一种构建基因工程FK506高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株

摘要

本发明公开了一种构建基因工程FK506(他克莫司)高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株。基因组中整合有表达与FK506生物合成相关基因的倍增表达盒的受体菌株具有稳定高产FK506的能力，具体地，以位点特异性整合机制介导的基因重组方式，将FK506基因簇中与前体生物合成相关的内源基因倍增到链霉菌染色体上，定向改造FK506产生链霉菌，获得FK506高产菌株。本发明还公开了FK506高产菌株的用途。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，具体地，涉及一种构建基因工程FK506(他 克莫司)高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株。

背景技术

FK506又名他克莫司(商品名普乐可复)，是一种具有免疫抑制活性的23 元大环内酯类化合物，由日本藤泽制药公司于1981年从筑波链霉菌 Streptomyces tsukubaensis No.9993的代谢产物中提取获得。自1994年由FDA 批准使用以来广泛应用于临床，其作用机制是能够抑制多种细胞因子如白细胞 介素-2、γ干扰素的产生，阻断T细胞活化，抑制细胞毒性T细胞的增殖和白细 胞介素-2受体的表达，FK506抑制IL-2的活性是环孢素的10-100倍，因而FK506 不但能作为肾脏移植手术后的免疫抑制剂，对于系统性红斑狼疮、特应性皮炎、 哮喘等疾病也有较好的疗效。

由于FK506是来源于链霉菌的结构复杂的次级代谢产物，体外化学合成的 难度极大，目前生产主要依赖于微生物发酵。研究表明，FK506的基本生物合 成途径如下：聚酮合成酶(PKS)首先识别来源于分支酸的起始单元4，5-二羟 基-1-环己烯基羧酸(DHCHC)，伴随不同延伸单元的识别和上载得到完整的 聚酮长链，接由非核糖体依赖的聚肽合成酶(NRPS)引入来源于L-赖氨酸的 L-哌啶甲酸形成聚酮骨架环，最后由相关的O-甲基转移酶和P450加氧酶完成 后修饰步骤。在FK506基因簇中，与前体烯丙基丙二酰-CoA、甲氧基丙二酰-ACP、 4，5-二羟基-1-环己烯基羧酸，以及L-哌啶甲酸合成相关的基因已经确证功能。

基于FK506广泛的药理活性和临床应用，以提高FK506产量为目的的生 产菌的遗传改造从未停止，过去的研究主要集中在发酵工艺优化和以传统的化 学或物理诱变、自然选择等方法为主的遗传育种方面。然而这些方法改造的菌 株存在遗产不稳定，难于保藏，且产量仍然较低等问题，因此本领域迫切需要 开发构建基因工程FK506高产菌的方法，以满足临床需求。

发明内容

本发明的目的就是提供一种构建基因工程FK506(他克莫司)高产菌株的 方法及其应用。

本发明的另一目的是提供FK506(他克莫司)高产链霉菌及其用途。

在本发明的第一方面，提供了一种稳定高产FK506(他克莫司)的工程菌株， 其特征在于，所述菌株的基因组中整合有基因倍增表达盒，所述的基因倍增表达盒 表达选自下组的基因所编码的蛋白：烯丙基丙二酰-CoA合成基因、甲氧基丙二酰 -ACP合成基因、4，5-二羟基-1-环己烯基羧酸合成基因，L-哌啶甲酸合成基因，或 其组合。

在另一优选例中，所述菌株包括链霉菌属。

在另一优选例中，所述菌株为筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)。

在另一优选例中，所述的基因组中整合有1-20个所述的基因倍增表达盒。

在另一优选例中，所述的基因组中整合有1-10个所述的基因倍增表达盒， 较佳地为2个。

在另一优选例中，所述基因倍增表达盒表达烯丙基丙二酰-CoA和/或甲氧基 丙二酰-ACP合成基因编码的蛋白。

在本发明的第二方面，提供了一种生产FK506(他克莫司)的方法，包括步 骤：

(i)培养本发明第一方面所述的工程菌株，从而获得含FK506(他克莫司)的 发酵产物；和

(ii)从所述发酵产物中分离出FK506(他克莫司)。

在本发明的第三方面，提供了一种构建本发明第一方面所述菌株的方法，包 括步骤：

(a)构建含有基因倍增表达盒的载体，所述表达盒具有以下元件：ΦC31整合 酶基因，噬菌体附着位点靶序列attP，属间接合元件oriT，阿泊拉霉素抗性基 因acc(3)IV，和目的倍增基因；

(b)将步骤(a)获得的含有基因倍增表达盒的载体转入受体菌株，获得受体基因 组整合有基因倍增表达盒的菌株。

在另一优选例中，所述的构建本发明第一方面菌株的方法，还包括步骤(c)： PCR验证步骤(b)得到的整合有基因倍增表达盒的菌株的基因型；和/或

步骤(d)：发酵检测得到的整合有基因倍增表达盒菌株的FK506(他克莫司) 的产量。

在另一优选例中，步骤(a)所述的倍增基因选自下组：烯丙基丙二酰-CoA合 成基因、甲氧基丙二酰-ACP合成基因、4，5-二羟基-1-环己烯基羧酸合成基因， L-哌啶甲酸合成基因，或其组合。

