一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法

摘要

本发明提供一种小鼠异基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病（cGVHD）模型的建立方法，通过制备异基因CB6F1（H-2

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方 法。建立具有模拟临床异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病特点的疾病模型，可 为慢性移植物抗宿主病的发生机制和诊治方法提供研究平台。

背景技术

慢性移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植后的主要并发症和死亡原因，成为影响 患者生活质量和长期生存的关键因素。进一步明确cGVHD发生机制，研究积极有效的治 疗方法，降低或减轻其发生及病程，具有重要的实际意义。因此，cGVHD动物模型的建 立，是转化医学研究的重要基础。目前大部分cGVHD动物模型建立在H-2抗原半相合或 微小不合的小鼠间移植，主要表现为狼疮样（SLE-cGVHD），受累靶器官主要为皮肤、 肾脏、肝脏和小肠；及硬皮样（Scl-cGVHD），受累靶器官主要为皮肤。肺部cGVHD的 模型曾有个别报道，因需要在预处理过程中使用环磷酰胺，考虑到药物本身对肺部的损害 作用，该模型还有待进一步优化。本研究使用H-2抗原半相合小鼠，供鼠、受鼠均来源 于国内常用的小鼠品系，方法简便；并且本研究中供受鼠配对模式与国内外相似研究报道 不同，输注脾细胞数量较少，成模时间及症状符合临床异基因造血干细胞移植后慢性移植 物抗宿主病的发生发展特点，肺部及皮肤cGVHD的表现非常典型，肝脏亦有部分cGVHD 的表现。本方法提供了研究cGVHD的新模型，为国内大多数研究中心能够开展cGVHD 发病机制、药物试验、细胞免疫治疗等相关研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法，通过以下 步骤实现：

（1）以C57BL/6雌鼠（H-2^b）与BALB/c雄鼠（H-2^d）杂交出的CB6F1（H-2^bxd）代雄 性小鼠作为供鼠；

（2）以BALB/c（H-2^d）雌性小鼠作为受鼠；

（3）受鼠接受全身照射预处理后，将获自供鼠的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液 注射至受鼠。

优选地，所述供鼠及受鼠均采用8周龄小鼠。

具体地来说，所述步骤（3）中，供鼠骨髓细胞BMC悬液的制备如下：以颈椎脱臼 法处死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3~5min，无菌剥离股骨和胫骨，用RPMI1640培养 液冲洗骨髓腔，收集含有骨髓的冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细 胞，RPMI1640洗涤若干次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至5×10^7/mL细胞浓 度备用。

具体地来说，所述步骤（3）中，供鼠脾细胞SpC悬液的制备如下：以颈椎脱臼法处 死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3~5min，无菌取出脾脏，去除脾脏周围系膜组织，移入 平皿内用RPMI1640培养液洗涤若干次，碾磨，收集细胞冲洗液制成单细胞悬液，过滤 后用红细胞裂解液破除红细胞，用RPMI1640洗涤若干次，计数并用RPMI1640重悬细 胞，调整至2.5×10^7/mL细胞浓度备用。

具体地来说，所述步骤（3）中，移植当日受鼠接受直线加速器700cGy单次全身照 射预处理，照射后立即补充饮水，休息4~6小时后经尾静脉注射终体积为0.4mL的骨 髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液。

优选地，所述步骤（3）中，注射给受鼠的骨髓细胞BMC悬液的用量为1×10^7BMC， 脾细胞SpC悬液的用量为5×10^6。

本发明通过应用H-2抗原半相合子代小鼠的骨髓及脾细胞，移植给致死剂量辐照后 的父代但不同性别的小鼠，建立一种异基因骨髓移植后cGVHD模型。其具有如下特点： （1）该模型具有模拟临床上异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病的特点；（2） 建模型效率高，重复性好；（3）造模所需小鼠容易获得，过程简单易行；（4）肺部、皮 肤、肝脏等多器官同时发生典型病理改变；（5）移植后的小鼠存活时间长，更接近人类 cGVHD的病征表现，为在活体动物内进行防治人类cGVHD的研究提供新的实验平台。

附图说明

图1是cGVHD实验组小鼠的临床评分示意图（图例中每个时间点的评分以均数±标准差表示，n ＝5）

图2是cGVHD实验组小鼠临床表现；

图3是空白对照组和cGVHD实验组小鼠移植后+135d染色体图；

图4是移植对照组和cGVHD实验组小鼠135d处死后分离的肺、皮肤和肝脏的病理活检 HE染色图。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。本实验所用小鼠均购自广州市中山大学实 验动物中心。

实施例一

本例为本发明的小鼠异基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病模型的建立例，按以下步 骤操作：

一、供鼠准备

1、无特定病原体（Specefic pathogen Free,SPF）级C57BL/6雌性小鼠(H-2^b)8－10周龄 与SPF级BALB/c雄性小鼠(H-2^d)8－10周龄，2:1比例交配。

