抑制CD36以控制肥胖和胰岛素敏感性

摘要

本申请涉及CD36拮抗剂的治疗用途，以减轻体重，抑制脂肪堆积和特别地抑制内脏脂肪堆积，改善胰岛素敏感性，降低血糖水平，治疗和预防代谢综合征、糖尿病前期和糖尿病，以及降低血浆胆固醇水平和减少肝脏脂肪沉积。CD36拮抗剂，包括SAB或其代谢产物，如RA和DSS，可用于这些目的。

说明书

优先权信息

本申请要求2010年6月1日递交的美国临时申请61/350,274的优先权，其全部内容并入本申请。

政府资助

本发明在由美国国立卫生研究院提供的政府资助下完成，基金号为NHLBIRO1HL082511、NHLBI3RO1HL082511-04S1、和NCRR UL1RR024996-03。美国政府对本发明享有一定权利。

发明背景

CD36是一种在多种类型的细胞和组织中表达的多功能受体，包括脑小胶质细胞和星形胶质细胞以及单核细胞/巨噬细胞和脂肪细胞。CD36识别多种配体，包括氧化的或修饰的低密度脂蛋白（oxLDL、mLDL）、长链脂肪酸（LCFA）、细菌细胞壁的脂质和脂蛋白组分、血小板反应素（TSP）-1和-2、纤维样β-淀粉样蛋白（fAβ）、和濒死细胞（详细的综述，参见Febbraio,M.,et al.,J Clin Invest108:785-791(2001)；Febbraio,M.,et al.,Int J Biochem Cell Biol39:2012-2030(2007)）。通过CD36的配体识别启动吞噬细胞如巨噬细胞的信号级联，导致配体（如脂质和脂肪酸）以及与配体连接的任何其他材料如细胞组分、细菌等的吞噬。通过表达CD36的巨噬细胞使oxLDL内化，这能够形成富含脂质的“泡沫细胞”和动脉粥样硬化斑块、促炎性反应、细胞因子释放、和/或产生活性氧物质，而通过表达CD36的小胶质细胞使β-淀粉样肽内化，这可能与阿尔茨海默氏症有关（Silverstein RL et al,Sci Signal2:re3(2010)）。CD36还在味蕾细胞和肠细胞中表达，已发现其与对高脂饮食的偏好有关（Laugerette F et al.,J Clin Invest115:3177-3184(2005)）。

因其表达广泛并且具有识别多种配体的能力，CD36参与了多种调控过程，包括炎症、血管生成、天然免疫、机体对外源性和天然底物的清除和脂质代谢。CD36表达/功能的增加与动脉粥样硬化、中风、和神经退行性疾病的病理学有关（Febbraio,M.,et al.,J Clin Invest108:785-791(2001)）。

尽管已知CD36在动脉粥样硬化损伤发展中的作用，但是其对体重和胰岛素敏感性的影响尚不清楚，部分原因是在代谢研究中使用的遗传模型不同，并且通过多种方法除去或降低这些模型中的CD36。常见的动脉粥样硬化和脂质疾病模型有机体是载脂蛋白E敲除（“ApoE KO”）小鼠，其缺乏从机体内清除极低密度脂蛋白颗粒的能力（Zhang et al.,Science258:468-471,1992）。饲喂正常饮食的ApoE KO小鼠就会出现高胆固醇血症和动脉粥样硬化斑块，虽然其在非高脂饮食下不会出现肥胖。在一项研究中，与饲喂高脂饮食的ApoE KO小鼠相比，饲喂高脂饮食的ApoE/CD36双敲除小鼠体重略有增加（Febbraio,M.,etal.,J Clin Invest105:1049-1056(2000)）；而另一项研究发现，ApoE KO小鼠和用CD36拮抗剂EP80317处理的ApoE KO小鼠的体重没有差异（Marleau,S.,et al.,Faseb J19:1869-1871(2005)）。

某些证据表明，CD36的表达和/或功能可能与糖尿病状况有关。但是，CD36在胰岛素抵抗中的作用存在较大争议。在受损的胰岛素敏感性与CD36介导的炎性应答调节之间存在潜在的相互作用。在糖尿病ob/ob小鼠中，作为对受损的胰岛素信号的应答，巨噬细胞CD36的表达增加，给予罗格列酮（一种胰岛素敏化剂）使得CD36在这些小鼠中的表达降低（Liang CP,et al.,J Clin Invest113:764-773(2004)）。此外，已确定葡萄糖与CD36表达之间存在关联（Sampson,M.J.,et al.,Atherosclerosis167:129-134(2003);Greenwalt,D.E.,et al.,JClin Invest9:1382-1388(1995);Susztak,K.,et al.,PLoS Med2,e45(2005)）。这些发现表明，CD36与胰岛素信号的受损有关。另一方面，表达突变CD36的SHR大鼠患有糖尿病（Aitman,T.J.,et al.,Nat Genet21:76-83(1999)）。表现出更多致动脉粥样硬化特性的CD36KO小鼠不患有糖尿病（Febbraio,M.,et al.,J Biol Chem274:19055-19062(1999)）。这些发现提示，CD36在调控碳水化合物/脂质代谢中具有显著的潜在复杂性，需要对其进行进一步的研究。

发明概述

本申请提出的前提是发现抑制CD36的治疗用途，以减轻体重，抑制脂肪堆积（特别是内脏脂肪堆积），改善胰岛素敏感性，降低血糖水平，治疗和预防代谢综合征、糖尿病前期和糖尿病，以及降低血浆胆固醇和脂质水平和减少肝脏脂肪沉积。CD36拮抗剂，包括SAB或其代谢产物，如RA和DSS，用于这些目的。

