光敏染料锇配合物及其制备方法、癌变早期 DNA 氧化损伤快速检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明提供了一种光敏染料锇配合物及其制备方法、使用该光敏染料锇配合物进行癌变早期DNA氧化损伤快速检测的试剂盒及检测方法。光敏染料锇配合物具有结构通式：LL’L’’Os-Y

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种光敏染料锇配合物及其制备方法、使用该光敏染料锇配合物进行癌变早期DNA氧化损伤快速检测的试剂盒及检测方法。 

背景技术

癌症，一旦发现大多已处于晚期，令医者回天乏术，只有早期诊断才能防患于未然。化学反应、辐射以及单线态氧、超氧自由基和羟基自由基等需氧代谢的副产物都可导致DNA的氧化损伤，产生基因突变，诱发肿瘤、机体细胞的老化和某些退行性疾病。而DNA的四个碱基中鸟嘌呤G最容易被氧化，其主要氧化产物是8-氧-7,8-二氢脱氧鸟嘌呤（8-羟基鸟嘌呤,8-oxoG），它在体内形成后较为稳定，是DNA氧化损伤的重要生物标识物，对它的监测可以反映DNA受损程度，从而对癌变进行早期预警、预防。因此，快速、专一、可靠地检测DNA中的8-oxoG方法的研究，具有十分重要的理论和现实意义。 

目前DNA中8-oxoG的常规检测方法主要有：酶联免疫分析、高效液相色谱与电化学/质谱联用、毛细管气象色谱-质谱联用、凝胶电泳等。但这些方法都不具备专一性，并且需要先对DNA进行水解、酶解、衍生化、杂交等预处理，再借助专门的技术和仪器进行检测，分析时间较长，限制了它们在常规体检及门诊化验上的推广应用。 

三联吡啶锇（Os(bpy)₃³⁺，0.63V vs Ag/AgCl）是文献报道（R.C.Holmberg,M.T.Tierney,P.A.Ropp,E.E.Berg,M.W.Grinstaff,H.H.Thorp,Inorg.Chem.2003,42,6379；V.A.Szalai,M.J.Singer,H.H.Thorp,J.Am.Chem.Soc.2002,124,1625；P.A.Ropp,H.H.Thorp,Chem.Biol.1999,6,599；A.Mugweru,B.Wang,J.Rusling,Anal.Chem.2004,76,5557；L.Dennany,R.J.Forster,B.White,M.Smyth,J.F.Rusling,J.Am.Chem.Soc.2002,124,1625）中唯一可以专一氧化8-oxoG（0.5±0.1V vs Ag/AgCl）的化学试剂，目前它已在8-oxoG的电化学检测中得到了很好的应用，其原理如下所示。 

但该电化学检测方法需要先通过化学键将Os(bpy)₃²⁺探针分子接植到DNA链段的5’端，或者将探针分子和DNA层层相间地均匀涂敷到电极表面制成薄膜，重复包涂直到膜的均匀度和厚度达到要求为止，操作相当繁琐，不适合常规检测。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种癌变早期DNA氧化损伤快速检测试剂盒及检测方法，用于癌变早期的特异预警、预防。此外，本发明的另一个目的是提供一种新型的光敏染料锇配合物及其制备方法。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

1.一种光敏染料锇配合物，其特征在于，该光敏染料锇配合物具有下列结构通式Ⅰ： 

LL’L’’Os-Y₄                （Ⅰ） 

通式Ⅰ中，Y为卤素离子、ClO₄^-、BF₄^-、PF₆^-或OTs^-，L、L’各自独立地选自以下配体： 

其中，R₁和R₂各自独立地选自H、C_1-10烷基、CHO、COOH、NH₂、NO₂、CN、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、C_1-6卤代烷基、具有C_1-10烷基的吩噻嗪基或卤素， 

L’’为以下配体： 

其中，n为1-10的整数，R₃为H、C_1-10烷基、CHO、COOH、NH₂、NO₂、CN、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、C_1-6卤代烷基、具有C_1-10烷基的吩噻嗪基或卤素，R₄为C_1-10烷基。 

2、一种用于制备上述光敏染料锇配合物的方法，其特征在于，包括如下步骤： 

（1）制备以L、L’为配体的锇配合物中间体 

将各自独立地选自下述化合物的配体L、L’与以Y’为负离子的金属锇盐同时或依次进行 配位反应，得到通式LL’Os-Y’的锇配合物中间体，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂， 

其中，R₁和R₂各自独立地选自H、C_1-10烷基、CHO、COOH、NH₂、NO₂、CN、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、C_1-6卤代烷基、具有C_1-10烷基的吩噻嗪基或卤素； 