在另一优选例中，步骤(a)所述的载体为质粒、黏粒或核酸片段。

在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒含有强启动子元件。

在另一优选例中，所述的强启动子元件为红霉素抗性基因ermE的启动子 ermE*。

在另一优选例中，步骤(a)所述的载体还包括抗性基因元件，较佳地为阿泊拉 霉素抗性基因。

在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒具有以下元件：强启动子元件 ermE*、倍增目的基因tcsABCD、ΦC31整合酶基因、噬菌体附着位点靶序列 attP、属间接合元件oriT，和阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV。

在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒具有以下元件：强启动子元件 ermE*、倍增目的基因fkbGKJIH、ΦC31整合酶基因、噬菌体附着位点靶序列 attP、属间接合元件oriT，和阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV。

在另一优选例中，步骤(b)所述受体基因组整合的基因倍增表达盒数量为1-5 个，较佳地为2个。

在另一优选例中，步骤(b)所述的受体菌株具有附着位点attB。

在另一优选例中，步骤(b)所述的整合为载体attP位点和受体基因组attB 位点之间的位点特异性整合。

在另一优选例中，attP位点和attB位点之间整合后形成重组杂合位点attL和 attR。

在另一优选例中，attL的核心核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，attR的核 心核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在另一优选例中，attL的核心核苷酸序列与SEQ ID NO：1序列的同源性为 70-100％，attR的核心核苷酸序列与SEQ ID NO：2序列的同源性为70-100％。

在本发明的第四方面，提供了一种本发明第一方面所述工程菌株的用途， 它被用作发酵生产FK506(他克莫司)及其衍生物的工程菌。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1表示FK506和生物合成前体的化学结构。

图1A显示FK506的化学结构。

图1B为FK506的生物合成前体4，5-二羟基-1-环己烯基羧酸。

图1C为FK506的生物合成前体L-哌啶甲酸。

图1D为FK506的生物合成前体丙二酰-CoA。

图1E为FK506的生物合成前体甲基丙二酰-CoA。

图1F为FK506的生物合成前体烯丙基丙二酰-CoA。

图1G为FK506的生物合成前体甲氧基丙二酰-ACP。

图2显示本发明由ΦC31整合酶介导的位点特异性重组过程：细菌附着位 点attB在靶细胞的染色体上，噬菌体附着位点attP在供体质粒上，向靶细胞和 供体分子引入ΦC31整合酶，从而形成由ΦC31整合酶介导的重组产物。

图3显示了一种用于构建基因文库的质粒pSET 152的结构：该质粒包含 ΦC31整合酶基因序列、噬菌体附着位点attP序列、阿泊拉霉素抗性基因 acc(3)IV、属间接合转移元件oriT。

图4显示由pSET 152和pOJ446构建的黏粒pJTU2554的结构：该质粒包 含来源于pSET152的ΦC31整合酶基因序列、噬菌体附着位点attP序列、部分 阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV、属间接合转移元件oriT，以及来源于pOJ446 的cos位点和部分阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV。

图5显示对出发菌株ZJU506-01和基因倍增菌株CDD506-7G6发酵液的 HPLC分析结果。

图5A显示出发菌株ZJU506-01的发酵液HPLC分析结果。

图5B显示基因倍增菌株CDD506-7G6发酵液的HPLC分析结果。

图6显示基因倍增质粒pSET152-tcsABCD的结构：该质粒是pSET152衍 生质粒，插入了红霉素抗性基因启动子ermE*控制下的与前体烯丙基丙二酰 -CoA生物合成相关的内源基因tcsA、tcsB、tcsC和tcsD。

图7显示出发菌株ZJU506-01和基因倍增菌株CDD506-102发酵液的HPLC 分析结果。

图7A显示出发菌株ZJU506-01的发酵HPLC结果。

图7B显示倍增了烯丙基丙二酰-CoA相关基因簇tcsA-D的突变株 CDD506-102的发酵HPLC结果。

图8显示了基因倍增质粒pSET152-fkbGKJIH的结构：该质粒是pSET152 衍生质粒，插入了红霉素抗性基因启动子ermE*控制下的与前体甲氧基丙二酰 -ACP生物合成相关的内源基因fkbG、fkbK、fkbJ、fkbI和fkbH。

图9显示了对出发菌株ZJU506-01和基因倍增菌株CDD506-103发酵液的 HPLC分析结果。

图9A显示了出发菌株ZJU506-01发酵液HPLC分析结果。

图9B显示了倍增了甲氧基丙二酰-ACP相关基因簇fkbG-K的突变株 CDD506-103发酵液HPLC分析结果。

图10显示了出发菌株ZJU506-01和基因倍增菌株CDD506-7G6、 CDD506-102、CDD506-103发酵液HPLC分析结果，以平行的3个样本平均值 作为考察对象，误差线标示标准偏差。

图11显示对出发菌株ZJU506-01和阴性对照菌株CDD506-101发酵液的 HPLC分析结果。

图11A显示出发菌株ZJU506-01的发酵HPLC结果。

图11B显示整合有质粒pSET 152的突变株CDD506-101的发酵HPLC结果。

符号说明

图2中，attB表示ΦC31整合酶在大肠杆菌DNA的位点；attP表示ΦC31 整合酶在λ噬菌体DNA的位点；attL表示ΦC31整合酶作用产生的重组序列左 臂；attR表示ΦC31整合酶作用产生的重组序列右臂。