2、选择杂合子F1代，雄性，饲养至8周龄，作为供鼠备用。

二、受鼠准备

SPF级BALB/c小鼠(H-2^d)，雌性，8周龄，作为受鼠。将受鼠随机分为4组，每组 5只；其中，

A、正常对照组：同步饲养，无干预；

B、放射对照组：TBI+RPMI1640，即对组内小鼠进行全身照射（TBI）处理，经尾 静脉注射PRMI1640培养液；

C、移植对照组：TBI+1×10^7BMC，即对组内小鼠进行全身照射（TBI）处理，经 尾静脉注射经PRMI1640培养液处理的骨髓细胞BMC悬液；

D、cGVHD组：TBI+1×10^7BMC＋5×10^6SpC，即对组内小鼠进行全身照射（TBI） 处理，经尾静脉注射经PRMI1640培养液处理的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液。 三、根据以上分组，采用下述步骤进行移植实验操作：

1、异基因骨髓移植前一周对各组受鼠在层流动物房内接受添加抗生素（红霉素250mg/L， 庆大霉素32万U/L）的灭菌饮水进行肠道准备，并维持至移植后3周。

2、移植当日（0d），对B、C、D组受鼠接受直线加速器700cGy单次全身照射（TBI） 预处理。照射后立即补充饮水，休息4~6小时后经尾静脉注射终体积为0.4mL的移植 细胞悬液。

对照组B组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI1640培养液0.4mL；

对照组C组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI1640细胞悬液0.4mL，包括1×10^7BMC；

D组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI1640细胞悬液0.4mL，包括1×10^7BMC和5 ×10^6SpC。

其中，骨髓细胞（BMC）悬液制备操作如下：采用颈椎脱臼法处死供鼠，立即放入 75%乙醇中浸泡3~5min；超净工作台中无菌剥离股骨和胫骨，用RPMI1640培养液冲洗 骨髓腔，收集含有骨髓的冲洗液通过4号针头制成单细胞悬液，过滤，用红细胞裂解液 破除红细胞，RPMI1640洗涤3次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至5×10^7/mL 细胞浓度备用。

脾细胞（SpC）悬液制备操作如下：无菌取出脾脏，小心去除脾脏周围系膜组织，移 入平皿内用RPMI1640培养液洗涤3遍，然后置于200目不锈钢筛网中用2mL注射器 内芯轻轻碾磨，收集细胞冲洗液通过4号针头制成单细胞悬液，过滤，用红细胞裂解液 破除红细胞，用RPMI1640洗涤3次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至2.5×10^7/ mL细胞浓度备用。

移植后每天观察小鼠一般状态，包括体重、皮疹、脱毛、结痂、弓背、腹泻等，移植 14天后每3天进行一次临床评分，标准参见表1；濒死小鼠处死取材，其存活时间记至处 死次日；实验终点为移植后+135d。外周血白细胞计数：每组小鼠于+7d、+10d和+14d计 数WBC监测造血重建情况。计数方法：断尾取血10μL，加入190μL白细胞稀释液中混 匀，然后滴加到细胞计数板上，水平静置1min后计数4个大方格中细胞数（N），WBC= （N÷20）×10^9/L。

移植观察记录表明：A组小鼠正常存活至实验终点；B组小鼠中位存活12.5天，14 天内全部死亡；C、D组小鼠存活至实验终点。以上记录表明C、D组均移植成功，且存 活时间达到100天以上，比现有的类似疾病动物模型建立的存活时间长。

实施例2

本例为小鼠异基因骨髓植入检测例。

取移植后+135d的受鼠进行检测，按以下步骤进行：

1、秋水仙素处理：在做实验前3~4小时，向小鼠腹腔注射0.1％的秋水仙素（2-4μg/g）。 2、取股骨：实验时，用颈椎脱臼法迅速将小鼠处死，立即用剪刀剪去后肢的皮肤和肌肉， 连同关节一起取下两侧股骨，剔净其上肌肉。

3、取骨髓细胞：用注射器吸取6ml生理盐水，将注射器针头插入骨髓腔的一端，用生理 盐水冲出骨髓细胞至离心管，反复冲洗直至骨腔变白。将收集到的骨髓细胞溶液平衡后放 入离心机，以1000r/min离心10min，吸去上清液。