（2）制备中间体1 

将4-甲基-4’-R₃-联吡啶与二异丙胺锂（LDA）反应，反应温度为-78-50℃，反应时间为0.5-8h，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，反应结束后，不经分离，直接向体系中加入n=1-10的Br(CH₂)_nBr，得到中间体1，反应温度为-78-100℃，反应时间为1-48h，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂， 

其中，R₃为H、C_1-10烷基、CHO、COOH、NH₂、NO₂、CN、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、C_1-6卤代烷基、具有C_1-10烷基的吩噻嗪基或卤素； 

（3）制备中间体2 

将中间体1与锇配合物中间体LL’Os-Y’进行配位，得到中间体2，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂； 

（4）制备中间体3 

将中间体2在KI催化下与4，4’-二联吡啶反应，得到中间体3，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂； 

（5）制备以L、L’、L”为配体的锇配合物 

将中间体3与C_1-10碘代烷烃R₄I反应，得到通式LL’L”Os-Y’的锇配合物，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂； 

（6）制备目标产物 

将锇配合物LL’L”Os-Y’与含Y的钠盐、钾盐或铵盐按投料摩尔比1：1-10进行负离子置换反应，得到目标产物LL’L’’Os-Y₄，所述Y为卤素离子、ClO₄^-、BF₄^-、PF₆^-或OTs^-，反应温度为10-100℃，反应时间为5分钟-2h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、丙酮、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂；或者在步骤（3）～（5） 中分别进行以Y置换Y’的上述负离子置换反应，最终得到目标产物LL’L’’Os-Y₄。 

3、一种癌变早期DNA氧化损伤快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括A、B、D三种成分： 

（1）成分A：主体化合物八元瓜环； 

（2）成分B：作为客体化合物Ⅰ的上述光敏染料锇配合物； 

（3）成分D：纯水或磷酸盐、硼酸盐缓冲溶液。 

4、如上述3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还进一步包括： 

（4）成分C：作为客体化合物Ⅱ的荧光小分子，该荧光小分子具有下列结构通式II： 

其中，R₅和R₆各自独立地选自H、C_1-10烷基、CHO、COOH、NH₂、CN、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、C_1-6卤代烷基、具有C_1-10烷基的吩噻嗪基或卤素。 

5、一种癌变早期DNA氧化损伤快速检测方法，其特征在于，该方法使用上述3所述的试剂盒进行检测，具体包括如下步骤： 

（1）首先将成分A、B按照摩尔比1-5：1的比例溶解到成分D中，以成分B的浓度计，配成浓度为10μM-1mM的溶液，然后取适量的该溶液加入到透明容器中，惰性气体除氧，密封待用； 

（2）将待测样品加入到上述透明容器中，光照15-30分钟后，肉眼观察颜色变化或用光学仪器检测吸收光谱变化。 

6、一种癌变早期DNA氧化损伤快速检测方法，其特征在于，该方法使用上述4所述的试剂盒进行检测，具体包括如下步骤： 

（1）首先将成分A、B、C按照摩尔比1-5：1：1的比例溶解到成分D中，以成分B或C的浓度计，配成浓度为10μM-1mM的溶液，然后取适量的该溶液加入到透明容器中，惰性气体除氧，密封待用； 

（2）将待测样品加入到上述透明容器中，光照15-30分钟后，肉眼观察颜色变化或用光学仪器检测紫外可见吸收和/或荧光发射光谱变化。 

7、如上述5或6所述的检测方法，其特征在于，所述光照采用的光源为太阳光或能够激发所述光敏染料锇配合物的照明灯光。 

本发明的有益效果在于：开发了一种高效、快速、特异、可靠的8-oxoG检测试剂盒和8-oxoG专一性快速检测方法。该检测方法操作简便，并且操作人员不需要经过专业培训，仅需一滴血样，即使在不借助任何仪器设备的条件下，凭借肉眼，在可见光照射下即可专一、快速（15分钟左右）检测8-oxoG。该技术非常适合在常规体检和门诊化验时对癌变早期DNA氧化损伤进行初筛监测。此外，本发明的新化合物光敏染料锇配合物LL’L’’Os-Y₄在8-oxoG氧化损伤检测及相关领域中具有非常广泛的应用前景。 