图3中，acc(3)IV表示阿泊拉霉素抗性基因；int ΦC31表示噬菌体ΦC31 整合酶基因；attPΦC31表示ΦC31整合酶识别的在λ噬菌体DNA附着位点的 碱基序列；oriT表示属间接合转移所需的复制起点；lacZa表示半乳糖操纵子 基因。

图4中，cos表示噬菌体包装蛋白识别并包装DNA的末端序列。

图5中，mAU at 215nm表示紫外检测器在215nm波长处的毫吸光度单位。

图6中，ermE*为源自红霉素抗性基因ermE的强启动子；tcsA、tcsB、tcsC 和tcsD为FK506基因簇中与前体烯丙基丙二酰-CoA生物合成相关的内源基因。

图8中，fkbG、fkbK、fkbJ、fkbI和fkbH为FK506基因簇中与前体甲氧基 丙二酰-ACP生物合成相关的内源基因。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，基因组中整合有表达与 FK506生物合成相关基因的倍增表达盒的受体菌株具有稳定地表达甚至提高 FK506产量的能力。

具体地，采用ΦC31位点特异性整合机制介导的整合子系统作为工具，将 FK506产生菌中生物合成代谢流基因位点(如tcsABCD和fkbGHIJK)进行倍 增，构建的表达盒具有以下元件：强启动子元件ermE*、倍增目的基因、ΦC31 整合酶基因、噬菌体附着位点靶序列attP、属间接合元件oriT，和阿泊拉霉素 抗性基因。获得的改造菌株，其FK506的产量大大提高，分别高达100％和30％ 以上，且遗传稳定，不易突变，显著降低了临床用药的成本。在此基础上完成 了本发明。

术语

如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“30％以上“指≥90％，“0.2％ 以下”指≤0.2％。

出发菌株

如本文所用，术语“本发明出发菌株”或“本发明出发微生物”可以互换 使用，都是指筑波链霉菌Streptomyces tsukubaensis ZJU506-01，本菌株最初分 离自浙江大学玉泉校区老和山土壤，并保存在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心(CGMCC)，编号为No.5177。

本发明出发菌株呈菌丝状生长，产孢能力弱，陆生性强，适合培养温度为 28-30℃，适合pH为6.5-7.5，具有卡那霉素抗性，没有阿泊拉霉素和硫链丝菌 素抗性。在固体培养基中培养2-3天形成单菌落，表面干燥、形状规则，基内 菌丝呈肉色，气生菌丝呈粉红色；在液体培养基中培养3天后，液面与瓶壁交 界处粘有菌苔，培养液中悬浮有大量菌丝团，并产生粉红色色素。

应理解，出发菌株不仅包括编号为CGMCC No.5177的菌株，还包括其衍 生菌株。

FK506及其合成基因簇

FK506结构见图1A表示了FK506的结构，图1B，图1C，图1D，图1F， 图1G分别显示了FK506合成前体4，5-二羟基-1-环己烯基羧酸、L-哌啶甲酸、 丙二酰-CoA、甲基丙二酰-CoA、烯丙基丙二酰-CoA和甲氧基丙二酰-ACP的结 构。

FK506合成有关的基因簇十分繁杂，具体地，fkbO负责将分支酸转化为 DHCHC，fkbL负责将L-赖氨酸转化为L-哌啶甲酸，连续成簇的tcsA-D负责将 丙酰-CoA和丙二酰-CoA转化为烯丙基丙二酰-CoA，连续成簇的fkbG-K负责 将1，3-二磷酸甘油酸转化为甲氧基丙二酰-ACP。本领域技术人员能使用通用的 方法获得以上基因的序列，例如从NCBI上免费获取。

引物

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下 能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是 天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然 的核苷酸如LNA或ZNA等。

引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引 物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的 序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不 互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板 充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行 扩增。

基因倍增表达盒

本发明提供了一种用于整合在受体基因组中的基因倍增表达盒，具体地， 所述表达盒具有以下元件：

ΦC31整合酶基因，噬菌体附着位点靶序列attP，属间接合元件oriT，阿 泊拉霉素抗性基因acc(3)IV，和倍增目的基因，所述基因可以任选自下组：烯 丙基丙二酰-CoA合成基因、甲氧基丙二酰-ACP合成基因、4，5-二羟基-1-环己烯 基羧酸合成基因，L-哌啶甲酸合成基因，或其组合。

在一个优选例中，表达盒还包括强启动子，较佳地为红霉素抗性基因ermE 的强启动子ermE*，

在一个优选例中，整合在基因组中的表达盒数量为1-5个，较佳地为2个。

位点特异性整合

本发明提供了一种用于选择FK506产生菌种的高效接合转移系统，具体 地，来自噬菌体ΦC31的整合酶能够特异、有效地介导接合转移载体中attP位 点与链霉菌染色体上attB位点间的重组反应。该酶只催化attP/attB之间的重组， 从而形成杂合位点attL和attR，却不介导attL/attR之间的剪切，故由该酶催化 的重组是不可逆的。利用这种方法倍增与前体相关的内源基因，插入到FK506 产生菌种染色体的特异位点attB，获得的基因倍增菌株能够稳定传代。