附图简要说明

图1A-1I。SAB长期治疗对生理应答的体内作用。（A），在溶剂（Veh）-和丹酚酸（SAB）治疗的小鼠中，饲喂高脂饮食8周后ApoE KO小鼠的体重变化。（B），在饲喂高脂饮食8周结束时的图。图中可见，SAB治疗的小鼠脂肪堆积显著降低。（C），空腹血液葡萄糖水平。（D），葡萄糖耐量检测。（E），曲线下面积（AUC）。（F），在溶剂和SAB治疗的小鼠中，腹腔巨噬细胞和脾脏中的CD36mRNA水平。（G），血管内的脂质含量检测结果。使用已公开的方法（Kim et al.,2008）对脂质进行提取和测定。（H），在高脂饮食4和8周后，血浆胆固醇水平的增加倍数。（I），溶剂和SAB治疗的小鼠肝脏的油红O染色。值得注意的是，在溶剂治疗的小鼠肝脏中观察到的大量的和较大的脂滴（深灰/黑色区域）在SAB治疗的小鼠的肝脏中显著减少。括号中的数字表示检测的动物数。

图2A-2B。SAB（100mg/kg）治疗8周的饲喂高脂饮食的ApoE KO小鼠的内脏脂肪重量。隔日皮下注射给予100mg/kg SAB或溶剂（veh）。n=8-10/组。（A），体格检查证实腹部脂肪减少。（B），SAB使内脏脂肪的重量从平均=81mg/动物减少至平均=32mg/动物。***，p<0.001。

图3。CD36缺陷减轻ApoE KO小鼠的体重。向六周龄的ApoE KO和ApoE/CD36双KO（DKO）小鼠饲喂8周高脂饮食，每周测定一次其体重增量。与带有野生型CD36的ApoEKO小鼠的体重增量（体重增量=41%）相比，CD36缺陷ApoE KO小鼠的体重增量（体重增量=34%）显著降低。

图4。CD36siRNA的效能。将20nM siRNA单独或组合转染至C8-D1A细胞中。24h后测定CD36mRNA的水平。N=4。将阴性对照调整至siRNA的量。与相应对照比较，**p<0.01，***p<0.001。

图5。SAB对ApoE KO小鼠的巨噬细胞中脂质堆积的作用。将原代巨噬细胞接种在4室玻片中，然后使用20μg/ml oxLDL和/或不同浓度的SAB孵育48h。（A-D）使用油红O对脂质染色并用显微镜检查；给出代表图。（A），仅溶剂；（B），25μM SAB治疗；（C），20μg/ml oxLDL；（D），20μg/ml oxLDL+25μM SAB。比例尺50μm；油红O染色更高放大倍数的显微图列于各图的右上角。（E-F），在原代巨噬细胞中对泡沫细胞进行定量检测。白色柱，仅使用溶剂（无oxLDL或SAB）孵育的巨噬细胞；黑色柱，使用20μg/ml oxLDL孵育的巨噬细胞；灰色柱，使用20μg/ml oxLDL加10、25或100μM SAB孵育（SAB的浓度列于各柱的下方）的巨噬细胞；（E）脂质堆积程度，以归一化的光密度强度计；（F），与使用溶剂孵育的对照巨噬细胞的平均面积比较的泡沫细胞的平均面积。将对照（溶剂治疗）平均单个巨噬细胞尺寸/面积归一化为1；脂质内化的结果使得经oxLDL处理的巨噬细胞显示出个体相对细胞面积增加（黑色柱）；SAB治疗（灰色柱）减少脂质内化和相对细胞尺寸/面积。n=3-6个细胞/组。与无oxLDL（0）比较，**，***p<0.01，0.001。

发明详述

在下述说明书中，引用附图作为其中的一部分，附图显示了利用能够实施的特定实施方式进行的说明。对这些实施方式进行了详细描述以使得本领域技术人员能够实施本发明，应理解在不脱离本发明主旨的前提下，还可以利用其他实施方式以及对其进行合乎逻辑的变换。因此，下述说明书中的示例性实施方式不具有限定作用，本发明的保护范围由所附的权利要求限定。

依据37C.F.R.§1.72（b）提供摘要，以使读者能够迅速明确技术公开的性质和要点。应理解提交的摘要不能用于解释或限定权利要求的范围或含义。

本发明意外地发现CD36拮抗剂能够减轻体重和改善胰岛素敏感性。下述实施例中描述的结果表明，给予SAB和高脂饮食的ApoE KO小鼠的体重明显减轻。除了对体重的影响以外，还观察到连续8周SAB治疗改善高脂血症ApoE KO的胰岛素敏感性。这些发现与在所需对象中抑制CD36以减轻体重、抑制脂肪堆积、降低血液葡萄糖水平、改善胰岛素敏感性、治疗或预防糖尿病前期和糖尿病，特别是II型糖尿病、降低血浆胆固醇水平和减少肝脏中脂肪沉积的治疗用途一致。SAB或其代谢产物，包括RA和DSS，以及其他CD36拮抗剂用于这些目的。

CD36拮抗剂。本申请中使用的“CD36拮抗剂”指能够抑制CD36活性或功能的分离的化合物。例如，能够作为CD36拮抗剂的化合物，其通过抑制、减少或消除CD36，或阻止CD36与其配体结合，或阻止CD36与其他蛋白发生相互作用而发挥作用，导致CD36介导的功能或信号抑制。

已知CD36识别并结合配体，包括氧化的或修饰的低密度脂蛋白（oxLDL，mLDL）；长链脂肪酸（LCFA）；细菌细胞壁的脂质和脂蛋白组分；血栓反应素（TSP）-1和-2以及带有含1型血栓反应素重复序列（TSR）肽结构域的分子；纤维状的β-淀粉样蛋白（fAβ）；濒死/凋亡细胞；糖化蛋白；以及磷脂。

