堪萨斯分枝杆菌检测用的引物和探针、以及使用它们检测堪萨斯分枝杆菌的方法

摘要

本发明公开了含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互补序列的部分或者全部，并且与堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)基因的核酸序列杂交的寡核苷酸、含有该寡核苷酸的堪萨斯分枝杆菌检测用引物和探针、使用该引物和/或探针的堪萨斯分枝杆菌的检测方法。使用本发明的堪萨斯分枝杆菌的检测方法，与现有的通过菌的培养检查等鉴定菌种的方法比较，可以极其迅速且高精度地进行堪萨斯分枝杆菌的检测。另外与现有的通过使用引物或/和探针的PCR法的诊断方法比较，有可能排除诊断上的假阳性，可以更高精度地进行堪萨斯分枝杆菌的检测和诊断。另外也可以进行堪萨斯分枝杆菌菌体的定量。

说明书

本申请是中国专利申请200680016568.6的分案申请，原申请的申请日 是2006年5月11日，发明名称是“堪萨斯分枝杆菌检测用的引物和探针、 以及使用它们检测堪萨斯分枝杆菌的方法”。

技术领域

本发明涉及利用核酸扩增及其检测体系，在临床检查中检测和/或鉴定 堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii，以下称为M.kansasii)的方 法。

背景技术

非结核性抗酸菌(nontuberculous mycobacterium，NTM)是被分类在 分枝杆菌(Mycobacterium)属的具有抗酸性性质的革兰氏阳性杆菌，是 结核菌群和Mycobacterium.leprae以外的一种抗酸菌。

在非结核性抗酸菌中，临床上引人注目的菌种已知有堪萨斯分枝杆菌、 海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、 蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)、脓肿分枝杆菌 (Mycobacterium abscessus)等。特别是由堪萨斯分枝杆菌和鸟分枝杆菌这 2种菌引起的感染症占非结核性抗酸菌症全体的90％以上。

通常，人们认为非结核性抗酸菌对健康人是无害的，但偶尔对人也表 现出感染性，引起非结核性抗酸菌症。特别是对于象感染了AIDS病毒那 样的免疫功能缺陷者，成了重大的感染起因菌。虽然非结核性抗酸菌症一 直是很稀少的疾病，但由于近年有增加倾向，所以期盼开发在短时间能够 鉴别结核菌和非结核性抗酸菌的方法。加之鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的 核酸扩增检测和诊断法适用于健康保险，在全国急速推广之后，其诊断上 的意义很大。

由于非结核性抗酸菌大多数对抗结核药表现出抗性，当患者存在抗酸 菌感染症的嫌疑时，结核症还是非结核性抗酸菌症的鉴别诊断在决定治疗 方针上很重要。另外由非结核性抗酸菌引起的疾病因其菌的种类不同，治 疗法也各异，所以确定其菌种也非常重要。然而，由于非结核性抗酸菌症 没有特异的临床症状，所以根据临床所见、病理组织学所见鉴别结核症和 非结核性抗酸菌症，以及进一步确定非结核性抗酸菌的种类极其困难。因 此，结核症还是非结核性抗酸菌症的诊断必须通过菌的鉴定进行。

作为一般的诊断法，首先进行喀痰涂抹检查。该检查仅判断所谓的“抗 酸菌阳性”，不能鉴别是结核菌还是非结核性抗酸菌。因此在喀痰涂抹检 查中为阳性时，通过在小川培养基等培养基上分离培养，进行菌的培养检 查，鉴别是结核菌还是非结核性抗酸菌。然后再进行生物化学的试验，鉴 定菌种。然而分枝杆菌属发育一般比较慢，培养需要相当长的时间。因此， 当进行作为现在基本法的涂抹检查或培养检查时，为了获得是否是结核症 的诊断结果，仅菌的分离培养就需要3～4周时间。而且还存在着为了鉴定 菌种而进行的各种生物化学的试验还需要2～3周时间的问题。

另外堪萨斯分枝杆菌的鉴定也要通过生物化学的试验进行。通过生物 化学的试验鉴定堪萨斯分枝杆菌的主要鉴定方法是利用细菌暴露于光就生 产色素的性质，但由于几个其它的分枝杆菌属的菌种也表现出与堪萨斯分 枝杆菌同样的生物化学的特性，所以通常利用发色性鉴定堪萨斯分枝杆菌 也存在问题。

近年来，一直在开发于基因水平检测菌的技术。例如，研究了作为有 用的手段利用聚合酶链反应(PCR)等核酸扩增技术的诊断技术。该方法 具有灵敏度高，可以检测数个菌、时间短(最长4日)的优点。而且，运 用通常的PCR法无论是活菌还是死菌都可同样检测。然而无论菌数多少都 被判定为阳性，由于不知道菌数，有无感染性的诊断变得不确实。加之灵 敏度过高，具有容易出现假阳性的判定等问题。

就堪萨斯分枝杆菌来说，有从堪萨斯分枝杆菌的基因组文库获得DNA 探针(pMK1-9)的研究(非专利文献1)。该DNA探针(pMK1-9)虽然 可以与堪萨斯分枝杆菌的DNA形成互补的杂化体，但与其它种的分枝杆 菌也同样可形成杂化体，所以对堪萨斯分枝杆菌不特异。

在堪萨斯分枝杆菌的鉴定中还有着眼于使用pMK1-9探针和与堪萨斯 分枝杆菌的rRNA基因特异杂交结合的市售的DNA探针 (ACCUPROBE^TM，GenProbe，San Diego，加利福尼亚州)的研究(非专利文 献2)。然而，在该研究中报告了pMK1-9探针和市售的DNA探针(ACCU -PROBETM)中的任一个都不能检测相当数量的堪萨斯分枝杆菌株种。

另外，在堪萨斯分枝杆菌的检测中还有使用市售的DNA探针(ACCU -PROBETM)进行评价的其它研究(非专利文献3)。这些研究者们的实验 中，ACCU-PROBE^TM是100％种特异的，对于其它的分枝杆菌种没有 表现出交叉反应，但只可检测出堪萨斯分枝杆菌株中的73％。