图2显示本发明由ΦC31整合酶介导的位点特异性重组过程：细菌附着位点 attB在靶细胞的染色体上，噬菌体附着位点attP在供体质粒上，向靶细胞和供体 分子引入ΦC31整合酶，从而形成由ΦC31整合酶介导的重组产物。用本发明体 系进行遗传改造，可以缩短工作周期，并且提高目标高产菌株的遗传稳定性。 在另一优选例中，attP位点和attB位点之间整合形成重组杂合位点attL和attR， attL的核心核苷酸序列为SEQ ID NO：1，attR的核心核苷酸序列为SEQ ID NO： 2。在一个优选例中，attL的核心核苷酸序列与SEQ ID NO：1序列的同源性为 70-100％，attR的核心核苷酸序列与SEQ ID NO：2序列的同源性为70-100％。

工程菌构建

本发明提供了一种构建基因工程菌FK506高产菌株的方法，包括(但不局 限于)以下步骤：

1.构建含有基因倍增表达盒的载体

设计引物克隆获得目的基因，通过限制性内切酶酶切、T4连接酶连接等常 规分子生物学手段把目的基因片段置于表达盒中。

2.将获得的含有基因倍增表达盒的载体转入受体菌株，获得受体基因组整合 有基因倍增表达盒的菌株。在一个优选例中，将构建的具有表达盒的载体通过属 间接合转移，转入出发菌株中，由于表达盒上具有ΦC31整合酶及对应attP序 列，并含有属间接合转移元件oriT，阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV，倍增基因 片段以位点特异性方式稳定地整合到染色体attB位点。在一定抗性筛选条件下 挑选阳性接合子。

在一个优选例中，还包括步骤(c)：PCR验证步骤(b)得到的整合有基因倍增表 达盒的菌株的基因型；和/或

步骤(d)：发酵检测得到的整合有基因倍增表达盒菌株的FK506(他克莫司) 的产量。在一个优选例中，将具有一定抗性的阳性接合子在传代培养，提取菌体 总DNA，进行基因型的PCR验证。由于插入attB位点的碱基片段包括载体一 般较大，故在一个优选例中，可以针对性地设计多对引物，以排除同源重组等 非预期现象的可能性。回收PCR扩增得到的目的大小的碱基片段，采用DNA 测序的方法最终确证基因倍增菌株的获得。

本发明获得的菌株中，其中包括：CDD506-102，与前体烯丙基丙二酰-CoA 生物合成相关的基因得到倍增，烯丙基丙二酰-CoA的代谢流得到增强，发酵生 产FK506的能力得到提高。本发明的筑波链霉菌Streptomyces tsukubaensis CDD506-102，于2011年8月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)(北京，中国)，保藏号为CGMCC No：5176。

还包括筑波链霉菌高产菌株CDD506-103，与前体甲氧基丙二酰-ACP生物 合成相关的基因得到倍增，甲氧基丙二酰-ACP的代谢流得到增强，发酵生产 FK506的能力得到提高。本发明的筑波链霉菌Streptomyces tsukubaensis CDD506-103，于2011年9月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(CGMCC)(北京，中国)，保藏号为CGMCC No：5221。

发酵生产FK506

本发明的基因改造菌株可以用来发酵生产FK506，在一个优选例中，培养 基可以包括(但不限于)：

斜面培养基：0.1％酵母膏，0.02％L-丙氨酸，0.05％L-精氨酸，0.5％可 溶性淀粉，0.25％NaCl，1.0％Na₂SO₄，琼脂(1.0-2.0％)，pH调至7.5。

种子培养基：1.0％甘油，4.0％黄豆饼粉，1.0％可溶性淀粉，0.2％CaCO₃， pH 7.0±0.2。

摇瓶发酵培养基：2.0％可溶性淀粉，1.0％葡萄糖，1.0％豆油，0.1％L- 赖氨酸，0.17％(NH₄)₂SO₄，0.05％K₂HPO₄，0.05％NaCl，0.05％MgSO₄·H₂O， 0.0025％FeSO₄·7H₂O，0.0005％MnCl₂·4H₂O，0.001％ZnSO₄·7H₂O，0.002％ CaCl₂·2H₂O，0.0003％CoCl₂·6H₂O，0.0003％CuSO₄·5H₂O，1.0％CaCO₃，pH 7.0±0.2。

本发明菌株的发酵产物可用于制备FK506及其衍生物。

药物组合物和施用方法

本发明菌株发酵产物中的FK506可以用作制备药物。本发明化合物可施用 于哺乳动物(如人)，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部等 方式给药。所述化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合 给药。需要指出，本发明的化合物可以混合给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这 些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬 酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、 蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、 明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩 解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、 和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润 湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑 剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或 其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备， 如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中 活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可 采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上 述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆 或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂， 如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙 酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉 米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮 剂、甜味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、 聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混 合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分 散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉 末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及 其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和 吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂， 或必要时可能需要的推进剂一起混合。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺 乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重 的个体而言，日给药剂量通常为1～1000mg，优选20～500mg。当然，具体剂 量还应考虑给药途径、个体健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内 的。