还已知CD36与其他细胞蛋白发生相互作用，如其他膜蛋白和信号蛋白，例如调控下游信号事件的Src家族激酶和MAPK激酶；以及诱导细胞应答如细胞信号、配体和配体结合物质的内化或吞噬作用，如内源性底物（例如，oxLDL或感染/凋亡细胞）和外源性底物（例如，细菌或其他寄生虫）。

CD36通过配体结合和细胞相互作用介导一系列细胞和生理事件，包括炎症应答（例如，诱导细胞因子释放、抑制巨噬细胞迁移、活化NF-κB）、血管生成（例如，抑制促血管生成信号）、组织梗死、泡沫细胞形成（例如，促进泡沫细胞形成）、动脉粥样硬化（例如，促进动脉粥样硬化斑块形成）、肠脂肪酸吸收（例如，使表达CD36的肠细胞与脂肪酸结合并启动脂肪酸内化）、以及味觉偏好（例如，使味蕾细胞的CD36与脂质/脂肪酸结合并启动导致偏好高脂饮食的信号级联）。

还认为CD36活化促进了葡萄糖耐受不良；胰岛素抵抗；脂肪沉积形成，特别是内脏/腹部脂肪沉积；体重超重和体重增加；血浆胆固醇升高；以及巨噬细胞、主动脉和扩展血管的脂质含量增加。

如本申请所公开的，CD36拮抗剂包括，但不限于，小分子、适体、小干扰RNA分子、反义分子、或抗体。

在本发明的一个方面，CD36活性的拮抗剂是适体，其是与特定靶分子结合的寡聚核酸或肽（或多肽）分子。适体能够特别地合成，或使用本领域公知的多种筛选方法从库中选择，例如酵母双杂交系统。

在本发明的另一个方面，拮抗剂是抗体。例如，可以从Immunotech（Beckman Coulter,Fullerton,CA）获得CD36拮抗剂抗体克隆FA6–152。

在本发明的又一个方面，CD36拮抗剂是小干扰RNA（siRNA）分子。适宜的siRNA分子的例子包括在下述实施例中描述的那些。

在一个方面，CD36活性的拮抗剂是小分子。在本申请中，术语“小分子”指小有机化合物，如杂环、肽、糖类、类固醇等。小分子调节剂的分子量优选地低于约1500道尔顿、1000道尔顿、800道尔顿、或甚至低于约500道尔顿。可以对化合物进行修饰以增强其效能、稳定性、药物相容性等。

可以采用本领域公知的方法对来自合成或天然化合物文库的候选调节剂化合物进行筛选（参见中国专利号ZL200510072269.1，公开号：CN1868546，和中国专利申请号200910147634.9，其全部内容通过引用并入本文）。合成化合物文库能够从很多公司购买得到，包括Maybridge Chemical Co.（Trevillet,Cornwall,UK）、Comgenex（Princeton,N.J.）、Brandon Associates（Merrimack,N.H.）、和Microsource（New Milford,Conn.）。组合文库可以获得或能够利用公知的合成技术制备。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库来自例如Pan Laboratories（Bothell,Wash.）或MycoSearch（NC），或能够容易地通过本领域公知的方法生产。此外，可以通过常规的化学和生物化学技术对天然和合成的文库和化合物进行进一步修饰。

可以使用高通量筛选在体外鉴定能够高效拮抗CD36的化合物。通过体外检测分离CD36拮抗剂之后，可以进行实验以检测其在体内的效能。例如，已在高通量筛选中鉴定了先导化合物丹酚酸B（SAB；CAS登记号115939-25-8）是一种CD36拮抗剂。

SAB的结构为：

SAB能够代谢为迷迭香酸（RA；CAS登记号20283-92-5）和丹参素钠（DSS；CAS登记号67920-52-9）。

RA的结构为：

DSS的结构为：

在一些实施方式中，CD36活性的小分子拮抗剂可以选自SAB、其代谢产物RA和DSS（如上文所述）、及其衍生物。可以将SAB或其代谢产物衍生化，例如通过1-3步酶法形成酯、醚、肟、腙、羟胺、氨基甲酸酯、烷氧基酯、或碳酸酯，或形成PEG衍生物。

通过高通量筛选还鉴定了CD36的其他小分子拮抗剂，例如下面两个结构，3-肉桂酰吲哚和13戊基小檗碱（Xu,Y et al.,Anal Biochem400(2):207-212(2010)）：

小分子CD36拮抗剂的另一个例子是海沙瑞林，其是六胜肽生长激素释放肽（GHRP）家族中的一个成员，其具有生长激素释放活性，并且能够与CD36受体结合（Demers A et al.,Biochem J.382(Pt2):417-24(2004)）。海沙瑞林通过竞争结合位点阻断CD36介导的oxLDL摄取，因为海沙瑞林在CD36上的结合结构域与oxLDL在CD36上的结合结构域重叠（Demers A et al.,Biochem J.382(Pt2):417-24(2004)）。

针对清道夫受体的其他拮抗剂包括合成的经工程化改造的纳米阻断剂。在自组装成15-20nm的配体单元之后，这些纳米粒子阻断负责oxLDL摄取的主要清道夫受体，从而阻止泡沫细胞的形成（Chnari E,et al.,Biomacromolecules.7(6):1796-805(2006)）。

