景洪哥纳香甲素衍生物及其在制药中的应用

摘要

提供通式（Ⅰ）所示的在C-1位，C-5位，C-7位，C-8位以及苯环不同官能团取代的景洪哥纳香衍生物，以其为活性成分的抗肿瘤药物组合物，它们的制备方法，以及在医药中尤其是在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

技术领域：

本发明属于药物技术领域，具体涉及一类景洪哥纳香甲素衍生物或其药学上 可接受的盐，其作为活性成分的治疗恶性肿瘤的药物组合物，其制备方法以及该 类化合物和药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一，然而多数肿瘤的治疗仍是困扰医 药工作者的一大难题。而天然产物在抗肿瘤方面有着无与伦比的优势，74％的上 市抗肿瘤药物都是天然产物，或从某个天然产物衍生而来。然而，直接来源于天 然产物的占6％，来源于天然产物经过结构修饰的衍生物占27％，根据天然药效 基团而合成的占5％，以及根据天然产物知识而设计的类天然产物占23％ （Altmann,K.H.Curr.Opin.Chem.Biol.2001,5，424）。可见，通过开展 活性天然化合物的结构修饰来发现抗肿瘤候选药物是一条捷径。

景洪哥纳香甲素(化合物1)最早是由昆明植物所李朝明教授等从云南产 番荔枝科植物景洪哥纳香(Goniothalamus cheliensisHu)叶的乙醇提取液中 分离得到的（李朝明等，云南植物研究，1998,20，102），后经上海药物所活性 筛选和动物实验评价，该化合物具有显著抗肿瘤活性，申请了专利并得到授权（李 朝明，胥彬，郑惠兰，唐卫东，穆青，孙汉董，吕瑜平，陶国达，景洪哥纳香甲 素及其制备方法和应用，公开号：CN1144221）。本研究组对该化合物开展了药学、 药理、毒理、代谢等研究。研究结果表明：景洪哥纳香甲素对小鼠的LD₅₀为100 mg/kg左右；对小鼠H22肝癌，有强大的抑瘤作用（20mg/kg,i.p.）,抑瘤率 达63％，强于阳性对照药VP-16；口服给药同样有效（200mg/kg）,对H22肝 癌的抑瘤率达59%。更重要的是这二种给药途径均没有明显的毒副作用，小鼠 体重，胸腺、脾脏重量，骨髓造血功能基本没有影响，这一点明显不同于传统的 抗肿瘤药物，初步机理研究显示，该化合物在浓度10μM时则能明显诱导肿瘤细 胞凋亡，并导致体外培养的肿瘤细胞阻滞在细胞周期的G1/G0期，很可能通过 新的作用机制发挥抗肿瘤作用。

尽管如此，景洪哥纳香甲素存在制剂不稳定、半衰期短、代谢不稳定等缺点 （郭娜，中国科学院昆明植物研究所硕士论文，2007；LiZhong et.Acta Pharmacol.Sin.2005,26，623），因此有必要对其进行结构修饰期望改善上述 缺陷。

目前，有三项关于景洪哥纳香甲素的专利报道，第一项是1997年李朝明研 究员关于景洪哥纳香甲素的制备和抗肿瘤活性的专利（李朝明，胥彬，郑惠兰， 唐卫东，穆青，孙汉董，吕瑜平，陶国达，景洪哥纳香甲素及其制备方法和应用， 公开号：CN1144221）；第二项和第三项是李法庆等人关于从景洪纳香叶中纯化 景洪哥纳香甲素的工艺专利（李法庆、刘东峰，一种纯化景洪哥纳香甲素的方法， 公开号：CN201110210627.6；李法庆、刘东峰，一种景洪哥纳香甲素的制备方法， 公开号：CN201110210623.8），而尚无关于景洪哥纳香甲素衍生物的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一类景洪哥纳香甲素衍生物，以此类化合物作为活性 成分的抗肿瘤的药物组合物，它们的制备方法，该化合物或其药物类似物或其药 物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