本发明的主要优点包括：

(1)用本发明方法进行遗传改造的菌株性能重现性好；

(2)经改造的FK506产生菌遗传稳定，不易突变；

(3)提高了生产效率，简化了药物工艺，显著降低了FK506的生产成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的公开内 容，对本领域的技术人员而言是显而易见的，下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

基因文库的构建

基于质粒pSET 152和pOJ446，改造获得用于构建基因文库的黏粒，命名 为pJTU2554。以该黏粒作为载体，构建出发菌株ZJU506-01的基因文库。

pSET152的结构见图3(来自：Gene，116：43-49，1992)：acc(3)IV表示阿泊拉 霉素抗性基因；intΦC31表示噬菌体ΦC31整合酶基因；attPΦC31表示ΦC31 整合酶识别的在λ噬菌体DNA附着位点的碱基序列；oriT表示属间接合转移 所需的复制起点；lacZa表示半乳糖操纵子基因。

pSET152和pOJ446构建的黏粒pJTU2554结构见图4。该质粒包含来源于 pSET152的ΦC31整合酶基因序列、噬菌体附着位点attP序列、部分阿泊拉霉 素抗性基因acc(3)IV、属间接合转移元件oriT，以及来源于pOJ446的cos位点 和部分阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV。

实施例2

构建包含烯丙基丙二酰-CoA和甲氧基丙二酰-ACP生物合成基因的菌株 CDD506-7G6

本实施例的实验思路如下：设计筛库引物，从FK506产生菌种ZJU506-01 的基因文库中筛选FK506产生菌种ZJU506-01的基因文库，获得包含烯丙基丙 二酰-CoA和甲氧基丙二酰-ACP部分基因簇的黏粒pJTU506-7G6→接合转移获 得基因倍增的接合子→基因倍增菌株的筛选和验证→发酵验证高产突变株的获 得。

具体构建步骤如下：

1.基因倍增黏粒pJTU506-7G6的筛选

设计筛库引物，用PCR扩增的方法筛选获得包含FK506合成相关的烯丙 基丙二酰-CoA和甲氧基丙二酰-ACP基因簇的黏粒pJTU2554-7G6。

左端筛库引物序列为：

上游：5’-CCTCCATCGCCCTGGCGGAGCTTC-3’(SEQ ID NO：3)

下游：5’-CAGCGACGCCGTTCACGGCCGGGG-3’(SEQ ID NO：4)

右端筛库引物序列为：

上游：5’-TGTCCGACGCGCTGCTCGCTTACG-3’(SEQ ID NO：5)

下游：5’-GGCCGACGCCAGCATGGCCAGGTC-3’(SEQ ID NO：6)

2.黏粒pJTU506-7G6从大肠杆菌向出发菌种ZJU506-01的属间接合转移

黏粒供体：在37℃，200rpm的条件下培养含有黏粒pJTU506-7G6的E.coli ET 12567(pUZ8002)(来自：Norwich：Practical Streptomyces Genetics，2000)至 OD₆₀₀＝0.5-0.6，离心收集25mL大肠杆菌培养液50mL，用25mL LB洗涤两次， 重悬于2mL LB，作为供体细胞。

黏粒受体：在28℃，220rpm的条件下，培养出发菌种ZJU506-01作为黏粒 受体。培养至对数生长期后期，离心收集25mL链霉菌培养液，用25mL LB洗涤 两次，重悬于2mL LB，作为受体细胞。

接合转移：将受体细胞与供体细胞以1∶100的比例混合后，直接涂布在含 有10mM MgCl₂的AS-1平板上，30℃培养20hr后，采用无菌水轻轻洗涤平板表 面，以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖含萘啶酮酸(终浓度为 50ng/μL)和阿泊拉霉素(终浓度为30ng/μL)的1mL无菌水。30℃培养5天以 上挑取接合子。

3.基因倍增菌株CDD506-7G6的表型筛选和基因型验证

挑取阿泊拉霉素抗性(Am^R)的接合子单菌落到抗性TSB液体培养基培养 传代，收集菌体提取总DNA，分别设计两对引物，通过PCR扩增验证基因整合 attB位点特异性和倍增片段正确性。

用于验证attL序列的引物设计如下：

上游：5’-CCCACAGCTGGAGGCCGTGG-3’(SEQ ID NO：7)

下游：5’-CAGGGCGAGCAATTCCGAGA-3’(SEQ ID NO：8)

用于验证attR序列的引物设计如下：

上游：5’-CAGAGCAGGATTCCCGTTGAG-3’(SEQ ID NO：9)

下游：5’-CCCTTCATCATGATGGACCAG-3’(SEQ ID NO：10)

PCR产物含有特异大小的目的片段，分别回收后采用上游引物进行测序验 证，筛选得到倍增有黏粒pJTU506-7G6所含基因片段的阳性接合子，获得的基 因倍增菌株命名为CDD506-7G6。

4.发酵验证

斜面培养基：0.1％酵母膏，0.02％L-丙氨酸，0.05％L-精氨酸，0.5％可 溶性淀粉，0.25％NaCl，1.0％Na₂SO₄，2.0％琼脂，pH 7.5。