有报告称可以从堪萨斯分枝杆菌的临床分离体纯化堪萨斯分枝杆菌特 异的DNA杂化体形成探针(p6123)(非专利文献4)。该探针(p6123)对实验 中使用的所有堪萨斯分枝杆菌株都可形成杂化体，也包括对Ross等人的 DNA探针(pMK1-9)没有反应的亚类。美国专利第5,500,341号(专利文 献2)公开了由p6123探针纯化的堪萨斯分枝杆菌特异的增殖引物。

另外，B.Boddinghaus等人报道了特异增殖的、与分枝杆菌DNA杂交 结合的，从16S的rRNA纯化分离的分枝杆菌属特异的寡核苷酸(非专利 文献5)。

另外还进行了例如有关对堪萨斯分枝杆菌检测有效的DNA区域的鉴 定的研究(例如专利文献1等)，但现状是还没有确立对堪萨斯分枝杆菌 特异的诊断法。

以上所述可知现状是希望确立新的特异检测非结核性抗酸菌的方法。

【专利文献1】特开平11-155589号公报

【专利文献2】美国专利第5,500,341号公报

【专利文献3】特开昭60-281号公报

【非专利文献1】Z.H.Huang等人，J.Clin.Microbiol.，1991，29，p.2125

【非专利文献2】B.C.Ross等人，J.Clin.Microbiol.，1992，30，p.2930

【非专利文献3】Tortoli等人，Eur.J Clin.Microbiol.Infect.Dis.，1994， 13，p.264

【非专利文献4】M.Yang等人，J.Clin.Microbiol.，1993，31，p.2769

【非专利文献5】B.Boddinghaus等人，J.Clin.Microbiol.，1990，28， p.1751

【非专利文献6】F.Poly等人，J.Bacteriology，2004，186，14， p.4781-4795

发明内容

发明要解决的课题

本发明是鉴于上述所述状况形成的发明，目的在于提供排除诊断上假 阳性的新的堪萨斯分枝杆菌检测用引物、以及使用该引物的简便、迅速且 精度高的堪萨斯分枝杆菌的检测方法。

用于解决课题的手段

本发明是以解决上述课题为目的形成的发明，构成以下。

(1)含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列(其 中，A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鸟嘌呤、T表示胸腺嘧啶。另 外，任意位置的T可以被替换为尿嘧啶(U)。下同)的部分或者全部、 或其互补序列的部分或者全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂 交的寡核苷酸。

(2)含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的 部分或者全部、或其互补序列的部分或者全部，并且含有与堪萨斯分枝杆 菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸的堪萨斯分枝杆菌检测用引物。

(3)含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的 部分或者全部、或其互补序列的部分或者全部，并且含有与堪萨斯分枝杆 菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸的堪萨斯分枝杆菌检测用探针。

(4)堪萨斯分枝杆菌的检测方法，其特征是使用含有序列号1、序列 号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互补序 列的部分或者全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交的寡核苷 酸作为引物和/或探针。

(5)堪萨斯分枝杆菌检测用试剂盒，其包含作为引物和/或探针的含有 序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的部分或全部、 或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交 的寡核苷酸。

本发明者等就到现在为止已确定的堪萨斯分枝杆菌和其它生物的各种 基因，反复进行了各种间的各基因序列同源性的理论检证与实验检证，结 果发现在通过使用微阵列法的方法得到的来自堪萨斯分枝杆菌的核酸序列 的片段中，存在着与堪萨斯分枝杆菌的基因序列的特定区域特异杂交，对 堪萨斯分枝杆菌的检测有用的碱基序列。

以这些见识作为基础再进行锐意研究，结果得到了对堪萨斯分枝杆菌 特异的寡核苷酸(序列号1、序列号2、序列号3、序列号4所示的核酸序 列)，发现这些核酸序列对堪萨斯分枝杆菌的检测有用。然后再以这些序 列为基础开发堪萨斯分枝杆菌检测用引物和探针，直至确立了使用这些引 物和探针的堪萨斯分枝杆菌的检测方法。

发明的效果

通过使用本发明的引物或/和探针的堪萨斯分枝杆菌的检测方法，与通 过现有的菌的培养检查等鉴定菌种的方法进行比较，前者可以极其迅速且 高精度进行堪萨斯分枝杆菌的检测。通过用本发明的检测方法进行堪萨斯 分枝杆菌的检测，与通过使用现有的引物或/和探针的PCR法进行的诊断 方法比较，诊断上的假阳性可能被排除，可以更高精度进行堪萨斯分枝杆 菌的检测和诊断。另外，通过使用本发明的检测方法，也可以进行堪萨斯 分枝杆菌菌体的定量。

附图的简单说明

【图1】候补克隆1的碱基序列和设计的引物的所在位置(箭头指示)。

【图2】候补克隆2的碱基序列和设计的引物的所在位置(箭头指示)。

【图3】候补克隆3的碱基序列和设计的引物的所在位置(箭头指示)。

【图4】候补克隆4的碱基序列和设计的引物的所在位置(箭头指示)。

【图5】在实验例1中，使用来自堪萨斯分枝杆菌基因组得到的PCR 产物、使用堪萨斯分枝杆菌的KATS2序列、以及日本专利申请2004-129272 号说明书中以序列号8表示的序列(本说明书中以序列号81表示。)得到 的以Cy3/Cy5的荧光强度为基础制作的散点图(scatter plot)。

