病的促生菌及其微生物有机肥料，防效高，并且有增产功能，使生姜连作生物障碍土壤得到 生物修复，确保集约化农业的顺利发展。 

2.技术方案 

用于促进生姜生长及防控连作生姜土传枯萎病的促生菌NJPRHSDAQ-1，属解淀粉芽孢杆菌属(Bacillus amyloliquefaciens)，2012年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，NJPRHSDAQ-1菌种保藏号为；CGMCC NO.6963。 

NJPRHSDAQ-1菌株的主要生物学特性为菌体革兰氏染色阳性，杆状，中生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、氧化酶阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阳性，发酵葡萄糖产酸产气，发酵果糖产酸产气，可发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性。 

用上述促进生姜生长及防控连作生姜土传枯萎病的促生菌所生产的微生物有机肥料，该微生物有机肥料中含有1×10⁸个/g以上的NJPRHSDAQ-1、全氮含量质量比为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质含量质量比为30～35％。 

所述微生物有机肥料的生产方法，其特征为： 

(1)将权利要求1所述的促生菌NJPRHSDAQ-1，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养液为NA培养基，pH7.0，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为180～300/转分钟，发酵时间为48hr.，发酵液的含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/ml；所用NA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母粉0.5g，牛肉膏3g，加蒸馏水定容至1000mL，pH值调至7.0，115℃灭菌30min。 

(2)分别将NJPRHSDAQ-1发酵液按50L/吨的量接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕的微生物分解混合物中进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，温度不超过50℃，发酵5天，发酵结束后促生菌NJPRHSDAQ-1含量均达到1×10⁸个/g以上，分别获得含促生菌NJPRHSDAQ-1的猪粪堆肥固体菌剂和含促生菌NJPRHSDAQ-1的菜粕微生物分解混合物固体菌剂。 

所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质含量≥35％，有机氮含量为1.2-2.0％，含水量25-30％。菜粕的微生物酶解物制备方法为，将保藏号为CGMCCNO.1543的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65％和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55-65％和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物酶解物。 

(3)再将含促生菌NJPRHSDAQ-1的猪粪堆肥固体菌剂和含促生菌NJPRHSDAQ-1的菜粕微生物分解混合物固体菌剂按体积比50-70％∶30-50％的比例 充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为能促进生姜生长及防控连作生姜土传枯萎病的微生物有机肥。 

所述微生物有机肥料可专用于促进生姜生长及生姜土传枯萎病的生物防控。 

3.有益效果 

本发明与目前市场上的有机肥料产品相比具有如下优点： 

1)该肥料产品中含有促进生姜生长及抑制生姜土传枯萎病原真菌生长的专一性高效菌株NJPRHSDAQ-1，其抑制效果非常显著。盆栽试验结果表明，生姜土传枯萎病的防控率达到75％以上，如果在开始种植生姜的土壤中连年施用本肥料产品，可以有效控制生姜土传枯萎病的发生。 

2)该肥料为有机肥，含有丰富的有机质(30～35％)，有机氮含量为4％，而且大部分为氨基酸和小分子多肽。本产品总磷含量为4％，而且生物有效性特别高，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。 

3)由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治疫病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于农产品的出口。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为农民增加收入。 

4)该微生物有机肥可以在营养钵使用，也可以在大田使用，不仅具有有机肥的功能，而且其中所含的促生菌通过多种促生及生防机制起作用，从而达到促生及防控生姜土传枯萎病的效果。 

四、附图说明

图1NJPRHSDAQ-1菌株的拮抗效果 

图2NJPRHSDAQ-1菌株的的盆栽效果(注：CK为对照，T为施用含有NJPRHSDAQ-1的微生物有机肥) 

五、具体实施方式

(一)促生菌株的分离 

促生菌株的初筛：采集生姜连作田块中健康生姜植株的根际土壤，采用PDA+NA加入生姜土传枯萎病病原菌-尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(从山东安丘生姜土传枯萎病发病严重的田块中采集的发病植株中经分离纯化所得，经回接试验鉴定后证实为生姜土传枯萎病病原菌)孢子悬液的双层平板初筛目标菌株，初筛共获得14株目标菌株，将菌种冻干-20℃保存，用于进一步筛选。 

促生菌株的复筛：取初筛后的促生菌株和病原菌，在PDA平板上进行对峙试验，进行复筛。用打孔器(5mm)从长满病原菌的平板上挖取一块病原菌菌块至PDA平板中央，置于28℃培养箱中培养。1d(24h)后在PDA平板中央，距病原菌块四周2cm处用灭菌牙签接种待测目标菌，28℃培养3～5d，观察测试目标菌菌落对病原菌的抑制情况。最终筛选得到菌株NJPRHSDAQ-1，其拮抗效果见图1。 