种子培养基：1.0％甘油，4.0％黄豆饼粉，1.0％可溶性淀粉，0.2％CaCO₃， pH 7.0±0.2。

摇瓶发酵培养基：2.0％可溶性淀粉，1.0％葡萄糖，1.0％豆油，0.1％L- 赖氨酸，0.17％(NH₄)₂SO₄，0.05％K₂HPO₄，0.05％NaCl，0.05％MgSO₄·H₂O， 0.0025％FeSO₄·7H₂O，0.0005％MnCl₂·4H₂O，0.001％ZnSO₄·7H₂O，0.002％ CaCl₂·2H₂O，0.0003％CoCl₂·6H₂O，0.0003％CuSO₄·5H₂O，1.0％CaCO₃，pH 7.0±0.2。

将基因倍增菌株CDD506-7G6和作为对照的出发菌种ZJU506-01接种到摇 瓶发酵，发酵条件如下：AS-1斜面活化，30℃培养2-3天；种子瓶发酵，28℃， 220rpm培养24-28hr；发酵瓶发酵，28℃220rpm培养6天。

发酵液离心分离菌体和上清，用等体积乙酸乙酯二次萃取发酵液上清，收 集上层有机相；用丙酮浸泡菌体，离心收集有机相。合并有机相，旋蒸浓缩后 进行通过HPLC检测。

HPLC检测条件：色谱柱Diamonsil C18(2)5u 250×4.6mm；A相(35％纯水)、 B相(65％乙腈)、柱温55℃、流速1.0ml/min、UV检测波长215nm、分析时间 25min，17-19min左右出峰。

根据3个平行实验的HPLC检测结果，图5显示对出发菌株ZJU506-01和基因 倍增菌株CDD506-7G6发酵液的HPLC分析结果；图5A为出发菌株ZJU506-01的 发酵液HPLC分析结果，图5B为基因倍增菌株CDD506-7G6发酵液的HPLC分析 结果。菌株CDD506-7G6发酵液中FK506的产量与对照相比较，提高了18％左右。

实施例3

构建烯丙基丙二酰-CoA生物合成相关的基因簇倍增的菌株CDD506-102

具体构建步骤如下：

1.构建基因倍增质粒pSET152-tcsABCD

以包含部分FK506生物合成基因簇的黏粒pJTU506-7G6为模板，PCR扩 增与烯丙基丙二酰-CoA生物合成相关的目的基因片段。

扩增亚基因簇tcsA-D所用的引物为：

上游：5’-TACTAGTCCATCCCGATCATGCCCCTCCTG-3’(SEQ ID NO： 11)

下游：5’-TTCTAGAAGGCCCTGACGCGGGACTGACC-3’(SEQ ID NO： 12)

通过限制酶酶切、T4连接酶连接等方法将倍增亚基因簇片段置于强启动子 ermE*控制下，并连接到载体pSET152，得到基因倍增质粒pSET152-tcsABCD (图6)，ermE*为源自红霉素抗性基因ermE的强启动子；tcsA、tcsB、tcsC 和tcsD为FK506基因簇中与前体烯丙基丙二酰-CoA生物合成相关的内源基因。

2.质粒pSET152-tcsABCD从大肠杆菌向出发菌种ZJU506-01的属间接合 转移

质粒供体：在37℃，200rpm条件下，培养含有质粒pSET152-tcsABCD的E. coli ET12567(pUZ8002)至OD₆₀₀＝0.5-0.6，离心收集50mL培养液中的大肠杆 菌，用25mL LB洗两次，重悬于2mL LB作为供体细胞。

质粒受体：在28℃，220rpm条件下，培养FK506产生菌ZJU506-01至对数 生长期后期，离心收集25mL培养液中的链霉菌，用25mL LB洗两次，重悬于2mL LB作为受体细胞。

接合转移：将受体细胞与供体细胞以1∶100的比例混合后，直接涂布在含 有10mM MgCl₂的AS-1平板上，30℃培养20hr后，采用无菌水轻轻洗涤平板表 面以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖含萘啶酮酸(终浓度为 50ng/μL)和阿泊拉霉素(终浓度为30ng/μL)的1mL无菌水。30℃培养5天以 上挑取接合子。

2.基因倍增菌株CDD506-102的表型筛选和基因型验证

挑取阿泊拉霉素抗性(Am^R)的接合子单菌落到抗性TSB液体培养基培养 传代，收集菌体提取总DNA，分别设计两对引物，通过PCR扩增验证基因整合 attB位点特异性和倍增片段正确性。

用于验证attL序列的引物设计如下：

上游：5’-CCCACAGCTGGAGGCCGTGG-3’(SEQ ID NO：7)

下游：5’-CAGGGCGAGCAATTCCGAGA-3’(SEQ ID NO：8)

用于验证attR序列的引物设计如下：

上游：5’-CAGAGCAGGATTCCCGTTGAG-3’(SEQ ID NO：9)

下游：5’-CCCTTCATCATGATGGACCAG-3’(SEQ ID NO：10)

利用载体序列和倍增片段基因序列设计两对引物，序列如下：

上游：5’-GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG-3’(SEQ ID NO：13)

下游：5’-CAATGGGCTGCGGCTGCTGGAGATC-3’(SEQ ID NO：14)

上游：5’-GAAGCGCTCCCGGGGCGCGGATATC-3’(SEQ ID NO：15)

下游：5’-TCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTG-3’(SEQ ID NO：16)