附图说明

图1是在本发明试剂盒中加入8-oxoG样品时紫外可见吸收光谱随光照时间的延长产生的变化情况。 

图2是未在本发明试剂盒中加入8-oxoG样品时的紫外可见吸收光谱。 

图3是在本发明试剂盒中加入8-oxoG样品前后石英池颜色变化的实物照片（左：未加入8-oxoG样品，右：加入8-oxoG样品）。 

图4是在本发明试剂盒中加入8-oxoG样品时荧光发射光谱随光照时间的延长产生的变化情况。 

图5是未在本发明试剂盒中加入8-oxoG样品时的荧光发射光谱。 

图6是8-oxoG的DPV（Differential pulse voltammetry）曲线图。 

具体实施方式

<光敏染料锇配合物> 

本发明的新化合物光敏染料锇配合物具有下列结构通式Ⅰ： 

LL’L’’Os-Y₄                      （Ⅰ） 

通式Ⅰ中，Y为卤素离子、ClO₄^-、BF₄^-、PF₆^-或OTs^-，L、L’各自独立地选自以下配体： 

其中，R₁和R₂各自独立地选自H、C_1-10烷基、CHO、COOH、NH₂、NO₂、CN、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、C_1-6卤代烷基、具有C_1-10烷基的吩噻嗪基或卤素， 

L’’为以下配体： 

其中，n为1-10的整数，R₃为H、C_1-10烷基、CHO、COOH、NH₂、NO₂、CN、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、C_1-6卤代烷基、具有C_1-10烷基的吩噻嗪基或卤素，R₄为C_1-10烷基。 

除另有说明外，本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。例如，“C_1-6烷基”包括C₆烷基、C₅烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴、碘。 

本发明的一个具体实施方式中，优选地，R₁和R₂各自独立地选自H、C_1-8烷基、COOH、NH₂、OH或卤素；更优选地，R₁和R₂各自独立地选自H、C_1-6烷基或COOH；最优地，R₁和R₂各自独立地选自H或甲基。 

本发明的一个具体实施方式中，优选n为1-8的整数，最优选n为3-7的整数。 

本发明的一个具体实施方式中，优选地，R₃为H、C_1-8烷基、COOH、NH₂、OH或卤素；更优选地，R₃为H、C_1-6烷基或COOH；最优地，R₃为H或甲基。 

本发明的一个具体实施方式中，优选地，R₄为C_1-6烷基；更优选地，R₄为C_1-4烷基；最优地，R₄为甲基或乙基。 

本发明的一个具体实施方式中，Y优选卤素离子。 

本发明的一个具体实施方式中，优选地，R₅和R₆各自独立地选自H、C_1-8烷基、COOH、NH₂、OH或卤素；更优选地，R₅和R₆各自独立地选自H、C_1-6烷基、NH₂或OH；最优地，R₅和R₆各自独立地选自NH₂或OH。 

最优地，本发明所述的光敏染料锇配合物选自如下化合物： 

<光敏染料锇配合物的制备方法> 

用于制备上述光敏染料锇配合物的方法包括如下步骤： 

（1）制备以L、L’为配体的锇配合物中间体 

将各自独立地选自下述化合物的配体L、L’（R₁、R₂的含义同上）与以Y’为负离子的金属锇盐同时或依次进行配位反应，得到通式LL’Os-Y’的锇配合物中间体，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂。 

上述反应中，L、L’可相同，也可不同。当L、L’相同时，优选将反应用配体同时与金属锇盐反应，金属锇盐：配体的摩尔比优选控制在1：1.8～3的范围内。当L、L’不相同时，优选将反应用配体L、L’分别与金属锇盐反应，即金属锇盐先与配体L或L’反应后，再与配体L’或L反应，金属锇盐：配体L或L’的摩尔比优选控制在1：0.8～2的范围内。 

此外，以Y’为负离子的金属锇盐可以列举但不限定于(NH₄)₂[OsCl₆]、K₂OsCl₆、OsCl₃等。 

在一个优选实施方式中，反应温度为40-200℃，反应时间为1-20h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂。 

在一个更优选实施方式中，反应温度为80-200℃，反应时间为1-10h，反应溶剂选自乙二醇、乙腈、水、DMF以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂。 

在一个最优选实施方式中，反应温度为150-200℃，反应时间为1-5h，反应溶剂选自乙二醇、DMF及其混合溶剂。 

（2）制备中间体1 

将4-甲基-4’-R₃-联吡啶（R₃的含义同上）与二异丙胺锂（LDA）反应，反应温度为-78-50℃， 反应时间为0.5-8h，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，反应结束后，不经分离，直接向体系中加入n=1-10的Br(CH₂)_nBr，得到中间体1，反应温度为-78-100℃，反应时间为1-48h，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂。 

上述4-甲基-4’-R₃-联吡啶与二异丙胺锂的反应中，4-甲基-4’-R₃-联吡啶与二异丙胺锂的摩尔比（4-甲基-4’-R₃-联吡啶：二异丙胺锂）优选为1：0.8～3，更优选为1：0.8～2，特别优选为1：0.9～1.5。反应温度优选为-78～25℃，更优选为-78～0℃。反应时间优选为0.5～4h，更优选为1～2h。反应溶剂优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈，更优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃，特别优选二氯甲烷、四氢呋喃。 