通式（Ⅰ）所示的景洪哥纳香甲素衍生物

其中,R₁选自氢、羟基、低级烷基取代的酰氧基、芳基苯基或萘基取代的酰 氧基、低级烷基取代的胺基、C3-C8环烷基取代的胺基、低级烷基取代的酰胺基、 C3-C8环烷基取代的酰胺基、芳基苯基或萘基取代的酰胺基、低级烷基取代的磺 酰胺基、C3-C8环烷基取代的磺酰胺基、芳基苯基或萘基取代的磺酰胺基，此位 置的手性可为R或是S；

R₂选自氢、羟基、低级烷基取代的酰氧基、芳基苯基或萘基取代的酰氧基、 低级烷基取代的胺基、C3-C8环烷基取代的胺基、低级烷基取代的酰胺基、C3-C8 环烷基取代的酰胺基、芳基苯基或萘基取代的酰胺基；

R₃选自氢、氟；

R₄选自卤素氟、氯、溴、碘，羟基、硝基、低级烷基取代的胺基、C3-C8环 烷基取代的胺基；

X₁选自氧、氮；

或R₁、R₂形成碳酸酯、丙酮叉、脲、硫脲。

文中提到的“烷基”是指含1-10个碳原子的直链或支链碳氢官能团，例如甲 基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊 基、正己基、异己基、3-甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、正庚 基、正辛基、正壬基、正癸基等，但并不仅限如上所列。

文中提到的“低级烷基”是指含1-4个碳原子的直链或支链碳氢官能团，例 如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等，但并不仅限如上 所列。

文中提到的“环烷基”是指含3-8个原子的环状官能团，例如环丙烷基、环 丁烷基、环戊烷基、环己烷基、环庚烷基、环辛烷基或者吡咯烷基、吗啡啉基、 哌啶基等，但并不仅限如上所列。

文中提到的“芳基”是指含5-10个原子的芳环官能团，如苯基、萘基、呋喃 基、噻唑基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、喹啉基、吲哚基等，但并不仅限如上所 列。

文中提到的“卤素”是指氟、氯、溴、碘。

更具体地，本发明提供了下述结构式所示的景洪哥纳香甲素衍生物2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13：

本发明上面所述的景洪哥纳香甲素衍生物的药学上可接受的盐，包括与无机 酸盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸；或者有机酸马来酸、富马酸、酒石酸、乳 酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸，己二酸，棕榈酸，单宁酸；或者碱金 属锂，钠、钾；碱土金属钙、镁；赖氨酸碱性氨基酸成的盐。

本发明还提供了抗肿瘤药物组合物，其中含有治疗有效量的上述的通式（Ⅰ） 所示的景洪哥纳香甲素衍生物和其药物上可接受的盐或药学上可接受的载体。

以及，抗肿瘤药物组合物，其中含有治疗有效量的任一化合物2-13和药学 上可接受的载体。

本发明同时提供了通式（Ⅰ）景洪哥纳香甲素衍生物的制备方法，主要用 BF₃·OEt₂制备C-8位氟代衍生物，用Et₃N/MeOH水解C-5位的乙酰基，用Pd(0) 催化的Tsuji-Trost反应制备C-5含氮衍生物，用KNO₃/发烟硝酸制备苯环硝基 取代衍生物。

本发明的通式（Ⅰ）所示的景洪哥纳香甲素衍生物或其药学上可接受的盐在 制备治疗肿瘤药物中的应用。

化合物2-13在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明所述的景洪哥纳香甲素衍生物其药理学上容许的盐，可以列举例如与 盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸等无机酸，或者马来酸、富马酸、酒石酸、乳 酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸，己二酸，棕榈酸，单宁酸等有机酸， 锂，钠、钾等碱金属，钙、镁等碱土金属，赖氨酸等碱性氨基酸成的盐。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。 该药物组合物含有0.1-99%，优选为0.5-90%的本发明化合物，其余为药物学上 可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体。

所述的药学上可接受的载体是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅料。本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。应用本 发明的药物可采用的剂型是惯用的盖伦给药剂型，例如：药膏、片剂、丸剂、栓 剂乳剂、输入液和注射液等。这些剂型按照众所周知的方法，使用传统的添加剂 和赋型剂制得。由此制得的药物根据需要可按局部、非肠道、口服等途径给药。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病 的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01-10mg/kg体重，优选0.1-5mg/kg 体重。可以一次或多次施用。