【图6】实施例1中得到的电泳结果。

其中各泳道的数字分别表示使用以下各个样品时的结果。

M4：分子量标记(标记4)、

a：大肠杆菌(Escherichia coli)、

b：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis；人型结核菌)、

c：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、

d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、

e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)、

f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)、

g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、

h：斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、

i：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、

j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、

k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)、

l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、

m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)、

n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)、

o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)

p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、

q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)、

r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、

s：外来分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)。

【图7】表示实施例4中进行的实时PCR检测结果，绘制对应于各PCR 用DNA样品的基因组的拷贝数(x轴、对数值)的Ct值(y轴)的校正 曲线。

符号说明

图5中的各记号分别如以下所示。

(1)被判断为对堪萨斯分枝杆菌特异性高的候补克隆、

(2)使用特开平11-155589号所述的堪萨斯分枝杆菌的KAS序列的结果

(3)使用日本专利申请2004-129272号说明书中记载的来自结核分枝杆 菌的序列号8(本说明书中为序列号81)时的结果

(a)表示Cy5荧光强度/Cy3荧光强度的比率≥10.0的线

(b)表示Cy5荧光强度/Cy3荧光强度的比率≥5.0的线

(c)表示Cy5荧光强度/Cy3荧光强度的比率≥2.0的线

(a’)表示Cy3荧光强度/Cy5荧光强度的比率≥10.0的线

(b’)表示Cy3荧光强度/Cy5荧光强度的比率≥5.0的线

(c’)表示Cy3荧光强度/Cy5荧光强度的比率≥2.0的线。

用于实施发明的最好方式

本发明中所谓堪萨斯分枝杆菌基因指的是堪萨斯分枝杆菌具有的全基 因组序列内的任意的核酸序列单位(区域)。堪萨斯分枝杆菌的全基因组 序列还没有被破译。

作为本发明涉及的寡核苷酸，如含有序列号1、序列号2、序列号3 或序列号4所示的核酸序列的部分或全部、或者含有其互补序列的部分或 全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸(以下有时 略记为本发明的寡核苷酸)。

本发明涉及的序列号1所示的核酸序列的寡核苷酸大小为517个碱基、 序列号2所示的核酸序列的寡核苷酸大小为596个碱基、序列号3所示的 核酸序列的寡核苷酸大小为636个碱基、序列号4所示的核酸序列的寡核 苷酸大小为726个碱基。

作为本发明涉及的含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示 的核酸序列的部分或者全部的寡核苷酸，例如(1)含有与序列号1、序列 号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列具有约70％以上、优选约80％ 以上、更优选约90％以上、更优选约95％以上同源性的碱基序列的寡核苷 酸、或(2)特征为包含序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的 核酸序列中连续的10个碱基以上、优选20个碱基以上的寡核苷酸等。

作为含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的 部分的寡核苷酸如含有序列号5～79所示的核酸序列的部分或全部，并且 含有连续的10个碱基以上的寡核苷酸等。

作为含有序列号1所示的核酸序列的部分的寡核苷酸的具体例子，如 含有选自序列号5～12或序列号53～56所示的核酸序列的序列的寡核苷 酸；作为含有序列号2所示的核酸序列的部分的寡核苷酸的具体例子，如 含有选自序列号13～26或序列号57～64所示的核酸序列的序列的寡核苷 酸；作为含有序列号3所示的核酸序列的部分的寡核苷酸的具体例子，如 含有选自序列号27～40或序列号65～72所示的核酸序列的序列的寡核苷 酸；作为含有序列号4所示的核酸序列的部分的寡核苷酸的具体例子，如 含有选自序列号41～52或序列号73～79所示的核酸序列的序列的寡核苷 酸。

作为本发明涉及的含有与序列号1、序列号2、序列号3或序列号4 所示的核酸序列互补的互补序列的部分或全部的寡核苷酸，例如具有与含 有本发明的序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的寡 核苷酸杂交的碱基序列的部分或全部的寡核苷酸等。

上述的所谓具有与含有本发明涉及的序列号1、序列号2、序列号3 或序列号4所示的核酸序列的寡核苷酸杂交的碱基序列的部分或全部的寡 核苷酸具体的如具有与含有本发明的序列号1、序列号2、序列号3或序列 号4所示的核酸序列的寡核苷酸在高度严格的条件或严格的条件下杂交的 碱基序列的部分或者全部的寡核苷酸等。

其中这里所说的“高度严格的条件”具体的例如于50％甲酰胺中在 42～70℃、优选60～70℃的杂交、然后于0.2～2×SSC、0.1％十二烷基 硫酸钠(SDS)中在25～70℃清洗的条件。

而所谓的“严格的条件”，具体的例如在6×SSC或与它同等盐浓度 的杂交溶液中，于50～70℃温度条件下杂交16小时，用6×SSC或与它同 等的盐浓度的溶液等根据需要进行预清洗后，用1×SSC或与它同等的盐 浓度的溶液等清洗的条件。

所谓与本发明涉及的堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸 为如具有与上述的堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列在高度严格的条件或严 格的条件下杂交的碱基序列的寡核苷酸等。该高度严格的条件和严格的条 件如上所述。

作为含有与序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列 互补的互补序列的部分的寡核苷酸，如“含有与含有序列号5～79所示的 核酸序列的寡核苷酸互补的序列的部分或者全部，并且含有连续的10个碱 基以上的寡核苷酸”。

作为含有与序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列 互补的互补序列的部分的寡核苷酸的具体例子，如含有与选自序列号5～ 79所示的核酸序列中的序列的寡核苷酸互补的序列的寡核苷酸。

本发明的寡核苷酸既可以是脱氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核 酸(RNA)。当为核糖核酸时，不用说可以将胸苷残基(T)替换为尿苷 残基(U)。而在合成时，可以将任意位置的T变成U进行合成，含有尿 苷残基的DNA也可以。同样含有将任意位置的U变为T的胸苷残基的RNA 也可以。另外，1个或者多个核苷酸缺失、插入或被替换，即使象次黄苷 (I)那样的修饰核苷酸也可以。

为了获得本发明的寡核苷酸，可以使用通过同行众所周知的化学合成 法制备的寡核苷酸。因此，与克隆的寡核苷酸或多核苷酸相比，可以容易、 大量且便宜地获得一定品质的寡核苷酸。

例如，使用通常进行DNA合成的DNA合成仪，根据通常的磷酰胺法 合成寡核苷酸，通过使用阴离子交换柱层析的常规方法进行纯化，可以得 到作为目标的本发明的寡核苷酸。

另外，作为可达到本发明目的的探索(筛选)寡核苷酸的手段，有FEMS Microbiology Letters 166：63-70，1998或Systematic and Applied Microbiology 24：109-112，2001等报道的扣除法，有通过从作为目标的基 因组DNA片段扣除与来自要区别的生物种的基因组DNA片段反应的片 段，将候补序列浓缩的方法论。