他汀类药物或抗氧化剂能够调节CD36的表达或其下游作用。某些他汀类药物和抗氧化剂α-生育酚能够减少CD36的表达和巨噬细胞对oxLDL的摄取（Venugopal SK,et al.,Atherosclerosis.175(2):213-20(2004)，Ricciarelli R,et al.,Circulation102:82–87(2000)，Fuhrman B,et al.,Atherosclerosis164(1):179-85(2002)）。

另一类抗氧化剂为SS肽。SS肽SS31已显示出能够使皮质内缺血诱导的GSH耗竭减弱和缩小梗死的尺寸。已在CD36敲除小鼠中观察到这种减弱作用消失，表明SS31的保护作用是通过下调CD36介导的通路产生的（Cho S,et al.,J Biol Chem.282(7):4634-42(2007)）。

用CD36拮抗剂治疗。如本申请所使用的，术语“治疗”指有效抑制CD36的活性以使需要治疗的疾病进展减慢、或症状缓解。例如，使用有效量的本申请公开的CD36拮抗剂治疗肥胖能够使体重减轻，或减小或减缓体重增量。类似地，使用有效量的CD36拮抗剂治疗脂肪过多，特别是腹部/内脏脂肪沉积或肝脏脂肪沉积，能够减少脂肪沉积或防止进一步的脂肪沉积。此外，使用有效量的CD36拮抗剂治疗胰岛素抵抗和血液葡萄糖水平升高能够使胰岛素敏感性改善，并降低血液葡萄糖水平。进一步地，使用有效量的CD36拮抗剂治疗糖尿病或糖尿病前期能够使糖尿病或糖尿病前期症状缓解。而且，使用有效量的CD36拮抗剂治疗代谢综合征能够使得代谢性疾病的症状得到改善。

对象：需要接受CD36拮抗剂治疗的对象可以是任何动物，包括人。通常对象被本领域技术人员诊断为患有疾病，如医生。

本申请描述的本发明的方法适用于任何种属、性别、年龄、种族人群、或基因型的对象。因此，术语患者包括男性和女性，以及其包括半成年人、过渡年龄的患者、和成年人。

人类种族人群的例子包括高加索人、亚洲人、西班牙人、非洲人、非洲裔美国人、美国土著、闪米特人、和太平洋岛民。本发明的方法可能更适于某些种族人群，如高加索人，特别是北欧人群，以及亚洲人群。

如上文所述的，术语对象还包括任何基因型或表型的患者，只要其需要本发明。此外，患者可以具有任何发色、眼镜颜色、皮肤颜色或其任何组合的基因型或表型。

术语对象包括任何身高、体重、或任何器官或身体部分的尺寸或形状的患者。

需要使用CD36拮抗剂治疗的对象的状况包括超重或肥胖。肥胖是一种医学状况，即身体中过量的脂肪堆积已经达到出现对健康不利作用的程度，导致预期寿命缩短和/或健康问题增多。体重指数（BMI）是一种比较体重和身高的检测指标，其将BMI在25kg/m²与30kg/m²之间的人定义为超重（肥胖前期），将BMI超过30kg/m²的人定义为肥胖。抑制CD36能够通过使体重减轻和抑制脂肪堆积治疗或预防肥胖和超重的状况。被抑制以免其堆积的脂肪可以是内脏脂肪、皮下脂肪、肌肉内脂肪、或其他脂肪。脂肪可以包括白脂肪组织和/或棕色脂肪组织。

需要本申请公开的疗法治疗的对象所患的状况还包括血液葡萄糖水平异常升高、对胰岛素不敏感或胰岛素抵抗、糖尿病前期或糖尿病、或代谢综合征的状况。

“糖尿病前期”是很多人在发展成2型糖尿病之前的状况。糖尿病前期患者的血液葡萄糖水平几乎总是高于正常值，但尚不足以被诊断为糖尿病。在美国有五千七百万人患有糖尿病前期。最新研究成果显示，糖尿病前期期间已对机体造成某些长期损害，特别是对心脏和循环系统。目前，医师可以通过三项检测确定患者是否为糖尿病前期：A1C检测、空腹血液葡萄糖检测（FPG）和/或口服葡萄糖耐量检测（OGTT）。通过这些检测测定的葡萄糖水平确定患者是否具有正常的代谢，或患者是否患有糖尿病前期或糖尿病。如果在FPG检测中患者的血液葡萄糖水平异常，则患者空腹血糖受损（IFG）；如果在OGTT检测中患者的血液葡萄糖水平异常，则患者葡萄糖耐量受损（IGT）。两者也称为糖尿病前期。在这些检测中“异常的”血液葡萄糖水平是本领域公知的，例如，可以将IGT定义为在FPG浓度<126mg/dl的条件下，在OGTT检测中口服75-g葡萄糖后，2-小时血浆葡萄糖浓度升高（在140至199mg/dl之间）（Nathan,D.M.,et al.,Diabetes Care30:753-759,2007）。

糖尿病（Diabetes mellitus），通常简称为糖尿病（diabetes），是一种患者血糖（葡萄糖）水平升高的状况，其可以因为身体无法产生足够的胰岛素，也可以因为身体细胞无法对产生的胰岛素作出适宜地应答。可以根据例如OGTT中2-小时血浆葡萄糖浓度高于或等于200mg/dl诊断糖尿病。胰岛素是一种在胰脏中产生的激素，其能够使身体细胞吸收葡萄糖以将其转化为能量。如果身体细胞无法吸收葡萄糖，则葡萄糖在血液中堆积（高血糖症），导致血管、神经、和其他并发症。有多种类型的糖尿病，最常见的为：