此外，4-甲基-4’-R₃-联吡啶与Br(CH₂)_nBr的摩尔比（4-甲基-4’-R₃-联吡啶：Br(CH₂)_nBr）优选为1：0.8～10，更优选为1：0.8～5，特别优选为1：2～5。与Br(CH₂)_nBr的反应中，反应温度优选为-78～40℃，更优选为-78～30℃，特别优选为0～30℃。反应时间优选为1～12h，更优选为1～8h，特别优选为1～4h。反应溶剂优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈，更优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃，特别优选二氯甲烷、四氢呋喃。 

产物优选用二氯甲烷、氯仿等有机溶剂萃取分离后，粗产品进一步用硅胶柱色谱等分离精制。 

（3）制备中间体2 

将中间体1与锇配合物中间体LL’Os-Y’进行配位，得到中间体2，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂。 

上述反应中，LL’Os-Y’与中间体1的摩尔比（LL’Os-Y’：中间体1）优选为1：1～10，更优选为1：1～8，特别优选为1：1～5。反应温度优选为100～200℃，更优选为150～200℃。反应时间优选为1～12h，更优选为1.5～5h。反应溶剂优选乙二醇、乙腈、水、DMF，更优选乙二醇、乙腈、水，特别优选乙二醇。 

产物优选用硅胶柱色谱等分离精制，得到的产品可通过含Y的钠盐、钾盐、铵盐等进行Y离子置换（Y的含义同上）。 

（4）制备中间体3 

将中间体2在KI催化下与4，4’-二联吡啶反应，得到中间体3，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂。 

上述反应中，中间体2与4，4’-二联吡啶的摩尔比（中间体2：4，4’-二联吡啶）优选为1：1～10，更优选为1：1～6，特别优选为1：1～3。反应温度优选为优选为50～150℃，更优选为100～130℃。反应时间优选为3～15h，更优选为4～7h。反应溶剂优选乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF，更优选乙二醇、乙腈、DMF，特别优选乙腈、DMF。 

产物优选用硅胶柱色谱等分离精制，得到的产品可通过含Y的钠盐、钾盐、铵盐等进行Y离子置换。 

（5）制备以L、L’、L”为配体的锇配合物 

将中间体3与C_1-10碘代烷烃R₄I反应，得到通式LL’L”Os-Y’的锇配合物，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂。 

上述反应中，中间体3与R₄I的摩尔比（中间体3：R₄I）优选为1：1～10，更优选为1：2～8，特别优选为1：4～6。反应温度优选为50～150℃，更优选为80～130℃。反应时间优选为6～18h，特别优选为10～15h。反应溶剂优选乙二醇、乙腈、水、DMF，更优选乙二醇、乙腈、DMF，特别优选乙腈、DMF。 

产物优选用硅胶柱色谱等分离精制，得到的产品可通过含Y的钠盐、钾盐、铵盐等进行Y离子置换。 

（6）制备目标产物 

可通过两种方式得到目标产物LL’L’’Os-Y₄：（a）如上所述的那样，在步骤（3）～（5）中分别进行Y置换，最终得到目标产物LL’L’’Os-Y₄；（b）仅在步骤（5）中，对得到的锇配合物LL’L”Os-Y’进行Y置换，得到目标产物LL’L’’Os-Y₄。 

各产品与含Y的钠盐、钾盐或铵盐等一般按投料摩尔比（各产品：Y盐）1：1-10进行负离子置换反应。反应温度为10-100℃，优选为20～80℃，更优选为20～60℃，特别优选为20～40℃。反应时间为5分钟-2h，优选为5分钟～1.5h，更优选为8分钟～1.5h，特别优选为10分钟～1h。反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、丙酮、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，优选甲醇、乙醇、乙二醇、丙酮、水，更优选甲醇、丙酮、水，特别优选甲醇、丙酮。 

由本发明上述方法合成的光敏染料锇配合物，可以采用核磁、质谱来确定其结构。 

<癌变早期DNA氧化损伤快速检测试剂盒> 

该试剂盒包括A、B、D三种成分，其中成分B为上述光敏染料锇配合物， 

（1）成分A：主体化合物八元瓜环； 

（2）成分B：作为客体化合物Ⅰ的光敏染料锇配合物； 

（3）成分D：纯水或磷酸盐、硼酸盐缓冲溶液。 

此外，该试剂盒还优选进一步包括具有下列结构通式的荧光小分子作为客体化合物Ⅱ（成分C）： 

其中，R₅和R₆各自独立地选自H、C_1-10烷基、CHO、COOH、NH₂、CN、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、C_1-6卤代烷基、具有C_1-10烷基的吩噻嗪基或卤素。 