本发明的特点和优异性在于：本发明的一类景洪哥纳香甲素衍生物作为一类 新颖的高效抗肿瘤试剂，在制备抗肿瘤药物中有很好的应用前景。

附图说明：

图1为景洪哥纳香甲素衍生物反应流程图。

具体实施方式：

为了更好的理解本发明实质，下面将结合附图，用本发明的实施例、试验例、 制剂实施例来说明本发明的通式（Ⅰ）所示的景洪哥纳香甲素衍生物的制备方法 和药理作用结果，但本发明的技术方案并不局限于此，任何采用类似本发明技术 方案，不需要本领域普通技术人员创造性劳动即可做出的方案均认为属于本发明 技术方案范畴。

实施例1：

本发明的具体实验方法：

景洪哥纳香甲素是用于制备通式（Ⅰ）所示的化合物的唯一起始原料，该化 合物是从云南产番荔枝科植物景洪哥纳香(Goniothalamus cheliensis Hu)叶的 乙醇提取液中分离得到，景洪哥纳香甲素结构式如下：

景洪哥纳香(Goniothalamus cheliensis Hu)叶100公斤，粉碎后乙醇浸取， 浓缩后浸膏用硅胶柱层析，从石油醚-乙酸乙酯（7:3）段中得到粗品1公斤，然 后粗品通过中压柱层析分离，从70%甲醇-水部分得到粗产品，该粗品进一步用 氯仿重结晶即得到景洪哥纳香甲素（300克）。

下述的实施例中，通式（Ⅰ）所示的化合物可通过图1所示的反应流程从景 洪哥纳香甲素经过1至4步反应得到得到。景洪哥纳香甲素衍生物反应流程图中， 试剂与反应条件为a)BF₃·OEt₂,DCM,-78℃;b)Ac₂O,DMAP,Pyridine,RT;c) CH₂N₂,Et₂O,0℃;d)Et₃N,MeOH,RT;e)RCOCl,Et₃N,DMAP,DCM,-40℃;f) RNH₂,Pd(PPh₃)₄,PPh₃,DMF,80℃;g)CH₂N₂,Et₂O,0℃;h)KNO₃,HNO₃,0℃; i)DMP,TsOH,RT;

实施例2：

化合物2的制备：在氮气、-78℃气氛下，向景洪哥纳香甲素（548mg）的二 氯甲烷（12mL）溶液中，逐滴加入三氟化硼乙醚（202μL）的二氯甲烷（3mL） 溶液，反应半小时后，TLC检测反应完全，加入饱和碳酸氢钠溶液（6mL）淬灭反 应，加入水稀释，再用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，依次用水、饱和食盐水 溶液洗，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，柱层析（石油醚:乙酸乙酯=1.5:1）后得 化合物2（312mg，53%）。

ESI-MS在Shimadzu LCMS-2010EV质谱仪上测定；1D和2D NMR在Bruker AM-300及DRX-500核磁共振仪上测定，所用氘代试剂为Sigma Aldrich生产， TMS作为内标，δ单位为ppm，J单位为Hz。拌样用硅胶为100-200目，层析用 硅胶为300-400目以及制备薄层板（厚度0.4-0.5mm）均为烟台江友硅胶开发有 限公司生产；分析纯溶剂均是天津市化工有限公司产品。

化合物2的结构分析数据如下：¹H-NMR(CDCl₃,300MHz)δ_H7.30-7.34(m, 5H),7.03(dd,J=10.8Hz,4.5Hz,1H),6.15(d,J=10.2Hz,1H),5.36 (t,J=5.4Hz,5.4Hz,1H),4.89(t,J=4.8Hz,4.8Hz,1H),5.91(d, J=45.0Hz,1H),3.96(d,J=5.4Hz,1H),2.06(s,3H)；ESIMS(m/z) 317[M+Na]⁺;