1型糖尿病：由于身体无法产生胰岛素，患者必须注射胰岛素。

2型糖尿病：由于胰岛素抵抗，是一种细胞无法适宜地利用胰岛素的状况，有时与绝对胰岛素缺乏结合。

妊娠期糖尿病：其为此前无糖尿病的妊娠妇女在妊娠期间具有较高的血液葡萄糖水平。其可以发展为2型DM。

检测胰岛素敏感性，和诊断胰岛素抵抗的方法均为本领域所公知的。胰岛素敏感性的常规检测方法包括高胰岛素-正糖钳技术、胰岛素敏感性检测（IST）、和胰岛素耐受检测（ITT）。这些检测测定血浆葡萄糖浓度对静脉输注胰岛素的应答。在BMI低于30kg/m²的一般人群中，指示胰岛素敏感性正常的血液葡萄糖浓度在0.026至0.085mmol/L/分钟的范围内，而在肥胖对象（BMI>30kg/m²;McAuley K.A.,et al.,Diabetes Care24:460-464(2001)）中，该浓度在0.012至0.017mmol/L/分钟的范围内。经修订的OGTT使用75-或100-g葡萄糖负荷，在2至4小时之间的不同时间间隔对葡萄糖和胰岛素进行检测，其还能够提供胰岛素敏感性信息；可以通过计算胰岛素曲线下面积（AUC_胰岛素）、AUC_葡萄糖/AUC_胰岛素的比率评估胰岛素敏感性，或通过观察2-小时葡萄糖/胰岛素（G/I）比率评估，当G/I比率<1.0时，提示存在胰岛素抵抗。

CD36拮抗剂还用于治疗或预防代谢综合征，其特征在于在人体内有一组代谢风险因素。风险因素包括：

·腹部肥胖（在腹部内和周围有过多的脂肪组织）

·导致动脉粥样硬化的血脂障碍（血液脂肪紊乱—甘油三酯升高、HDL胆固醇降低和LDL胆固醇升高—其使得在动脉壁上形成斑块）

·血压升高

·胰岛素抵抗或葡萄糖不耐受（机体不能适当地利用胰岛素或血糖）

·高凝状态（例如，血液中纤维蛋白原或纤维蛋白溶酶原活化剂抑制剂-1升高）

·促炎症状态（例如，血液中C-反应蛋白升高）。

患有代谢综合征的人罹患冠心病和与动脉壁上形成斑块相关的其他疾病（例如，中风和外周血管疾病）以及2型糖尿病的风险增加。代谢综合征在美国和世界范围内变得越来越普遍。据估计，有超过五千万的美国人具有提示代谢综合征的风险因素。

该综合征的主要潜在风险因素似乎为腹部肥胖和胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是一种全身性代谢疾病，患者的机体不能有效使用胰岛素。这就是代谢综合征也称为胰岛素抵抗综合征的原因。

与该综合征有关的其他状况包括缺乏运动、衰老、激素失衡和遗传易感性。某些人对胰岛素抵抗具有遗传易感性。后天因素，如身体过度肥胖和缺乏运动，能够在这些人中诱发胰岛素抵抗和代谢综合征。患有胰岛素抵抗的大多数人有腹部肥胖。胰岛素抵抗和代谢风险因素在分子水平上的生物学机制比较复杂，而且尚未被完全理解。

对于代谢综合征的诊断，尚无广泛接受的标准。经少许修改的，美国国家胆固醇教育计划（NCEP）成人治疗指引第三版（ATP III）中提出的标准是目前被推荐和广泛使用的。美国心脏协会以及国家心肺和血液学会推荐，当存在以下因素中的三个或以上时，就可鉴定为代谢综合征：

·腰围增加：

男性—等于或大于40英寸（102cm）

女性—等于或大于35英寸（88cm）

·甘油三酯升高：等于或高于150mg/dL

·HDL（“好的”）胆固醇降低：

男性—低于40mg/dL

女性—低于50mg/dL

·血压升高：等于或高于130/85mm Hg

·空腹血糖升高：等于或高于100mg/dL。

在另一个方面，本发明涉及使用含有CD36拮抗剂和药学上可接受载体（即，赋形剂）的药物组合物治疗糖尿病或肥胖，或预防脂肪堆积或促进体重减轻、或增加胰岛素敏感性。药物组合物也可以与一种或多种增加药物组合物的总体疗效和/或降低或避免其副作用的药物在一起制剂。

可以根据本领域公知的方法将活性成分和赋形剂制成组合物和剂型。如下文中详细描述的，可以将本发明的药物组合物特别地制成以固体或液体形式给药的制剂，包括适于下述的那些：（1）口服给药，例如，片剂、胶囊、粉剂、颗粒、舌用贴片、水性或非水性溶液或混悬液、灌药、或糖浆剂；（2）胃肠外给药，例如，通过皮下、肌内或静脉注射，例如无菌溶液或混悬液；（3）局部应用，例如，用于皮肤、肺部、或粘膜的乳膏、软膏或喷雾；或（4）阴道内或直肠内给药，例如，阴道栓、乳膏或泡沫；（5）舌下或颊内给药；（6）眼用给药；（7）经皮给药；或（8）鼻内给药。

短语“药学上可接受的”在本申请中指在合理的医学判断范围内，适于对象给药的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。如本申请所使用的，短语“药学上可接受的赋形剂”指在携带或转运对象给药的治疗组合物中涉及的药学上可接受的材料、组合物或载体，如液体或固体填充剂、稀释剂、载体、生产助剂（例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或锌、或硬脂酸）、溶剂或包封材料。各种赋形剂应是“可接受的”的含义为与制剂中的其他成分具有相容性且对对象是无害的。