最优地，该客体化合物2选自如下化合物： 

<癌变早期DNA氧化损伤快速检测方法> 

该方法使用上述试剂盒进行检测，当试剂盒中包括A、B、D三种成分时，检测方法具体包括如下步骤： 

（1）首先将成分A、B按照摩尔比1-5：1的比例溶解到成分D中，以成分B的浓度计，配成浓度为10μM-1mM的溶液，然后取适量的（例如0.1-5mL）该溶液加入到透明容器（例如石英池）中，惰性气体除氧，密封待用； 

（2）将待测样品加入到上述透明容器中，光照15-30分钟后，肉眼观察颜色变化或用光学仪器检测紫外可见吸收光谱变化。 

试剂盒中包括A、B、C、D四种成分时，检测方法具体包括如下步骤： 

（1）首先将成分A、B、C按照摩尔比1-5：1：1的比例溶解到成分D中，以成分B或C的浓度计，配成浓度为10μM-1mM的溶液，然后取适量的（例如0.1-5mL）该溶液加入到透明容器（例如石英池）中，惰性气体除氧，密封待用； 

（2）将待测样品加入到上述透明容器中，光照15-30分钟后，肉眼观察颜色变化或用光学仪器检测紫外可见吸收光谱和/或荧光发射光谱变化。 

光照采用的光源包括太阳光、照明灯光等任意能够激发成分B（光敏染料锇配合物）的光源。光照后的检测既可以利用肉眼直接观察，也可以借助任意的紫外、荧光等光学检测仪器。 

<本发明的设计思想> 

使用三联吡啶锇对8-oxoG进行电化学检测的方法中，8-oxoG的专一氧化剂Os(bpy)₃³⁺是借助电化学由电极氧化而来的，鉴于三联吡啶锇是一种光敏染料，完全可以通过光照来激发Os(bpy)₃²⁺，使其跃迁到激发态^*Os(bpy)₃²⁺，激发态将电子传递给电子受体甲基紫晶（MV²⁺）后，得到氧化态Os(bpy)₃³⁺以及甲基紫晶自由基（MV^+·），其原理如下所示。 

但Os(bpy)₃²⁺与MV²⁺分子间的反应存在着电子传递速度较慢、效率低的缺陷，不利于实际应用。如果将两者如下述化合物（简记为：Os(bpy)₃²⁺-MV²⁺）所示那样连接起来（即锇配体中的两个配体（L、L’）均为2,2’-联吡啶，而另外一个配体（L”）具有2,2’-联吡啶和4,4’-联吡啶结构），将其转变为分子内相互作用，就可实现光照下Os(bpy)₃³⁺对MV²⁺高效专一的氧化，得到氧化性过渡态Os(bpy)₃³⁺-MV^+·。 

本发明正是基于上述技术思想进行光敏染料锇配合物结构设计的。经过本发明的发明人大量深入的探讨和研究，结果发现： 

（1）作为配体L、L’，当使用在2,2’-联吡啶环上引入适当取代基的衍生物时，或者配体L、L’之一或二者同时采用邻菲罗啉及其衍生物或DPPZ（dipyrido[3,2-a'2',3'-c]phenazine）时，可获得与仅使用联吡啶相当甚至更好的氧化效果。即作为配体L、L’，可各自独立地选自如下配体（R₁、R₂的含义如上）。 

研究表明，仅采用2,2’-联吡啶及其衍生物作为配体时，获得的光敏染料锇配合物与DNA双螺旋结构之间的作用力相对较弱；采用邻菲罗啉及其衍生物作为配体时，获得的光敏染料锇配合物与DNA双螺旋结构之间具有较强的相互作用，并且与RNA的作用力较弱；而采用DPPZ作为配体时，光敏染料锇配合物中的DPPZ可以扦插进入DNA双螺旋结构中，将光敏染料锇配合物与8-oxoG两者分子间的作用转变为DNA骨架上的“类分子内相互作用”，从而 更加高效地氧化DNA中的8-oxoG，取得更好的检测结果。此外，虽然2,2’-联吡啶及其衍生物的检测效果略差，但其合成相对简单，制备成本较低。 

（2）作为配体L”，可在2,2’-联吡啶和4,4’-联吡啶结构中引入适当取代基，即配体L”可选自如下配体（R₃、R₄的含义如上）。 

然而，以Os(bpy)₃²⁺-MV²⁺为例，在电势差的驱动下，MV^+·势必将电子迅速回传给Os(bpy)₃³⁺，整个体系又回复到初始状态Os(bpy)₃²⁺-MV²⁺。只有稳定住MV^+·上的电子，使其不能快速回传，才能得到专一氧化8-oxoG的氧化态Os(bpy)₃³⁺。而八元瓜环（Cucurbit[8]uril,CB[8]）对MV²⁺、MV^+·及它们的衍生物独特的自组装性能可以很好地解决这些问题，其原理如下。 