实施例3

化合物3的制备：冰水浴条件下，向化合物2（30mg）、4-N，N-二甲基吡啶 （催化量）的吡啶（1mL）溶液中，逐滴加入醋酸酐（30μL），然后升至室温反 应1小时，TLC跟踪至反应完全后，加水（10mL）稀释，水相用二氯甲烷萃取 （50mL×3），合并有机相，依次用水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓 缩后硅胶柱层析（石油醚:乙酸乙酯=1:1），得化合物3（33mg,98%）。化合物3 的结构分析数据如下：¹H-NMR(CDCl₃,300MHZ):δ_H7.32-7.40(m,5H),7.01 (dd,J=9.6Hz,6.0Hz,1H),6.32(d,J=9.6Hz,1H),6.12(d,J=45 Hz,1H),5.50(dd,J=27.6Hz,10.2Hz,1H),5.35(dd,J=6.0Hz,2.7 Hz,1H),4.98(dd,J=10.2Hz,2.4Hz,1H),2.00(s,3H),1.82(s,3H); ESI-MS(m/z)337[M+H]⁺;

实施例4

化合物4的制备：在N₂气氛、冰水浴条件下，向化合物2（30mg）的乙醚（0.5 mL）溶液中，加入预先制备好的重氮甲烷的乙醚溶液（0.5mL），0.5h后TLC检 测反应完毕，加入适量醋酸淬灭反应，加入适量水分层，再用乙酸乙酯萃取，合 并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩后制备薄层层析，得化合物 4（18mg，53%）。化合物4的结构分析数据如下：¹H-NMR(300MHz,CDCl₃):δ_H7.39-7.47(m,5H),6.34(d,J=3.6Hz,1H),6.01(d,J=45.6Hz,1H), 5.14(s,1H),4.52(dd,J=9.3Hz，2.1Hz,1H),4.32(t,J=10.5Hz, 10.5Hz,1H),4.12(dd,J=14.1Hz,7.5Hz,1H)3.57(ddd,J=16.8Hz, 9.3Hz,3.9Hz,1H),3.24(dd,J=17.4Hz,14.1Hz,1H),2.12(s,3H), 1.25(m,2H);ESI-MS(m/z)351[M+H]⁺。

实施例5：

化合物的5的制备：在冰水浴条件下，向化合物2（29mg）的甲醇（1mL） 溶液中，逐滴加入三乙胺（12mg），令其在此温度下搅拌15分钟，TLC检测反应 完毕后，向其中加入盐酸水溶液（2N,0.1mL）淬灭反应，加水稀释，水相用乙酸 乙酯萃取三次，合并有机相，依次用水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩 后柱层析（石油醚:乙酸乙酯=1:1）得化合物5（24mg，94%）。化合物5，白色泡 沫状物，¹H-NMR(400MHz,MeOD)δ7.68(d,J=8Hz,1H),7.34-7.38(m, 4H),7.31(d,J=8Hz,1H),6.18(d,J=4Hz,1H),5.89(d,J=44Hz, 1H),5.49(s,1H),4.04(d,J=12Hz,1H),3.79(dd,J=28Hz,12Hz, 1H);ES I-MS(m/z)253[M+H]⁺.

实施例6：

化合物6和化合物7的制备：在冰水浴条件下，向化合物5（13mg）和4N， N-二甲基吡啶（2mg）的二氯甲烷（1mL）溶液中，依次逐滴加入三乙胺（11mg） 和苯甲酰氯（11mg），令其在此温度下搅拌2小时，TLC检测反应完毕后，向其 中加入饱和碳酸氢钠水溶液（0.2mL）淬灭反应，加水稀释，水相用乙酸乙酯萃 取三次，合并有机相，依次用水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层 析（石油醚:乙酸乙酯=2:1）得化合物6（10mg，57%）。

化合物6，白色泡沫状物，¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.92(d,J=8Hz, 2H),7.51(t,J=8Hz,4Hz,1H),7.28-7.38(m,7H),7.16(dd,J=12 Hz,4Hz,1H),6.28(d,J=8Hz,1H),6.02(d,J=44Hz,1H),5.70(d, J=4Hz,1H),4.81(dd,J=8Hz,4Hz,1H),4.06(dd,J=24Hz,8Hz, 1H);EI-MS(m/z)356[M]⁺.