PCR产物含有特异大小的目的片段，分别回收后采用上游引物进行测序验 证，筛选得到倍增有目的基因片段tcsA-D的阳性接合子，获得的基因倍增菌株 命名为CDD506-102。

3.发酵验证

培养基成分同实施例2。

将基因倍增菌株CDD506-102和对照出发菌种ZJU506-01接种到摇瓶发酵， 发酵条件如下：AS-1斜面活化，30℃培养3天；种子瓶发酵，28℃，220rpm培 养24-28hr；发酵瓶发酵28℃220rpm培养6天。

发酵液离心分离菌体和上清，用等体积乙酸乙酯二次萃取发酵液上清，收 集上层有机相；用丙酮浸泡菌体，离心收集有机相。合并有机相，旋蒸浓缩后 进行通过HPLC检测。HPLC检测条件同实施例2。

根据3个平行实验的HPLC检测结果，测定CDD506-102的发酵液中FK506 的产量，图7为出发菌株ZJU506-01和基因倍增菌株CDD506-102发酵液的 HPLC分析结果，图7A为出发菌株ZJU506-01的发酵HPLC结果，图7B为倍 增了烯丙基丙二酰-CoA相关基因簇tcsA-D的突变株CDD506-102的发酵HPLC 结果，菌株CDD506-102发酵液中FK506的产量与对照相比较，提高了102％ 左右。

实施例4

构建甲氧基丙二酰-ACP生物合成相关的基因簇倍增的菌株CDD506-103

具体构建步骤如下：

1.基因倍增质粒pSET152-fkbGKJIH的构建

以包含部分FK506生物合成基因簇的黏粒pJTU506-7G6为模板，分别PCR 扩增与甲氧基丙二酰-ACP生物合成相关的两段反向的基因片段。

扩增基因fkbG所用的引物为：

上游：5’-TACTAGTCGAGGCGCCGCTGGACCGTGTGG-3’(SEQ ID NO： 17)

下游：5’-TTCTAGACAGTATCCCGTTCACCGCTTCC-3’(SEQ ID NO：18)

扩增亚基因簇fkbH-K所用的引物为：

上游：5’-TACTAGTGGCAGCGCCTTCGCCGACCACATC-3’(SEQ ID NO： 19)

下游：5’-TTCTAGACAATGCGGGGCTGCGCGACGACG-3’(SEQ ID NO： 20)

通过限制酶酶切、T4连接酶连接的方法将两段扩增片段同向连接，并置于 强启动子ermE*控制下连接到载体pSET152，得到基因倍增质粒 pSET152-fkbGKJIH(图8)。

2.质粒pSET152-fkbGKJIH从大肠杆菌向出发菌种ZJU506-01的属间接合 转移

质粒供体：在37℃，200rpm的条件下，培养含有质粒pSET152-fkbGKJIH 的E.coli ET12567(pUZ8002)，至OD₆₀₀＝0.5-0.6，离心收集50mL培养液中的大 肠杆菌，用25mL LB洗两次，重悬于2mL LB作为供体细胞。

质粒受体：在28℃，220rpm的条件下，培养出发菌株ZJU506-01至对数生 长期后期，离心收集25mL培养液中的链霉菌，用25mL LB洗两次，重悬于2mL LB作为受体细胞。

接合转移：将受体细胞与供体细胞以1∶100的比例混合后，直接涂布在含 有10mM MgCl₂的AS-1平板上，30℃培养20hr后，采用无菌水轻轻洗涤平板表 面以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖含萘啶酮酸(终浓度为 50ng/μL)和阿泊拉霉素(终浓度为30ng/μL)的1mL无菌水。30℃培养5天以 上挑取接合子。

3.基因倍增菌株CDD506-103的表型筛选和基因型验证

挑取阿泊拉霉素抗性(Am^R)的接合子单菌落到抗性TSB液体培养基培养 传代，收集菌体提取总DNA，分别设计两对引物，通过PCR扩增验证基因整合 attB位点特异性和倍增片段正确性。

用于验证attL序列的引物设计如下：

上游：5’-CCCACAGCTGGAGGCCGTGG-3’(SEQ ID NO：7)

下游：5’-CAGGGCGAGCAATTCCGAGA-3’(SEQ ID NO：8)

用于验证attR序列的引物设计如下：

上游：5’-CAGAGCAGGATTCCCGTTGAG-3’(SEQ ID NO：9)

下游：5’-CCCTTCATCATGATGGACCAG-3’(SEQ ID NO：10)

利用载体序列和倍增片段基因序列设计两对引物，序列如下：

上游：5’-GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG-3’(SEQ ID NO：13)

下游：5’-TGCGCTCCCTGGACCTGAGAATGACG-3’(SEQ ID NO：21)

上游：5’-CTCCCAGTACGGCCTGCCCACCTCC-3’(SEQ ID NO：22)

下游：5’-TCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTG-3’(SEQ ID NO：16)

PCR产物含有特异大小的目的片段，分别回收后采用上游引物进行测序验 证，筛选得到倍增有目的基因片段fkbG-K的阳性接合子，获得的基因倍增菌株 命名为CDD506-103。

4.发酵验证

发酵培养基和培养条件同实施例2.