将Os(bpy)₃²⁺-MV²⁺与CB[8]在水溶液中自组装成1:1配位化合物（简记为：Os²⁺-MV²⁺/CB[8]），在光照下，Os²⁺-MV²⁺（λ_max=480nm）吸收光能跃迁到激发态*Os²⁺-MV²⁺，激发态通过分子内电子转移形成电荷分离过渡态Os³⁺-MV^+·，CB[8]与MV^+·的自组装将对该电荷分离过渡态起到一定的稳定作用，从而延缓电子的快速回传，使氧化性过渡态（Os³⁺-MV^+·）/CB[8]能够稳定存在于溶液中。加入待测样品后，如果样品中存在8-oxoG，（Os³⁺-MV^+·）/CB[8]将对其进行专一性氧化，生成还原态（Os²⁺-MV^+·）/CB[8]，此时两个分子的Os²⁺-MV^+·将与CB[8]进一步自组装，形成更加稳定的自由基二聚体自组装配位化合物（Os²⁺-MV^+·）₂/CB[8]，溶液呈现出该自由基二聚体的特征吸收（λ_max=560nm），发生裸眼可视的显著颜色改变。整个过程可示意如下。 

本发明正是基于上述技术思想进行癌变早期DNA氧化损伤快速检测试剂盒设计的。将八元瓜环作为主体化合物，将本发明的光敏染料锇配合物作为客体化合物（客体化合物Ⅰ），将这些化合物溶于纯水或磷酸盐、硼酸盐缓冲溶液中后，就可对含8-oxoG试样进行高效、快速、特异、可靠的检测。 

此外，鉴于上述过程中只有吸收光谱的变化，会在一定程度上对检测造成限制。考虑到荧光检测方法具有简捷、高效的特性，可以将恰当的荧光小分子如2，6-二萘酚（客体化合物Ⅱ）引入到体系中，使其与MV²⁺在电荷转移（charge transfer）作用下，共同进入到CB[8]空腔中进行自组装。当自由基二聚体在CB[8]空腔中形成后，荧光小分子从CB[8]中被“排挤”出来，游离到溶液中，使检测过程中同时产生颜色和荧光的改变，从而赋予该体系更加强大的实用性，进一步增强检测效果。其原理如下所示（荧光小分子以2，6-二萘酚为例）。 

通过使用本发明的这些试剂盒，可高效、快速、特异、可靠地检测8-oxoG，检测操作简便，并且操作人员不需要经过专业培训，仅需一滴血样，即使在不借助任何仪器设备的条件下，凭借肉眼，在可见光照射下即可专一、快速（15分钟左右）检测8-oxoG，非常适合在常规体检和门诊化验时对癌变早期DNA氧化损伤进行初筛监测。当然，本发明也可借助紫外分光光度仪、荧光仪等光学仪器进行8-oxoG的检测。 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。此外，作为DNA氧化损伤检测是本发明新化合物光敏染料锇配合物LL’L’’Os-Y₄的一种用途，但不能认定本发明的化合物仅用于DNA氧化损伤检测，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作DNA氧化损伤检测的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。本发明的特征和优点在参考附图和本发明的实施例之后将变得显而易见。 

实施例 

实施例1Os-C3-MV的合成 

（1）Os(bpy)₂Cl₂的合成： 

将(NH₄)₂[OsCl₆](1.0g，2.3mmol)和2,2’-联吡啶（0.72g，4.6mmol)溶于30ml乙二醇中，在氮气保护下磁力搅拌加热回流1h。反应混合液冷却到室温后，加入1M Na₂S₂O₄（60mL）在冰水浴中保持30min。过滤，得到的紫黑色沉淀物先后用水和乙醚充分洗涤，真空干燥，得黑色固体0.92g，产率70%。 

（2）中间体1的合成： 

将4-甲基-2，2′-二联吡啶（2.5g，13.5mmol）溶于干燥的THF（50mL）中，溶液置于冰水浴中，将新制的LDA（2.0mL二异丙胺，1.6M正丁基锂8.1mL，10mL THF）逐滴加入，溶液变为黑色，继续搅拌1h，取1，2-二溴乙烷（50mmol，4.3mL）迅速加入，然后把冰水浴撤去，室温下继续搅拌3h，加入100mL磷酸缓冲液（pH=7.0）停止反应。溶液用CH₂Cl₂（3×50mL）萃取，收集CH₂Cl₂层并用无水硫酸镁干燥，蒸干后得到淡黄色油状物。将粗产品用硅胶柱色谱分离，收集乙酸乙酯-二氯甲烷（1：9）的组分，蒸干后得到油状产品2.2g，收率61%。¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ2.16-2.23(m,2H,C₂H₂),2.82(t,2H,C₁H₂,J=7.2Hz),3.38(t,2H,C₃H₂,J=6.4Hz),7.11-7.12(m,1H,H₅),7.25-7.28(m,1H,H_5′),7.78(dt,1H,H4′, J=2.0,8.0Hz),8.26(s,1H,H₃),8.40(d,1H,H_3′,J=8.4Hz),8.56(d,1H,H₆,J=4.8Hz),8.66-8.67(m,1H,H_6′),API-MS,m/z:[M+H]⁺=277.0. 