能够作为药学上可接受赋形剂特别是液体剂型的材料的某些例子，包括糖（例如，乳糖、葡萄糖和蔗糖）；淀粉（例如，玉米和土豆淀粉）；纤维素及其衍生物（例如，羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素）；明胶；滑石粉；蜡；油（例如，花生油、棉籽油、红花油；芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油）；二醇类（例如，乙二醇、丙二醇、和聚乙二醇）；多元醇（例如，甘油、山梨醇、和甘露醇）；酯类（例如，油酸乙酯和月桂酸乙酯）；琼脂；缓冲剂；水；等渗盐水；pH缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他无毒的相容性物质。如有需要，还可以加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。其他适宜的赋形剂可以参见标准制药手册，例如“Remington's Pharmaceutical Sciences”,The Science and Practiceof Pharmacy,19th Ed.Mack Publishing Company,Easton,Pa.,(1995)。

稀释剂使固体药物组合物的体积增大，其能够使药物制剂便于患者和护理人员取用。固体药物组合物的稀释剂包括，例如，微晶纤维素（例如，）、微粉纤维素、乳糖、淀粉、预胶化淀粉、碳酸钙、硫酸钙、糖、葡萄糖结合剂、糊精、葡萄糖、二水合磷酸二氢钙、磷酸钙、高岭土、碳酸镁、氧化镁、麦芽糊精、甘露醇、聚甲基丙烯酸酯（例如，）、氯化钾、粉状纤维素、氯化钠、山梨醇和滑石粉。

压制成制剂的固体药物组合物，如片剂，可以包括赋形剂，其功能包括压制后辅助活性成分与其他赋形剂结合。固体药物组合物的粘合剂包括阿拉伯胶、海藻酸、卡波姆（例如，聚羧乙烯）、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、明胶、瓜尔豆胶、氢化植物油、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素（例如，）、羟丙基甲基纤维素（例如，）、液体葡萄糖、硅酸铝镁、麦芽糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮（例如，）、预胶化淀粉、海藻酸钠和淀粉。

可以通过向组合物中加入崩解剂增加压制固体药物组合物在对象胃内的溶出速率。崩解剂包括海藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠（例如，）、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮（例如，）、瓜尔豆胶、硅酸铝镁、甲基纤维素、微晶纤维素、波拉克林钾、粉状纤维素、预胶化淀粉、海藻酸钠、淀粉羟乙酸钠（例如，）和淀粉。

可以加入助流剂以改善非压制固体组合物的流动性和改善剂量的准确度。具有助流剂功能的赋形剂包括胶体二氧化硅、三硅酸镁、粉状纤维素、淀粉、滑石粉和磷酸钙。

当剂型如片剂是由粉状组合物压制而成时，组合物被冲头和冲模压制。某些赋形剂和活性成分具有粘附在冲头和冲模表面的趋势，这可能导致产品具有点蚀和其他表面不平整。可以在组合物中加入润滑剂以减少粘附并使得产品易于脱模。润滑剂包括，例如，硬脂酸镁、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯、氢化蓖麻油、氢化植物油、矿物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂酰硫酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、滑石粉、和硬脂酸锌。

在本发明的液体药物组合物中，将细菌腺苷酸环化酶调节剂和任何其他固体赋形剂溶解或混悬在液体载体如水、注射用水、植物油、乙醇、聚乙二醇、丙二醇或甘油中。

液体药物组合物可以含有乳化剂，以使得在液体载体中不溶的活性成分或其他赋形剂在组合物中均匀分散。能够在本发明的液体组合物中使用的乳化剂包括，例如，明胶、卵黄、酪蛋白、胆固醇、阿拉伯胶、西黄耆胶、角叉菜胶、果胶、甲基纤维素、卡波姆、十八醇十六醇混合物以及十六醇。

本发明的液体药物组合物中还可以含有增粘剂，以改善产品的口感和/或覆盖胃肠道里层。此类试剂包括阿拉伯胶、海藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钙或钠、十八醇十六醇混合物、甲基纤维素、乙基纤维素、明胶、瓜尔豆胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚乙烯醇、聚维酮、碳酸丙烯酯、丙二醇海藻酸酯、海藻酸钠、羟乙基淀粉钠、淀粉、西黄耆胶、和黄原胶。

可以加入甜味剂，如山梨醇、糖精、糖精钠、蔗糖、阿斯巴甜、果糖、甘露醇和转化糖，以改善味道。矫味剂和风味增强剂可以使制剂对患者而言更加可口。可以包括在本发明组合物中的供药物产品使用的常用矫味剂和风味增强剂包括，例如，麦芽酚、香草醛、乙基香草醛、薄荷醇、柠檬酸、富马酸、乙基麦芽酚和酒石酸。

可以加入摄食安全水平的防腐剂和螯合剂，如乙醇、苯甲酸钠、丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚和乙二胺四乙酸以改善贮存稳定性。

根据本发明，液体组合物还可以含有缓冲剂，如葡萄糖酸、乳酸、柠檬酸或醋酸、葡萄糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或醋酸钠。制剂专家根据其经验以及本领域标准规程和工具书很容易就能选择赋形剂及其用量。

还可以使用任何药学上可接受的着色剂对固体和液体组合物进行染色，以改善其外观和/或便于患者区分产品和单位剂量水平。

本发明的剂型可以是含有组合物的胶囊，例如在硬壳或软壳中的粉状或颗粒状的本发明的固体组合物。壳体可以由明胶制成，并且任选地含有增塑剂，如甘油和山梨醇，以及遮光剂或着色剂。

用于压片或填充胶囊的组合物可以由湿法制粒制备。在湿法制粒过程中，将粉状活性成分和赋形剂中的某些或全部混合，然后加入液体，一般为水，进一步混合，其将粉末制成颗粒。将颗粒过筛和/或磨碎、干燥，然后再过筛和/或磨碎以获得所需的粒径。然后将颗粒压片，或在压片前加入其他赋形剂，如助流剂和/或润滑剂。