另外，就像特开平11-155589号公报(专利文献1)报道的那样，可以 考虑利用所谓的制备来自作为目标的基因组DNA和来自要区别的生物种 的基因组DNA的扩增产物的差异显示的方法，即利用任意引物的聚合酶 链反应(AP-PCR)的方法论。

另外，通过利用称之为所谓的微阵列法的方法也可以获得本发明的寡 核苷酸。该方法首先做成例如堪萨斯分枝杆菌基因组DNA的鸟枪法克隆， 然后做成将来自得到的鸟枪法克隆的纯化DNA配置于载玻片上的微阵列。 另外，将作为目标的堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA片段做成荧光标记(标 记1)的片段。另一方面，也将来自要区别的生物种的基因组DNA片段做 成荧光标记(标记2)的片段，进行对照实验。即通过在同一反应体系使 用各个标记1和标记2的竞争杂交法，检定与微阵列上的序列的反应性(结 合性)。通过这样的操作，由于有可能选定与作为目标的堪萨斯分枝杆菌 的基因组DNA片段(标记1)更特异反应的序列候补群(例如非专利文献 6等)，由此可选择目标寡核苷酸。以下就使用微阵列法的本发明的寡核 苷酸的选定方法的一个例子进行详细说明。

(1)全基因组鸟枪法文库(Whole Genome Shotgun library)的制作

对Venter等人，Science.2001年2月16日；291(5507)：1304-1351所述 的全基因组鸟枪法进行改变，用下述方法进行堪萨斯分枝杆菌的全基因组 鸟枪法文库的制作。

首先用常规方法(例如高压蒸气灭菌处理和使用玻璃珠等进行菌体的 破碎处理)对堪萨斯分枝杆菌菌株进行处理，再按照常规方法进行DNA 的提取、纯化。将得到的纯化DNA样品在例如终浓度20％甘油存在下、 5kPa～9kPa压力下、雾化处理约1～5分钟，进行DNA的片段化处理。 通过这样处理，可以有效回收500～1000bp大小目标级分。将得到的级分 利用市售的提取柱进行纯化。

然后将得到的级分(DNA片段)按照常规方法通过连接整合到载体 DNA，得到重组DNA(堪萨斯分枝杆菌的全基因组鸟枪法文库)。作为为 此目的使用的载体DNA，当以后转化的宿主细胞为大肠杆菌时，为例如 pBS[例如pBSII sk+载体(Stratagene公司)]、pQE-TRI质粒(Qiagen公司 生产)、pBluescript、pET、pGEM-3Z、pGEX等载体。在连接之前，可预 先任意用DNA聚合酶进行处理，将DNA片段的末端进行平端处理等。

然后，用得到的重组DNA转化适当的宿主细胞，得到转化体。作为 为此目的使用的宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，优选JM109、DH5 α、TOP10等。作为宿主细胞，此外也可使用质粒和噬菌体DNA导入效 率高的Competent Cell(感受态细胞)。例如大肠杆菌JM109感受态细胞 (Takara Bio公司生产)等。

转化可以根据例如D.M.Morrison的方法(Method in Enzymology，68， 326-331，1979)等进行。而当使用市售的感受态细胞时，可以根据该制品的 说明书进行转化。

为了挑选导入整合了目标DNA片段的重组DNA的转化体，例如利用 用于转化的载体的性质的方法。例如，如果使用含有氨苄青霉素抗性基因 的载体，通过在含有氨苄青霉素的培养基上对转化体进行培养，对得到的 克隆进行选择，可以容易获得导入整合了目标DNA片段的重组DNA的转 化体(堪萨斯分枝杆菌基因组的全基因组鸟枪法克隆)的文库。

(2)微阵列制作

接下来用下述方法制作微阵列。

即根据常规方法从上述(1)得到的堪萨斯分枝杆菌基因组的全基因组 鸟枪法克隆纯化DNA，作为PCR用样品使用将该DNA悬浮添加到PCR 用反应液中，使用适当的引物[市售的引物也可以。例如M13 Primer M1(Takara Bio公司生产)和引物M13 Primer RV(Takara Bio公司生产) 等]，根据常规方法进行PCR后，对得到的PCR产物进行纯化。然后根据 常规方法将PCR产物点印到微阵列用载玻片上，然后对该载玻片进行 150mJ/cm²的UV照射，将PCR产物(含有来自目标的堪萨斯分枝杆菌 的DNA)固定在载玻片上，做成微阵列。

另外，根据需要，作为阳性对照，可使用例如对结核分枝杆菌(人型 结核菌)等结核菌特异的序列的DNA或堪萨斯分枝杆菌基因组具有的序 列的DNA等，作为阴性对照，使用例如来自大肠杆菌的DNA等，分别同 样地进行DNA的片段化、连接载体以及进行大肠杆菌的转化，同样进行 PCR，将得到的PCR产物固定在载玻片上，也制作它们各自的微阵列。

(3)目标基因组DNA的荧光色素标记

另外，对从堪萨斯分枝杆菌菌株提取、纯化的基因组DNA以及对照 用基因组(例如牛型结核菌等的结核菌)DNA通过使用己氨基-UTP的间接 标记法，分别用Cy3和Cy5进行标记。

以例如对DeRisi研究室(www.microarrays.org)发表的方法进行改 变的间接标记法为例进行说明。该方法使用带有氨基的αUTP，通过酶延 伸反应做成将该αUTP掺入到分子内的DNA链。然后通过使荧光色素(琥 珀酰亚胺体)化学键合在该氨基上，就可以对DNA进行标记了。

首先对起始材料(来自堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA和对照用基因 组DNA)根据常规方法进行热变性处理[可以使用BioPrime DNA labeling system(Invitrogene公司生产)等市售试剂盒]。然后添加DTT 2μl、 dATP/dCTP/dGTP的混合液、dTTP、Ha-dUTP、Klenow酶，于37℃进 行3小时左右的延伸反应。将得到的反应产物装到超滤柱中，以14000rpm 离心4分钟左右后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机等使其完 全干燥。然后向干燥的上述反应产物中加NaHCO₃，混合后常温下静置2～ 3分钟。