（3）中间体2的合成： 

将中间体1（0.56g，2.02mmol）与Os(bpy)₂Cl₂（0.29g，0.51mmol）加入到5ml乙二醇溶剂中，氮气保护下，避光加热回流2h。冷却后用硅胶柱色谱分离，展开剂为CH₃COCH₃:H₂O:KNO₃饱和水溶液=20:1:1（V/V/V），收集墨绿色组分，蒸干展开剂，将其溶解于干燥的甲醇中，过滤除去不溶的硝酸钾，再将甲醇浓缩至约5mL，然后将其滴加至10ml饱和的NH₄PF₆水溶液中，室温下反应0.5h，置换NO₃^-反离子，将析出的沉淀过滤，水洗，干燥后得墨绿色产品0.49g（即中间体2），收率90%。 

（4）中间体3的合成： 

将中间体2（0.42g，0.39mmol）、4,4’-二联吡啶（1.22g，0.78mmol）与KI（0.13g，0.78mmol）溶于10mL干燥的DMF中，氮气下避光加热至115℃反应5h。蒸干溶剂后用硅胶柱色谱进行分离纯化，展开剂为CH₃COCH₃:H₂O:KNO₃饱和水溶液=10:1:1（V/V/V），收集极性较大的墨绿色组分，蒸干展开剂，将其溶解于干燥的甲醇中，过滤除去不溶的硝酸钾，再将甲醇浓缩至约5mL，然后将其滴加至10ml饱和的NH₄PF₆水溶液中，室温下反应0.5h，置换NO₃^-反离子，将析出的沉淀过滤，水洗，干燥后得墨绿色产品0.32g（即中间体3），收率64%。 

（5）Os-C3-MV的合成： 

将中间体3（0.30g，0.23mmol）、碘甲烷（1.63g，1.15mmol）溶于10ml干燥的乙腈中，氮气下避光加热回流过夜。蒸干溶剂后用硅胶柱色谱进行分离纯化，展开剂为CH₃COCH₃:H₂O:KNO₃饱和水溶液=5:1:1（V/V/V），收集墨绿色组分，蒸干展开剂，将其溶解于干燥的甲醇中，过滤除去不溶的硝酸钾，再将甲醇浓缩至约5mL，然后将其滴加至10ml饱和的NH₄PF₆水溶液中，室温下反应0.5h，置换NO₃^-反离子，将析出的沉淀过滤，水洗，干燥后得墨绿色目标产品0.31g，收率92%。¹H NMR（400MHz,Acetone-d₆）:δ2.60-2.69（m,2H,-CH₂-）,3.16（t,2H,-CH₂-）,4.76（s,3H,N⁺-CH₃）,5.06（t,2H,N⁺-CH₂-）,7.41（d,1H,bpy′-H）,7.43-7.48（m,5H,bpy-H and bpy′-H）,7.83（d,1H,bpy′-H）,7.91-8.02（m,10H,bpy-Hand bpy′-H）,8.67（s,1H,bpy′-H）,8.72（d,1H,bpy′-H）,8.77-8.82（m,8H,bpy-H and MV²⁺-H_β）,9.35-9.38（d,4H,MV²⁺-H_α）.HRMS（ESI,m/z）:[(M-4PF₆^-）]⁴⁺calculated for C₄₄H₄₀N₈Os218.0750,found218.0175. 

实施例2Os-C4-MV的合成 

该化合物的合成可参照上述Os-C3-MV的合成路线，除利用二溴丙烷代替二溴乙烷之外，其它同上。¹H NMR（400MHz,Acetone-d₆）:δ1.92-1.99（m,2H,-CH₂-）,2.27-2.33（m,2H,-CH₂-）,3.03（t,2H,-CH₂-,J=7.8Hz）,4.76（s,3H,N⁺-CH₃）,4.98（t,2H,N⁺-CH₂-,J=7.4Hz）,7.37（d,1H,bpy′-H,J=5.6Hz）,7.45-7.48（m,5H,bpy-H and bpy′-H）,7.81（d,1H,bpy′-H,J=5.9Hz）,7.92-8.03（m,10H,bpy-H and bpy′-H）,8.66（s,1H,bpy′-H）,8.75（d,1H,bpy′-H,J=8.1Hz）,8.78-8.82（m,8H,bpy-H and MV²⁺-H_β）,9.33（d,2H,MV²⁺-H_α,J=6.6Hz）,9.37（d,2H,MV²⁺-H_α,J=6.4Hz）.HRMS（ESI,m/z）:[(M-4PF₆^-）]⁴⁺calculated for C₄₅H₄₂N₈Os221.5781,found221.5775. 