可以通过常规的干混合法制备压片组合物。例如，可以将活性剂和赋形剂的混合组合物压制成预压片或薄片，然后再粉碎成压紧的颗粒。随后，将压紧的颗粒压制成片剂。

作为干法制粒的替代方案，可以通过直接压片技术将混合组合物直接压制成压紧的剂型。直接压片法能够生产出不含颗粒的更均匀的片剂。特别适于直接压片法压片的赋形剂包括微晶纤维素、喷雾干燥乳糖、二水合磷酸二氢钙和胶体二氧化硅。在直接压片法中这些和其他赋形剂的适宜使用是在对特定制剂进行直接压片法压片中具有经验和技能的本领域技术人员公知的。

胶囊填充可以包括参考在压片中描述的任何前述混合物和颗粒，除了它们不适于最终压片步骤之外。

在另一个方面，本发明涉及通过对象给药上文所描述的CD36抑制组合物以治疗糖尿病或肥胖、或预防脂肪堆积或促进体重减轻、或增加胰岛素敏感性的方法。尽管其他动物也能够获益，包括哺乳动物，如犬、猫、猴、奶牛等，但本文中考虑的对象主要是人。

在一个实施方式中，通过此类方式给予对象组合物，即组合物不是特定靶向至机体的特定组织或细胞。在前述实施方式中，CD36通常在对象中被抑制。在另一个实施方式中，通过此类方式给予对象组合物，即组合物选择性地靶向至特定组织或细胞。可以选择性地将组合物靶向至对象的特定组织或细胞，通过例如以在靶组织或细胞位点的局部方式给予组合物（例如，通过注射至靶组织或细胞）。在一个可选的实施方式中，可以通过非局部或局部的组合物给药，以及将选择性靶向至对象的一些组织或一些细胞的选择性靶向剂包含在所述组合物中（例如，通过抗体靶向剂），以选择性地将组合物靶向至对象的特定组织或细胞。接受治疗的组织可以是，例如肝脏、骨髓、脾脏、皮肤、肺脏、神经（特别是外周神经系统）、和脑组织。治疗的最终结果是对象的全部或经特定治疗的组织的CD36抑制。

如上文所描述的，以及视组合物的制剂和拟治疗的疾病类型而定，组合物可以口服给药（例如，吞咽或肠内吸收的片剂、胶囊、粉剂、颗粒、糊剂、溶液、混悬液、灌药、或糖浆剂）；胃肠外给药，通过例如皮下、肌内或静脉注射给药；局部给药，通过例如作为乳膏、软膏或喷雾剂在皮肤、内部器官（例如，肺脏）、或粘膜使用；或作为栓剂、乳膏或泡沫使用，或舌下给药；眼用、经皮、或鼻内给药。

为了清楚地了解CD36抑制的治疗作用，给予治疗有效量的CD36-抑制组合物。如本领域所公知的，活性成分的剂量明显依赖于此类因素如给药方法、对象的体型、和潜在的副作用。在不同实施方式中，依赖于这些和其他因素，CD36-抑制组合物中活性成分的适宜剂量可以精确地，至少，或不超过，例如，1mg、10mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1200mg、或1500mg、或以任何前述示例性剂量为边界的范围内的剂量。进一步地在上述实施方式中，依赖于这些和其他因素，通过任何适宜的方案给予指定量的组合物，例如在总治疗时间为一天、两天、三天、四天、或五天，以及至多例如一周、两周、三周、或四周时间内每日给予一次、两次、或三次。可选地，或此外，给予组合物直至CD36的抑制达到所需量。CD36抑制的所需水平可以是医疗领域的专家认为应达到的任何水平。

实施例

通过下述实施例对本说明书进行了进一步说明，不应将其解释为以任何方式的限定。所有引用的参考文献（包括本申请中引用的文献、授权专利、公开的专利申请）的内容均特此通过引用明确地并入。

实施例1

接受SAB长期治疗的高脂血症ApoE KO（AKO）小鼠能够减少体重增量和内脏脂肪堆积。ApoE KO小鼠自发地表现为高脂血症表型。向ApoE KO小鼠饲喂8周高脂饮食，使其血浆胆固醇水平增加约5倍（Kim et al.,2008）。向六周龄雄性ApoE KO（HL AKO）小鼠饲喂高脂饮食8周，同时给予或不给予SAB（100mg/kg，隔日皮下给药）。每周检测一次体重的结果显示，SAB治疗显著降低了体重增加的速率。在治疗第3周时，各组间的体重差异比较明显（图1A）。与接受溶剂治疗的ApoE KO小鼠相比，接受SAB治疗的小鼠偏瘦17%（图1A），并且腹部脂肪堆积极少或没有（图1B）。此外，SAB治疗显著降低了血浆胆固醇水平（图1H）和肝脏脂肪沉积（图1I）。因此，SAB减轻体重和脂肪堆积，特别是内脏/腹部脂肪堆积和肝脏脂肪沉积，并且其还能够降低血浆胆固醇。这提示CD36拮抗剂如SAB在治疗和预防代谢综合征以及其他代谢疾病中可以是有益的。