4、低渗：根据细胞量多少，加入0.075mol/L KCl低渗液5-6ml，用吸管轻轻吹打混匀， 在37℃恒温水浴箱内低渗20-30分钟。

5、预固定：低渗完毕，立即加1-2ml新配制的Carnoy固定液，轻轻吹打之后，以2000r/min 离心10min，小心吸管吸去上清液。

6、固定：沿离心管壁缓慢加入固定液7ml，用吸管吹打成细胞悬液。2000rpm的速度离 心10分钟，倾去上清。

7、再固定：重复步骤6的操作至上清基本无色清晰。

8、制备细胞悬液：沉淀物中加入适量固定液，用吸管轻轻吹打成细胞悬液。

9、滴冰片：从冰箱里取出预冷的载玻片，手持吸管在载玻片上方约10cm处向下滴片， 2-3滴，使悬液均匀扩散与玻片之上，多余的液体可小心倾去。

10、干燥、火焰固定：玻片于酒精灯外焰迅速来回几下。

11、玻片老化：置于37°C温箱1-2天后，于65°C烤箱中24h。

12、染色：低浓度胰酶消化，清水洗净，Giemsa染液室温下染色10分钟左右。清水冲洗， 在室温下自然干燥。

13、镜检：先用低倍镜找到一好的分裂相区域，然后转用高倍镜观察。

如图3所示，为来自于A组（空白对照组）和D组（cGVHD组）小鼠的染色体图， 箭头所示为Y染色体。图中染色体的改变也进一步表明D组小鼠移植成功。

实施例3

本例为cGVHD组小鼠的临床及病理检测例。

一、对D组小鼠进行慢性GVHD的临床评分，其评分标准如表1所示：

表1慢性GVHD的临床评分标准

得分 0分 1分 2分 3分 脱毛 无 <1cm²1～2cm²>2cm²体重减轻 无或减轻≤2％ 2％～8％ ≥8％   弓背体态 无 不影响运动 影响运动  

注:(a)耳朵、尾巴、脚掌每处脱皮或结痂记0.3分，皮肤临床表现最低得0分，最高得 3.9分。(b)皮肤得分超过0.6分视为发生GVHD；即使症状消退、小鼠自然死亡或人为 因素造成死亡也视为发生GVHD；小鼠无症状死亡视为无GVHD。

生存情况观察至少+100d。濒死小鼠处死取材，其存活时间记至处死次日。

图1为D组小鼠的临床评分示意图。（图例中每个时间点的评分以均数±标准差表示， n＝5）

图2为D组小鼠的临床表现，A显示弓背；B显示脱毛；C显示尾巴结痂；D显示脱 毛及耳内结痂。

二、对+135d的C组及D组小鼠进行慢性GVHD的病理检测，病理评分标准如下表 2所示：

表2慢性GVHD的病理评分标准

注：(l)得分超过2视为发生GVHD。

取移植后+135d的C组及D组受鼠处死后进行检测，按以下步骤进行：

1、固定：取各脏器组织切成小块，10%中性福尔马林溶液内固定24小时；

2、以下程序在Shandon全自动密闭脱水机中完成：

2.1把固定好的组织标本分别在80%乙醇50min，90%乙醇50min，95%乙醇ⅠⅡ各40min， 100%乙醇ⅠⅡ各40min；

2.2将脱水后标本分别在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中放置30min；

2.3低熔点石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中放置各25min（温度设置为62摄氏度）；

2.4高熔点石蜡Ⅰ缸25min（温度设置为64摄氏度）；

3、组织处理程序结束后，取出标本，置于包埋机的蜡槽中，进行包埋（温度设置为62 摄氏度）；

4、切片：在切片机上切下4μm切片，漂在干净的水面上，在50-57摄氏度温水中展开， 再将组织切片捞起；在70摄氏度烤箱中烘烤15-20min；

5、从烤箱中取出切片，室温稍冷却，将切片放到染色机上进行全自动HE染色，染色程 序如下：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中放置各7min，100%乙醇ⅠⅡ、95%乙醇ⅠⅡ、80%乙醇、 蒸馏水各1min；。苏木精染液中15分钟，水洗，0.5％盐酸酒精10s；2%碳酸锂水溶液1min； 流水冲洗10min，80%乙醇、95%乙醇ⅠⅡ，80%乙醇，100%乙醇ⅠⅡⅢ、二甲苯Ⅰ、Ⅱ 各1min；

6、取出切片，将切片挂上Shandon封片机进行封片。

7、光学显微镜下观察HE染色组织切片，结果发现小鼠肺脏表现为阻塞性细支气管炎， 细支气管内大量炎性细胞浸润，阻塞细支气管腔，管壁平滑肌层被破坏，及肺实变；尾皮 肤溃疡，真皮层大量胶原沉积；肝细胞颗粒变性、水肿，汇管区少量炎症细胞浸润；结果 参见图4和表3。图4为移植对照组和cGVHD实验组小鼠135d处死后分离的肺、皮肤 和肝脏的病理活检HE染色图。表3为各组多个实验小鼠慢性GVHD的检测结果。

结果显示，移植对照组的肺、尾皮肤及肝脏正常组织（×100）。cGVHD实验组：B1/B4 阻塞性细支气管炎，细支气管内大量炎性细胞浸润，阻塞细支气管腔，管壁平滑肌层被破 坏（×100），B7肺实变（×100）；B2尾皮肤溃疡（×100），B5尾皮肤真皮层大量胶原 沉积（×200），B8尾皮肤炎症细胞浸润（×200）；B3肝汇管区少量炎症细胞浸润（×100）， B6肝细胞颗粒变性、水肿（×200），B9肝汇管区少量炎症细胞浸润（×200）。

表3慢性GVHD的病理检测结果

检测结果表明，cGVHD实验组小鼠在皮肤、肝脏和肺部均表现出cGVHD症状，与 人类异基因移植后所表现的cGVHD症状非常相似。