实施例3Os-C7-MV的合成 

该化合物的合成参照上述Os-C3-MV的合成路线，除利用二溴己烷代替二溴乙烷之外，其它同上。¹H NMR（400MHz,Acetone-d₆）:δ1.43-1.51（m,6H,-CH₂-）,1.70-1.74（m,2H,-CH₂-）,2.17-2.22（m,2H,-CH₂-）,2.91（t,2H,-CH₂-,J=7.5Hz）,4.76（s,3H,N⁺-CH₃）,4.94（t,2H,N⁺-CH₂-,J=7.2Hz）,7.36（d,1H,bpy′-H,J=5.6Hz）,7.45-7.49（m,5H,bpy-H and bpy′-H）,7.81（d,1H,bpy′-H,J=5.9Hz）,7.94-8.05（m,10H,bpy-H and bpy′-H）,8.67（s,1H,bpy′-H）,8.78（d,1H,bpy′-H,J=8.1Hz）,8.80-8.83（m,8H,bpy-H and MV²⁺-H_β）,9.35（d,2H,MV²⁺-H_α,J=7.2Hz）,9.39（d,2H,MV²⁺-H_α,J=7.0Hz）.HRMS（ESI,m/z）:[(M-4PF₆^-）]⁴⁺calculated forC₄₈H₄₈N₈Os232.0899,found232.0895. 

实施例4紫外可见吸收光谱变化测定 

分别配制Os-C3-MV、8-羟基鸟嘌呤、2,6-二萘酚的水溶液（浓度分别为1.0×10^-3mol/L），CB[8]水溶液浓度配成8.0×10^-5mol/L。利用上述母液分别配制得到2mL待测溶液1（Os-C3-MV：2,6-二萘酚：CB[8]：8-羟基鸟嘌呤=摩尔比1:1:1:1，Os-C3-MV终浓度为0.05mM）以及待测溶液2（Os-C3-MV：2,6-二萘酚：CB[8]=摩尔比1:1:1，Os-C3-MV终浓度为0.05mM），将待测溶液1、2分别移入到自制的石英池中，超声处理约20min后通入氩气1h，利用氩气鼓泡法除去溶液中的氧气，迅速将石英池用封口膜密封。将装有待测溶液1的石英池放在150W氙灯下连续光照，分别在20min，40min，80min，120min，180min，240min时测定其紫外可见吸收光谱变化（紫外检测仪：Lambda35，美国Perkin Elmer公司）。为排除干扰，在光照过程中将石英池置于20℃左右的循环水浴中，防止光照引起整个石英池的温度升高。此外，不对装有待测溶液2的石英池进行光照而直接测定其紫外可见吸收光谱变化。待测溶液1、2的检测结果分别如图1、2所示。 

实施例5颜色变化观察 

与实施例4同样制备得到待测溶液1和2，然后与实施例4同样地进行除氧、密封处理后，将石英池放在氙灯下光照20分钟时用相机拍照，比较8-羟基鸟嘌呤样品加入前后的颜色变化。结果如图3所示。 

实施例6荧光发射光谱变化测定 

待测溶液1和2的制备、除氧、密封处理等操作同实施例4。将装有待测溶液1的石英池放在150W氙灯下连续光照，分别在30min，60min，90min，120min，150min，180min时测定其荧光发射光谱变化（荧光检测仪：Perkin-Elmer Ls55荧光分光光度计）。为排除干扰，在光照过程中将石英池置于20℃左右的循环水浴中，防止光照引起整个石英池的温度升高。此外，不对装有待测溶液2的石英池进行光照而直接测定其荧光发射光谱变化。待测溶液1、2的检测结果分别如图4、5所示。 

实施例78-羟基鸟嘌呤DPV曲线的测定 

配制8-羟基鸟嘌呤浓度为1.0×10^-2mol/L的水溶液，利用上述母液得到2mL8-羟基鸟嘌呤浓度为0.25mM的待测溶液（溶剂：pH=7.5的0.1M磷酸盐缓冲溶液），将该待测溶液移入到自制的石英池中，通入氩气30分钟以除去溶液中的氧气。采用三电极体系，工作电极为玻璃碳电极（直径3mm），参比电极为饱和甘汞电极（饱和KCl溶液），辅助电极为铂丝，在室温下测定其电化学性质。DPV曲线图在上海辰华仪器有限公司的CHI660D电化学工作站上测得，扫描速度为25mV.S^-1。