实施例2

SAB治疗改善胰岛素的敏感性。在给药第0周、第4周、和第8周，接受SAB治疗和对照小鼠的空腹血液葡萄糖水平接近（图1C）。然而，当对小鼠进行葡萄糖耐受检测（腹腔注射1.5mg葡萄糖/kg）时，与接受溶剂治疗的小鼠相比（攻击后45分钟，血液葡萄糖的初始峰减少低于10%；图1D），接受SAB治疗的小鼠的血液葡萄糖清除更快（攻击后45分钟，初始血液葡萄糖峰减少75%）。该葡萄糖耐受检测的定量结果显示，在接受SAB治疗的小鼠中AUC_葡萄糖（葡萄糖曲线下面积）显著降低（图1E），这表明SAB治疗显著改善胰岛素的敏感性并且在血液葡萄糖升高后辅助血液葡萄糖水平的降低。这提示CD36抑制剂如SAB治疗对治疗和预防糖尿病、糖尿病前期、以及以血液胰岛素和/或葡萄糖水平为特征的其他疾病可以是有益的。

实施例3

SAB治疗降低腹腔巨噬细胞中CD36的表达。由于CD36在单核细胞和巨噬细胞中表达，因而比较接受溶剂和SAB治疗的小鼠的外周巨噬细胞和脾脏中CD36的基因表达，脾脏是作为单核细胞储库的外周器官。在接受SAB治疗的小鼠的腹腔和脾脏巨噬细胞中，CD36mRNA水平均降低（图1F）。因为配体的存在以随饲喂量增加的方式增加CD36的基因表达，所以假设SAB的作用为拮抗配体-受体的相互作用，导致CD36的基因表达减少。对主动脉和扩展血管中脂质含量的初步分析也显示了在接受SAB治疗的小鼠的血管中出现脂质含量降低的趋势（图1G）。因此，CD36拮抗剂如SAB具有减弱CD36功能的作用，使其具有如降低血浆脂质和胆固醇水平的治疗作用。

实施例4

向接受溶剂或SAB（100mg/kg）治疗8周的饲喂高酯饮食的ApoE KO小鼠的内脏脂肪重量。隔日皮下注射给予100mg/kg SAB或溶剂（veh）。n=8-10只小鼠/组，***，p<0.001。体格检查证实了腹部脂肪减少（图2A）。SAB使内脏脂肪重量减少60%（接受SAB治疗的小鼠平均内脏脂肪重量为32mg，而对照的平均内脏脂肪重量为81mg；图2B）。其进一步证实了CD36拮抗接能够减少脂肪堆积，特别是内脏脂肪堆积。

实施例5

CD36缺乏使ApoE KO小鼠的体重减轻。连续8周向六周龄的ApoE KO和ApoE/CD36双KO（DKO）小鼠饲喂高酯饮食，每周测定其体重增量。缺乏CD36的ApoE KO小鼠的体重增量显著降低（约14%）（图3）。这些数据与图1A显示的丹酚酸B（SAB）药理学抑制的结果一致。这提供了更多的证据证明CD36拮抗剂在食用高脂饮食的个体中用于减轻体重以及缓解与脂肪过量和超重相关的疾病，如代谢综合征。

实施例6

使用RNAi技术抑制CD36。将20nM siRNA单独或联合转染至C8-D1A细胞。24h后检测CD36mRNA的水平。N=4。以siRNA的量调整阴性对照。与相应的对照比较，**p<0.01，***p<0.001。研究结果显示针对CD36siRNA的所有siRNA[MSS202775（来自外显子9）、MSS202776（外显子7）、MSS202777（外显子11）]均能够显著降低CD36的基因表达，其中siRNA75最有效（图4）。这些结果进一步证明，CD36拮抗在多个水平均有效，包括直接抑制和阻止CD36表达。

这些实验中使用的siRNA为：

siRNA No.MSS202775:

5′-UAG CUU GGC CAA UAG GAC AAA UUC C-3′(SEQ ID NO:1);

5′-GGA AUU UGU CCU AUU GGC CAA GCU A-3′(SEQ ID NO:2)。

siRNA No.MSS202776:

5'-CUU GUU UGG AAC ACA GAA GAC UUG G-3'(SEQ ID NO:3);

5'-CCA AGU CUU CUA UGU UCC AAA CAA G-3'(SEQ ID NO:4)。

siRNA No.MSS202777:

5'-ACA CCA UAA GAU GUA CAG UUA UUG G-3'(SEQ ID NO:5);

5'-CCA AUA ACU GUA CAU CUU AUG GUG U-3'(SEQ ID NO:6)。

实施例7

SAB减少ApoE KO小鼠巨噬细胞中的脂质堆积。从ApoE KO小鼠中分离原代巨噬细胞，使用氧化的低密度脂蛋白（oxLDL）和/或不同浓度的SAB孵育48h，然后通过染色检测脂质堆积情况。使用oxLDL孵育的巨噬细胞显示出了广泛的染色，其与显著的脂质堆积一致（图5C）。而相反的是，经oxLDL和SAB处理的巨噬细胞的脂质堆积显著降低（图5D）。因此，CD36拮抗剂能够阻止富含脂质环境中的细胞的脂肪和脂质堆积。

实施例8

SAB减少脂质堆积和泡沫细胞形成。来自ApoE KO小鼠的原代巨噬细胞显示出较低的光密度强度（IOD），这与细胞面积较小一致（图5E和5F，白色柱）。将这些巨噬细胞与oxLDL孵育后，结果使得IOD增加，这与广泛的脂质堆积导致的相对细胞面积增加一致（图5E和5F，黑色柱）。然而，与仅使用oxLDL处理的巨噬细胞相比，与oxLDL和10、25或100μM SAB孵育的巨噬细胞的IOD和相对细胞面积显著降低（图5E和5F，灰色柱；SAB的浓度列于各柱下方）。这表明CD36拮抗剂减少细胞脂质内化，细胞脂质内化是泡沫细胞形成和动脉粥样硬化发展的标记物。