另外，制备将Cy3(或Cy5)溶于DMSO的溶液(Cy-dye Solution Cy3、 Cy-dye Solution Cy5)。分别将该Cy-dye Solution Cy3加到使用对照用基 因组DNA得到的上述反应产物中，而将Cy-dye Solution Cy5加到使用堪 萨斯分枝杆菌基因组得到的上述反应产物中，于40℃温育60分钟左右(避 光)。再分别向各个反应产物中加4M NH₂OH(使用前制备)，搅拌后通 过温育15分钟左右(避光)，得到各个基因组DNA的标记产物。然后将 得到的标记产物加到超滤柱中，于14000rpm下离心4分钟左右后，将浓 缩液回收到微管中，用真空干燥离心机使其完全干燥。

对于得到的各个干燥状态的基因组DNA的标记产物，制备终浓度为 0.04M Tris-醋酸(pH8.1)、0.1M醋酸钾、0.03M醋酸镁四水合物组成的溶 液，然后使干燥状态的基因组DNA的标记产物悬浮混合到该溶液中。于 94℃加热处理15分钟，可得到100个碱基～300个碱基的基因组DNA的 标记产物片段化的生成物(Cy3标记产物、Cy5标记产物)。

将各个Cy3标记产物和Cy5标记产物加到超滤柱中，于14000rpm下 离心4分钟左右后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机等使其完 全干燥。

向微管中加入含有鲑精DNA(10mg/mL)0.5μL、甲酰胺5μL的40 μL ArrayHyb杂交缓冲液(SIGMA公司生产)，将全量调整到40～50 μl的试剂溶液(是后面使用的微阵列的盖玻片为24×55mm大小时的组 成)，将上述得到的Cy3标记产物和Cy5标记产物在同一溶液中悬浮混合 后，于95℃温育5分钟，制备Cy3Cy5标记产物溶液。然后在用于接下来 的(4)的微阵列杂交之前保存在70℃。

(4)微阵列杂交(在阵列上的DNA-DNA杂交)

将上述(3)制备的Cy3Cy5标记产物溶液都加到上述(2)制作的微阵列 (DNA芯片)上，盖上盖玻片，但不要进入气泡。将它装到杂交盒中，密 闭于铺有蒸馏水弄湿的无尘纸(kimtowel)等的Tupper等容器内，于65 ℃反应8小时以上(避光)，进行杂交。杂交后，通过于室温下将微阵列 连同盖玻片一起浸入到2×SSC-0.1％SDS溶液中，于溶液中轻轻地摇动微 阵列，使盖玻片脱离。用1×SSC、0.03％SDS溶液(60℃)清洗10分钟， 用0.2×SSC溶液(42℃)清洗10分钟，用0.05×SSC溶液(室温)清洗 10分钟后，将微阵列迅速移到新的干的管架中，立刻于800rpm下离心5 分钟使其干燥。

(5)荧光强度的测定；从信号检测至数量化

使用荧光解读扫描仪，测定上述(4)中的微阵列杂交处理的微阵列上的 荧光强度，测定Cy3和Cy5的2通道的荧光强度，得到荧光检测数据。荧 光信号的数量化使用市售的DNA芯片发现图像解析软件等，按照软件的 操作步骤，可进行点自动识别、背景计算、荧光强度比的规一化。

杂交中使用的Cy5标记产物是对来自堪萨斯分枝杆菌的基因组进行了 标记的产物，Cy3标记产物是对对照用基因组DNA进行了标记的产物。 因此，测定Cy3与Cy5的各个荧光强度的结果，如果Cy5的荧光一方明 显被检测到，就意味着对象的微阵列的PCR产物与堪萨斯分枝杆菌杂交 了，判断为对堪萨斯分枝杆菌的特异性高。另一方面Cy3的荧光一方如果 明显被检测到的话，意味着对象的微阵列的PCR产物与对照用基因组DNA 杂交了，而有时检测到同样程度的强度的Cy3和Cy5的荧光，或什么也没 有检测到时，判断为对堪萨斯分枝杆菌的特异性低。

另外如果在微阵列上点加阳性对照(例如对结核分枝杆菌特异的DNA 片段，对堪萨斯分枝杆菌特异的DNA片段等)和阴性对照(例如来自大 肠杆菌的DNA片段等)，测定各自的Cy3Cy5荧光强度，如果看到其荧 光强度的倾向，可以作为荧光扫描测定中的1个数据评价基准。

另外，为了筛选用于堪萨斯分枝杆菌特异检测的候补序列，可以DNA 芯片上检测到的Cy3/Cy5的荧光强度比(Ratio)为基础，做成散点图(scatter plot)，像下面那样进行解析。

在解析中，使用的阳性对照序列中，对堪萨斯分枝杆菌特异的DNA 片段的Cy3/Cy5比的数值成为用于特异性评价的有用的基准值。即，从进 行筛选的候补中选择根据Cy3/Cy5比的数值解析的结果得到的显著的堪 萨斯分枝杆菌特异性信号(Cy5的荧光强度强时)，并且与上述对堪萨斯 分枝杆菌特异的阳性对照点相比，比率数值大的克隆。

再根据利用例如ABI PRISM310毛细管测序仪(Applied bio公司)等 仪器的常规方法，确定得到的候补克隆的碱基序列。

作为本发明涉及的堪萨斯分枝杆菌检测用引物，如含有序列号1、序 列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互补 序列的部分或者全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交的寡核 苷酸的引物(以下有时记为本发明的引物)。

另外，本发明的引物考虑要适合PCR、核酸杂交等条件，考虑解链温 度(Tm值)等因素后从含有序列号1～4所示的核酸序列的部分或者全部 的寡核苷酸、或含有其互补序列的部分或者全部的寡核苷酸中选择适当区 域的适当长度后使用，优选为维持作为引物序列的特异性所必需的碱基数 的具有10～50个碱基、更优选10～35个碱基、更优选18～25个碱基长度 的寡核苷酸。

引物的设计方法可以使用引物设计一般使用的软件，例如引物设计用 的Web tool Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)等进 行设计。