化合物7，白色泡沫状物，¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.42(s,5H),7.13 (dd,J=8Hz,8Hz,1H),6.29(d,J=8Hz,1H),6.07(d,J=44Hz,1H), 5.44(s,1H),4.75(d,J=12Hz,1H),4.05(dd,J=28Hz,8Hz,1H), 1.17(s,9H);EI-MS(m/z)336[M]⁺.

实施例7：

化合物8、9、13的制备（以化合物9的制备为例）：在氩气氛下，称取三(二 亚苄基丙酮)二钯（3mg）及三苯基膦（2mg）溶于四氢呋喃（1mL）中，室温 下搅拌半小时，然后向其中加入化合物2（29mg）的四氢呋喃（0.5mL）溶液， 再逐滴加入吗啡啉（17mg）。TLC检测反应完毕后，向反应瓶中加入饱和氯化铵 水溶液，搅拌后用二氯甲烷多次萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗，然后用 无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析（氯仿:甲醇=30:1）,得化合物9（21mg，65%）。

化合物8和13的制备方法同上所述，不同的是

化合物8：无色膜状物,¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.29-7.48(m,5H), 6.93(dd,J=10.0Hz,5.6Hz,1H),6.31(d,J=10.0Hz,1H),4.90(d, J=3.2Hz,1H),4.65(dd,J=6.8Hz,5.2Hz,1H),4.12(dd,J=6.8 Hz,3.2Hz,1H),3.48(t,J=5.2,5.2Hz,1H),2.76(m,2H),2.53(dd, J=6.0Hz,4.8Hz,2H),2.39(d,J=5.6Hz,2H),1.92(s,1H),1.56 (m,4H);ESI-MS(m/z)317[M+H]⁺.

化合物9：白色粉末状固体，¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.39-7.47(m,5H), 6.95(dd,J=9.6Hz,5.4Hz,1H),6.35(d,J=9.9Hz,1H),4.99(d,J =1.5Hz,1H),4.70(dd,J=9.9Hz,4.5Hz,1H),4.12(d,J=3.9Hz, 1H),5.69(t,J=4.2Hz,1H),2.01(s,3H),1.97(dd,J=7.2Hz,1.2 Hz,3H);ESI-MS(m/z)322[M+H]⁺.

化合物13：无色膜状物,¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.35-7.42(m,5H), 7.32(dd,J=12Hz,4Hz,1H),6.35(d,J=4Hz,1H),6.24(d,J=8 Hz,1H),5.89(dd,J=44Hz,4Hz,1H),4.69(d,J=24Hz,4Hz,1H); EI-MS(m/z)250[M]⁺;

实施例8：

化合物10和化合物11的制备：在冰水浴条件下，向硝酸-发烟硝酸（0.5mL /0.5mL）的混合溶液中一次加入硝酸钾（101mg），令其在此温度下搅拌15 分钟，然后再向其中加入研碎的化合物2（29mg），继续反应15分钟后，加入 冰水稀释，水相用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaHCO₃水溶液、 水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析（石油醚:乙酸乙酯=1.5:1） 得化合物10（26mg，78%）和11（4.5mg，13%）。

化合物10，白色泡沫状物，¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.23(d,J=8Hz, 2H),7.55(d,J=8Hz,2H),7.07(d,J=8Hz,4Hz,1H),6.26(d,J=12 Hz,1H),6.09(d,J=48Hz,1H),5.41(d,J=4Hz,1H),4.69(d,J=12 Hz,1H),3.93(ddd,J=24Hz,8Hz,4Hz,1H),2.03(s,3H);ESI-MS(m/z):362 [M+Na]⁺.

化合物11，白色泡沫状物，¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.14(d,J=8Hz, 1H),7.84(d,J=8Hz,1H),7.73(t,J=8Hz,8Hz,1H),7.54(t,J= 8Hz,4Hz,1H),7.08(dd,J=12Hz,8Hz,1H),6.66(d,J=44Hz,1H), 6.27(d,J=8Hz,1H),5.48(dd,J=8Hz,4Hz,1H),4.75(dd,J=8 Hz,4Hz,1H),4.37(dd,J=24Hz,8Hz,1H),2.07(s,3H);ESIMS(m/z): 362[M+Na]⁺.