发酵液离心分离菌体和上清，等体积乙酸乙酯二次萃取发酵液上清，收集 上层有机相；用丙酮浸泡菌体，离心收集有机相。合并有机相，旋蒸浓缩后进 行通过HPLC检测。HPLC检测条件：色谱柱Diamonsil C18(2)5u 250×4.6mm； A相(35％纯水)、B相(65％乙腈)、柱温55℃、流速1.0ml/min、UV检测波长215nm、 分析时间25min，17-19min左右出峰。

根据3个平行实验的HPLC检测结果，测定CDD506-102的发酵液中FK506 的产量，图9显示了对出发菌株ZJU506-01和基因倍增菌株CDD506-103发酵液的 HPLC分析结果，图9A为出发菌株ZJU506-01发酵液HPLC分析结果，图9B为倍 增了甲氧基丙二酰-ACP相关基因簇fkbG-K的突变株CDD506-103发酵液HPLC 分析结果，菌株CDD506-103发酵液中FK506的产量与对照相比较，提高了31％ 左右。

实施例5

四种菌株同时发酵比较

将出发菌株ZJU506-01，基因改造菌株CDD506-7G6，CDD506-102和 CDD506-103在同样的条件下培养和发酵条件下比较发酵FK506的产量。测定 第二天，第四天，第六天和第八天的产量，结果见图10。

产量最高的为CDD506-102，其次为CDD506-103，再次为CDD506-7G6， 最低的出发菌株，表明烯丙基丙二酰-CoA和甲氧基丙二酰-ACP经倍增的菌株 其FK506的产量都有一定程度的提高。与甲氧基丙二酰-ACP相比，烯丙基丙 二酰-CoA对FK506产量影响更大。

实施例6

构建导入质粒pSET152的菌株CDD506-101

质粒供体：在37℃，200rpm条件下，培养含有质粒pSET152的E.coli ET12567(pUZ8002)至OD₆₀₀＝0.5-0.6，离心收集50mL培养液中的大肠杆菌， 用25mL LB洗两次，重悬于2mL LB作为供体细胞。

质粒受体：在28℃，220rpm条件下，培养FK506产生菌ZJU506-01至对数 生长期后期，离心收集25mL培养液中的链霉菌，用25mL LB洗两次，重悬于2mL LB作为受体细胞。

接合转移：将受体细胞与供体细胞以1∶100的比例混合后，直接涂布在含 有10mM MgCl₂的AS-1平板上，30℃培养20hr后，采用无菌水轻轻洗涤平板表 面以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖含萘啶酮酸(终浓度为 50ng/μL)和阿泊拉霉素(终浓度为30ng/μL)的1mL无菌水。30℃培养5天以 上挑取接合子。

1.基因倍增菌株CDD506-101的表型筛选和基因型验证

挑取阿泊拉霉素抗性(Am^R)的接合子单菌落到抗性TSB液体培养基培养 传代，收集菌体提取总DNA，分别设计两对引物，通过PCR扩增验证基因整合 attB位点特异性和倍增片段正确性。

用于验证attL序列的引物设计如下：

上游：5’-CCCACAGCTGGAGGCCGTGG-3’(SEQ ID NO：7)

下游：5’-CAGGGCGAGCAATTCCGAGA-3’(SEQ ID NO：8)

用于验证attR序列的引物设计如下：

上游：5’-CAGAGCAGGATTCCCGTTGAG-3’(SEQ ID NO：9)

下游：5’-CCCTTCATCATGATGGACCAG-3’(SEQ ID NO：10)

PCR产物含有特异大小的目的片段，分别回收后采用上游引物进行测序验 证，筛选得到在attB位点插入质粒pSET 152的阳性接合子，获得的基因倍增菌株 命名为CDD506-101。

2.发酵验证

培养基成分同实施例2。

将基因倍增菌株CDD506-101和对照出发菌种ZJU506-01接种到摇瓶发酵， 发酵条件如下：AS-1斜面活化，30℃培养3天；种子瓶发酵，28℃，220rpm培 养24-28hr；发酵瓶发酵28℃220rpm培养6天。

发酵液离心分离菌体和上清，用等体积乙酸乙酯二次萃取发酵液上清，收 集上层有机相；用丙酮浸泡菌体，离心收集有机相。合并有机相，旋蒸浓缩后 进行通过HPLC检测。HPLC检测条件同实施例2。

根据3个平行实验的HPLC检测结果，测定CDD506-101的发酵液中FK506 的产量，图11为出发菌株ZJU506-01和菌株CDD506-101发酵液的HPLC分析结 果，图11A为出发菌株ZJU506-01的发酵HPLC结果，图11B为在attB位点导入质 粒pSET152的突变株CDD506-101的发酵HPLC结果，菌株CDD506-101发酵液中 FK506的产量与对照相比较略有降低，约出发菌株的95％左右。

菌种保藏

本发明的筑波链霉菌Streptomyces tsukubaensis CDD506-01，于2011年8月 24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京， 中国)，保藏号为CGMCC No：5177。

本发明的筑波链霉菌Streptomyces tsukubaensis CDD506-102，于2011年8月 24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京， 中国)，保藏号为CGMCC No：5176。

本发明的筑波链霉菌Streptomyces tsukubaensis CDD506-103，于2011年9月 06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京， 中国)，保藏号为CGMCC No：5221。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。