可用于本发明的引物的含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4 所示的核酸序列的部分或者全部、或其互补序列的部分或者全部，并且与 堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)的 具体例子与上述的本发明的寡核苷酸的说明中所述相同。

作为象这样的引物的具体例子，例如含有序列号5～52所示的核酸序 列的部分或者全部、或其互补序列的部分或者全部，并且含有与堪萨斯分 枝杆菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸。

作为本发明的引物更优选的具体例子，如含有选自序列号5～52所示 的核酸序列中的序列的引物、或含有与选自序列号5～52所示的核酸序列 中的序列互补的序列的引物。其中，如含有选自序列号5、6、13～16、27～ 30、41～44所示的核酸序列中的序列的引物，或含有与选自序列号5、6、 13～16、27～30、41～44所示的核酸序列中的序列互补的序列的引物。

而具有序列号5～12所示的核酸序列的引物是以序列号1所示的核酸 序列为基础设计的引物。具有序列号13～26所示的核酸序列的引物是以序 列号2所示的核酸序列基础设计的引物。具有序列号27～40所示的核酸序 列的引物是以序列号3所示的核酸序列为基础设计的引物。具有序列号 41～52所示的核酸序列的引物是以序列号4所示的核酸序列为基础设计的 引物。

图1中，序列号1所示的核酸序列上的具有序列号5和6所示的核酸 序列的引物的所在位置分别以1c_plate1_Fw1和1c_plate1_Rv1用箭头标 出。

图2中，序列号2所示的核酸序列上的具有序列号13、14、15和16 所示的核酸序列的引物的所在位置分别以6c_plate1_Fw1、6c_plate1_Rv1、 6c_plate1_Fw2、6c_plate1_Rv2用箭头标出。

图3中，序列号3所示的核酸序列上的具有序列号27、28、29和30 所示的核酸序列的引物的所在位置分别以8d_plate1_Fw1、8d_plate1_Rv1、 8d_plate1_Fw2、8d_plate1_Rv2用箭头标出。

图4中，序列号4所示的核酸序列上的具有序列号41、42、43和44 所示的核酸序列的引物的所在位置分别以9c_plate1_Fw1、9c_plate1_Rv1、 9c_plate1_Fw2、9c_plate1_Rv2用箭头标出。

另外，序列号1所示的核酸序列上的具有序列号7～12所示的核酸序 列的引物的所在部位分别表示如下。

序列号7(1c_plate1_Fw3)：33位～51位、

序列号8(1c_plate1_Fw4)：212位～231位、

序列号9(1c_plate1_Fw5)：315位～334位、

序列号10(1c_plate1_Rv3)：185位～204位、

序列号11(1c_plate1_Rv4)：411位～430位、

序列号12(1c_plate1_Rv5)：461位～481位。

序列号2所示的碱基序列上的具有序列号17～26所示的核酸序列的引 物的所在部位分别如下所示。

序列号17(6c_plate1_Fw3)：4位～21位、

序列号18(6c_plate1_Fw4)：48位～67位、

序列号19(6cplate1_Fw5)：229位～247位、

序列号20(6c_plate1_Fw6)：279位～296位、

序列号21(6c_plate1_Fw7)：380位～399位、

序列号22(6c_plate1_Rv3)：166位～184位、

序列号23(6c_plate1_Rv4)：195位～214位、

序列号24(6c_plate1_Rv5)：368位～387位、

序列号25(6c_plate1_Rv6)：428位～445位、

序列号26(6c_plate1_Rv7)：523位～542位。

序列号3所示的碱基序列上的具有序列号31～40所示的核酸序列的引 物的所在部位分别如下所示。

序列号31(8d_plate1_Fw3)：5位～22位、

序列号32(8d_plate1_Fw4)：54位～72位、

序列号33(8d_plate1_Fw5)：207位～226位、

序列号34(8d_plate1_Fw6)：289位～308位、

序列号35(8d_plate1_Fw7)：472位～490位、

序列号36(8d_plate1_Rv3)：151位～169位、

序列号37(8d_plate1_Rv4)：220位～239位、

序列号38(8d_plate1_Rv5)：335位～353位、

序列号39(8d_plate1_Rv6)：408位～427位、

序列号40(8d_plate1_Rv7)：616位～635位。

序列号4所示的碱基序列上的具有序列号45～52所示的核酸序列的引 物的所在部位分别如下所示。

序列号45(9c_plate1_Fw3)：17位～36位、

序列号46(9c_plate1_Fw4)：117位～135位、

序列号47(9c_plate1_Fw5)：405位～424位、

序列号48(9c_plate1_Fw6)：492位～512位、

序列号49(9c_plate1_Rv3)：182位～201位、

序列号50(9c_plate1_Rv4)：263位～281位、

序列号51(9c_plate1_Rv5)：528位～547位、

序列号52(9c_plate1_Rv6)：654位～673位。

其中上述的序列号后的()内表示本发明中命名的引物的名称。

获得本发明的引物的方法如上述获得本发明的核苷酸的方法中所述那 样。

另外，本发明的引物也可以用标记物质标记。

作为用标记物质对本发明的引物进行标记中使用的标记物质，只要是 放射性同位素或酶、荧光物质、发光物质、生物素等众所周知的标记物质， 无论哪一种都可以使用。

例如，作为放射性同位素，如³²P、³³P、³⁵S等，作为酶，如碱性磷 酸酶、西洋辣根过氧化物酶等，作为荧光物质，如Cyanine Dye系的Cy3、 Cy5(Amasham Bioscience公司)、荧光素等，作为发光物质，如含有 Acridinium Ester的化学发光试剂等。

当本发明的引物用放射性同位素标记时，如在合成引物时通过掺入用 放射性同位素标记的核苷酸而标记引物的方法，和合成引物后用放射性同 位素标记的方法等。具体来说，如一般常用的随机引物法、切口平移法、 通过T4多核苷酸激酶进行的5′-末端标记法、使用末端转脱氧核苷酰酶 的3′-末端标记法、RNA标记法等。