(二)促生菌株的鉴定 

促生菌株NJPRHSDAQ-1鉴定为解淀粉芽孢杆菌属(Bacillus amyloliquefaciens)。 

NJPRHSDAQ-1菌株的主要生物学特性为菌体革兰氏染色阳性，杆状，中生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、氧化酶阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阳性，发酵葡萄糖产酸产气，发酵果糖产酸产气，可发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性。 

(三)菌剂生产 

(1)将促生菌株NJPRHSDAQ-1，接种到NA培养液进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：pH7.0，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为180～300转/分钟，发酵时间为48hr.，发酵液的含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/ml。 

(2)分别将NJPRHSDAQ-1发酵液按50L/吨的量接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕经微生物分解混合物中进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，温度不超过50℃，发酵5天，发酵结束后促生菌NJPRHSDAQ-1含量均达到1×10⁸个/g以上，获得含促生菌株NJPRHSDAQ-1的猪粪堆肥固体菌剂、和含促生菌株NJPRHSDAQ-1的菜粕经微生物分解混合物的固体菌剂。 

所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质含量≥35％，有机氮含量为1.2-2.0％，含水量25-30％。 

其中菜粕经微生物分解混合物的制备方法为(公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)，菌株37-1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65％和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃(共5天)，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和pH，使它们分别维持在55-65％和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)-菜粕堆肥。 

(3)再将含促生菌株NJPRHSDAQ-1的猪粪堆肥固体菌剂、和含促生菌株NJPRHSDAQ-1的菜粕经微生物分解混合物的固体菌剂按体积比50-70％∶30-50％的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为能促进生姜生长及防控连作生姜土传枯萎病的微生物有机肥。 

该微生物有机肥料(促进生姜生长及防控生姜土传枯萎病的专用微生物有机肥)中含有1×10⁸个/g以上的NJPRHSDAQ-1、全氮含量质量比为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质含量质量比为30～35％。 

(四)盆栽防效试验 

试验设2个处理：CK1-对照，未施用微生物有机肥料；T-施用含NJPRHSDAQ-1 菌株的微生物有机肥料。微生物有机肥料用量：将催好芽的生姜移栽到生姜土传枯萎病连作土壤中(生姜土传枯萎病病原孢子达到1×10⁵/g土)，处理T中按土重1％的用量施入微生物有机肥料。所有处理的氮磷钾用量一致，常规管理。之后观察其发病情况，记录发病率，确认促生菌株是否有抑制生姜枯萎病的效果。 

生姜植株培育30天后，发现CK(对照，未施微生物有机肥料)处理有发病植株，再过20天后，CK处理有80％的植株发病。生姜培育50天后的植株发病率和生姜土传枯萎病的防控率结果如表1所示。盆栽试验结果表明：施用含有NJPRHSDAQ-1的微生物有机肥，能显著增加生姜连作土壤中细菌和防线菌的数量，降低真菌的数量(表1)，有效防控生姜土传枯萎病的发生，其防控率为75％(表2)。 

表1不同生物有机肥对生姜连作枯萎病土壤微生物区系的影响 

注：CK：对照；T：含抗生姜土传枯萎病专性促生菌(NJPRHSDAQ-1)的微生物有机肥；所有供试土壤均为生姜土传枯萎病连作土壤(下同) 

表2不同生物有机肥防控生姜枯萎病的效果 

(五)田间试验 

采用地膜覆盖栽培催好牙的种姜。施用防控生姜土传枯萎病的专用微生物有机肥，微生物有机肥的用量如下： 

作基肥用时施用量为50g/棵(折221kg/亩)，第一次培土和第二次培土时期再分别施一次肥，微生物有机肥施用量为50g/棵(折221kg/亩)，故微生物有机肥施用总量为663kg/亩。结果表明：按照每公斤生姜4元(收购价)计算，大田施用微生物有机肥可使姜农增收5307.6元/亩，扣除该微生物有机肥成本投入1524.9元/亩，姜农还可净得3782.7元/亩，使大面积施用这种微生物有机肥料成为可能。 

表3施用微生物有机肥对大田生姜姜块产量的影响(山东省安丘市，2012年4月-10月) 

注：促进生姜生长及抗生姜枯萎病专用微生物有机肥的用量：三次微生物有机肥使用量为50g/棵(即663kg/亩) 

本发明专利从微生物区系这一关键问题着手(表1)，研制出一种能显著促进 生姜生长及防控生姜连作枯萎病发生的微生物有机肥料产品，生物防控率达75％以上。本肥料产品的作用机制在于本肥料产品中的有效碳和有效氮源给产品中的功能菌微生物区系的培育提供了很好的条件，使之迅速建立外源有益功能菌微生物的生态及其食物链；另一方面，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对连作障碍土壤中生姜作物的生长十分有利，大大提高了生姜作物的立苗率和抗逆能力。