实施例9：

化合物12的制备：向化合物5（12mg）的2，2-二甲氧基丙烷（1mL）溶 液中，加入催化量的对甲苯磺酸，室温条件下反应2小时，TLC跟踪反应完全后， 减压蒸去溶剂，然后制备薄层层析分离（石油醚:乙酸乙酯=2:1），得化合 物12（10mg,68%）。

化合物12，无色膜状物，¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.35-7.40(m,5H), 6.80(dd,J=8Hz,12Hz,1H),6.23(d,J=8Hz,1H),5.80(d,J=48 Hz,1H),4.94(dd,J=8Hz,4Hz,1H),4.39(t,J=8Hz,4Hz,1H),4.05 (dd,J=24Hz,8Hz,1H),1.41(s,3H),1.18(s,3H).EI-MS(m/z):292 [M]⁺.

通过上述实施例制得的化合物2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 的结构式为：

以下通过试验例来进一步阐明本发明景洪哥纳香甲素衍生物的药理作用：

试验例1：

1、MTT法测定化合物的细胞毒活性：

根据本发明的产物对人早幼粒细胞性白血病细胞株（HL-60）、人肝癌细胞株 （SMMC-7721）、人肺癌细胞株（A-549）、人乳腺癌细胞株（SKBR-3）和人胰 腺癌细胞株（PANC-1）的细胞毒活性进行了筛选，其作用与顺铂进行了对比。

实验方法：本发明采用的是MTT法测定化合物的活性，其原理如下：MTT全 称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide， 是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在 细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲 臜的含量可以用酶标仪在570nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细 胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。

抑制率计算方法：抑制率(%)=(对照组OD值-用药OD值)/对照组OD值。

具体如下：

1.接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液（DMEM或者RMPI1640）配成单个 细胞悬液，以每孔10000-20000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，贴壁 细胞提前12小时接种培养。

2.加入待测化合物溶液（固定浓度40μM初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑 制在50%附近的化合物设5个浓度进入梯度复筛），每孔终体积20μL，每种处理 均设3个复孔。

3.显色：37摄氏度培养48小时后，每孔加MTT溶液20μL。继续孵育4小 时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液100μL以避免细胞丢失，每孔加20% 的SDS100μL，过夜孵育（温度37℃），使结晶物充分融解。

4.比色：选择595nm波长，酶联免疫检测仪（Bio-Rad680）读取各孔光吸 收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应 用两点法（Reed and Muench法）计算化合物的IC₅₀值。

2、从体外活性测试结果，可以看出：

实验结果：表1显示了半数致死浓度（IC₅₀）的数据比较，即对化合物1-13 的数据与顺铂的数据进行了比较。

表1景洪哥纳香甲素衍生物对5个肿瘤细胞系的IC₅₀

（HL-60^a:人白血病细胞株；SMMC-7721^b:人肝癌细胞株；A-549^c：人肺腺癌细胞 株；SK-BR-3^d:人乳腺癌细胞株；PANC-1^e:人胰腺癌细胞株）

制剂实施例1：

按实施例1－9的方法先制得景洪哥纳香甲素衍生物2－12，以及利用有机 酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成 的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

制剂实施例2：

按实施例1－9的方法先制得景洪哥纳香甲素衍生物2－12，以及利用有机 酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成 的盐,将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤， 分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

制剂实施例3：

按实施例1－9的方法先制得景洪哥纳香甲素衍生物2－12，以及利用有机 酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成 的盐，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

制剂实施例4：

按实施例1－9的方法先制得景洪哥纳香甲素衍生物2－12，以及利用有机 酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成 的盐，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

制剂实施例5：

按实施例1-9的方法先制得景洪哥纳香甲素衍生物2-12，以及利用有机 酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成 的盐，按常规口服液制法制成口服液。

制剂实施例6：

按实施例1－9的方法先制得景洪哥纳香甲素衍生物2－12，以及利用有机 酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成 的盐，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

制剂实施例7：

按实施例1－9的方法先制得景洪哥纳香甲素衍生物2－12，以及利用有机 酸（酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等）或无机酸（盐酸，硫酸，磷酸等）制成 的盐，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。