当本发明的引物用酶标记时，可以使用使碱性磷酸酶、西洋辣根过氧 化物酶等酶分子与欲进行标记的引物直接共价结合等该领域中常规方法的 直接标记法。

当通过荧光物质进行标记时，例如可以通过该领域中常用方法的标记 手法将荧光素标记的核苷酸掺入到引物中。另外，用带有连接臂的核苷酸 作为序列的寡核苷酸的一员进行替换的方法(例如、参照Nucleic Acids Res.，1986年，第14卷，p.6115)也可以将核苷酸用荧光物质进行标记。此 时，也有将5位带有连接臂的尿苷通过特开昭60-500717号公报报道的合 成法由脱氧尿苷化学合成，在上述寡核苷酸链中导入荧光物质的方法。

用发光物质标记的方法以及用生物素标记的方法可以按照通常该领域 进行的对核苷酸进行发光标记或生物素标记的常法进行。

作为本发明涉及的堪萨斯分枝杆菌检测用探针，例如含有序列号1、 序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互 补序列的部分或者全部、并且含有与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交 的寡核苷酸的探针(以下有时称为本发明的探针)。

在本发明的探针中使用的含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号 4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互补序列的部分或者全部、并且 与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸) 的具体例子与上述的本发明的寡核苷酸的说明中所述的例子相同。

本发明的探针在符合PCR(包括实时PCR)、核酸杂交等条件下，可以 由含有序列号1～4所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸，或含有其互 补序列的部分或全部的寡核苷酸计算解链温度(Tm值)等，选用适当区 域的适当长度。但是，如果要使探针具有充分的特异性，希望在考虑为维 持作为探针序列的特异性所必需的碱基数之后进行设计。

例如，作为在核酸杂交法(例如，Southern杂交等)等使用的探针， 如10～700个碱基、优选具有100～600个碱基、更优选200～500个碱基 长度的探针。

例如，作为实时PCR扩增体系(例如TaqMan^TM法、Molecular Beacon 法等)等中使用的探针，如具有10～50个碱基、优选15～40个碱基、更 优选20～30个碱基长度的探针。

作为象这样的探针的具体例子，如可从含有序列号5～79所示的核酸 序列的部分或者全部、或其互补序列的部分或者全部、并且含有与堪萨斯 分枝杆菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸的探针中选择。

作为本发明的探针的优选的具体例子，如含有选自序列号5～79所示 的核酸序列中的序列的探针。其中优选含有选自序列号5、6、13～16、27～ 30、41～44、53、57～59、65～67、73～75所示的核酸序列中的序列的探 针。特别优选含有选自序列号53、57～59、65～67、73～75所示的核酸序 列中的序列的探针。

而序列号53～79所示的核酸序列是通过使用本发明的引物的PCR扩 增的核酸序列。表1一并给出了正向引物和反向引物的组合、通过使用这 些组合的PCR扩增的核酸序列的序列号。例如，序列号53所示的核酸序 列是通过使用序列号5所示的核酸序列的寡核苷酸作为正向引物，序列号 6所示的核酸序列的寡核苷酸作为反向引物，通过PCR扩增的序列。

【表1】

获得本发明的探针的方法如上述获得本发明的核苷酸的方法中所述。

本发明的探针可以用标记物质进行标记。

作为用于对本发明的探针用标记物质进行标记的标记物质，只要是放 射性同位素或酶、荧光物质、发光物质、生物素等众所周知的标记物质， 可以使用任一个。

对本发明的探针进行标记的标记物质的具体例子以及标记方法就像本 发明的引物的标记方法说明中所述。

另外，作为下述的实时PCR检测法中使用的标记探针，如通过用在实 时检测法中通常使用的标识物质对本发明的探针进行了标记的探针。例如， 5′末端使用报告荧光物质(羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、 四氯荧光素(TET)等)标记的，3′末端使用猝灭剂色素[(例如羧基四甲 基若丹明(TAMRA)等荧光物质、Black Hole Quencher色素(BHQ)， 4-((4-二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等非荧光物质]标记的本发 明的探针。

作为本发明涉及的堪萨斯分枝杆菌检测中使用的样品，如喀痰、血液、 咽头粘液、胃液、支气管洗液、经支气管采取物、胸水等穿刺液、尿、脓 等各种临床材料。另外也可以是从检体分离、培养的培养菌体、从这些菌 体分离、纯化的核酸、或通过核酸扩增检测系统等扩增的核酸。

为了从上述样品中提取、纯化DNA，可以根据从检体提取抗酸菌(结 核菌)DNA中使用的常用方法进行。

如以菌体作为样品时，例如通过SDS等表面活性剂、硫氰酸胍(GTC) 等蛋白变性剂对菌体进行处理，破坏指定结核菌的膜结构的方法、用玻璃 珠等对菌体进行物理破碎的方法等。

以喀痰作为样品时，作为前处理，可以通过美国疾病管理预防中心 (Centers for Disease Control and Prevention，简称CDC)推荐的NALC (N-乙酰-L-半胱氨酸)-NaOH法(Kent PT，Kubica GP，Pubric Health Mycobacteriology，A Guide for the Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Services，Public Health Service，Center for Disease Control，Atlanta，U.S.A.，1985年，p.31-55)进行检体的匀浆化。

然后，可以通过一般的DNA制备法(酚/氯仿提取、乙醇沉淀法等， Rapid and simple method for purification of nucleic acids，J.Clin.Microbiol.， 1990年3月；28(3)，495-503，Boom R，Sol CJ，Salimans MM，Jansen CL， Wertheim-van Dillen PM，van der Noordaa J)进行DNA的提取和纯化。

对于从检体中分离、培养的培养菌体用作检测堪萨斯分枝杆菌的样品 时的例子，有例如收集小川培养基上的菌落，悬浮在灭菌蒸馏水中，离心 分离收集菌体后，再悬浮在蒸馏水中，高压灭菌釜处理后，经菌体的粉碎 处理(通过玻璃珠进行物理破碎等)，再离心分离回收上清。从所得的上 清中可以提取纯化DNA。对于DNA的提取、纯化，由于市售有各种试剂 盒，因此可以使用这些试剂盒进行，也可以根据该领域中的常规方法(例 如，酚/氯仿提取法、使用乙醇或异丙醇等使沉淀的方法等)进行。例如， 可以使用Qiagen公司生产的离子交换树脂类型的DNA提取纯化试剂盒 Genomic-tip等进行DNA的提取、纯化。

作为本发明涉及的堪萨斯分枝杆菌的检测方法，例如

(A)将含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4中所述的核酸 序列的部分或全部，或含有其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝 杆菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)作为引物使用 的方法。

(B)将本发明的寡核苷酸经标记物质标记后的产物作为标记探针使用 的方法等。以下分别就各个方法进行说明。

(A)将本发明的寡核苷酸作为引物使用的方法

作为(A)的方法，如使用本发明的引物，以样品中的核酸作为模板 进行核酸扩增反应，对得到的引物延伸物进行检测的方法，具体的例子， 如使用本发明的引物与样品中的核酸杂交，通过DNA聚合酶等进行核酸 扩增[例如PCR；专利文献3、LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)法(Tsugunori Notomi等人，Nucleic Acid Res.，28，e63， 2000)、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法(临床病理，51(11)，1061-1067，2003年11月)、LCR(ligase chain reaction)法(特开平4-211399号)、SDA(strand displacement amplification)法(特开平8-19394号)]，使引物延伸的方法，由此可使堪 萨斯分枝杆菌的核酸序列的特定区域的序列扩增，通过测定得到的引物延 伸物可以检测堪萨斯分枝杆菌。

PCR中使用的本发明的引物的具体例子如上述那样的例子。

优选的具体例子，作为正向引物的是含有序列号5、7～9、13、15、 17～21、27、29、31～35、41、43、45～48所示的核酸序列的部分或全部、 或者含有其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序 列杂交的寡核苷酸，作为反向引物的是如含有序列号6、10～12、14、16、 22～26、28、30、36～40、42、44、49～52所示的核酸序列的部分或全部、 或者含有其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序 列杂交的寡核苷酸。

更优选的具体例子，作为正向引物的是如含有选自序列号5、7～9、 13、15、17～21、27、29、31～35、41、43、45～48所示的核酸序列中的 序列的引物，作为反向引物的是如含有选自序列号5、10～12、14、16、 22～26、28、30、36～40、42、44、49～52所示的核酸序列中的序列的引 物。

更优选的具体例子，作为正向引物的是如含有选自序列号5、13、15、 27、29、41、43所示的核酸序列的序列的引物，作为反向引物的是如选自 序列号6、14、16、28、30、42、44所示的核酸序列中的序列的引物。

作为优选的正向引物和反向引物的组合，如上述表1给出的组合。

其中特别优选的正向引物和反向引物的组合，如

(1)正向引物是具有序列号5所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物 是具有序列号6所示的核酸序列的寡核苷酸的组合，

(2)正向引物是具有序列号13所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物 是具有序列号14所示的核酸序列的寡核苷酸的组合，

(3)正向引物是具有序列号15所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物 是具有序列号16所示的核酸序列的寡核苷酸的组合，

(4)正向引物是具有序列号13所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物 是具有序列号16所示的核酸序列的寡核苷酸的组合，

(5)正向引物是具有序列号27所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物 是具有序列号28所示的核酸序列的寡核苷酸的组合，

(6)正向引物是具有序列号29所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物 是具有序列号30所示的核酸序列的寡核苷酸的组合，

(7)正向引物是具有序列号27所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物 是具有序列号30所示的核酸序列的寡核苷酸的组合，

(8)正向引物是具有序列号41所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物 是具有序列号42所示的核酸序列的寡核苷酸的组合，

(9)正向引物是具有序列号43所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物 是具有序列号44所示的核酸序列的寡核苷酸的组合，

(10)正向引物是具有序列号41所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引 物是具有序列号44所示的核酸序列的寡核苷酸的组合，等等。

使用上述引物的PCR的条件、操作法等根据该领域中通常使用的常用 方法进行。

作为对得到的引物延伸物进行测定的方法，如(A-1)进行聚合酶链反 应后，对得到的引物延伸物进行电泳，根据其结果进行测定的方法，(A- 2)通过实时PCR法进行的方法，(A-3)进行使用标记引物的PCR，对得到 的引物延伸物的标记进行测定的方法等。

以下就各个方法进行说明。

(A-1)进行聚合酶链反应后，对得到的引物延伸物进行电泳，根据 其结果进行测定的方法

作为该方法，如

“以包括如下步骤为特征的堪萨斯分枝杆菌的检测方法：

(i)作为引物(本发明的引物)使用含有序列号1、序列号2、序列号 3、或序列号4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互补序列的部分或者 全部、并且与堪萨斯分枝杆菌的基因的核酸序列杂交的寡核苷酸，以样品 中的核酸作为模板进行PCR，

(ii)对上述(i)得到的引物延伸物进行电泳，根据该结果检测堪萨斯分 枝杆菌”。

作为进行电泳，根据其结果检测堪萨斯分枝杆菌的方法，例如(A-1 -1)通过确认作为目标的寡核苷酸大小(碱基对数)的引物延伸物级分进 行判定的方法、(A-1-2)通过使用标记探针的杂交进行判定的方法等。

电泳法的条件、操作方法等可以根据该领域中通常使用的常用方法进 行。

(A-1-1)通过确认作为目标的碱基对数的引物延伸物级分进行判定 的方法

上述的通过确认作为目标寡核苷酸大小(碱基对数)的引物延伸物级 分进行判定的方法，例如，首先进行PCR，对得到的引物延伸物进行电泳。 由在PCR使用的正向引物和反向引物对扩增产物的大小(碱基对数)进行 预测，预测得到的泳动级分的大小是否与扩增产物相当通过常用方法进行 确认。例如，将得到的级分用溴乙锭等染色后，通过肉眼判断核酸种类的 方法由该扩增产物的特征的大小进行检测等方法。

作为通过(A-1-1)的方法进行的具体的判定方法，例如以下的方 法。

(1)作为正向引物使用具有序列号5所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号6所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后，对 得到的引物延伸物进行电泳，将167碱基对的级分或确认具有序列号56 所示的核酸序列的寡核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(2)作为正向引物使用具有序列号7所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号10所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号54所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(3)作为正向引物使用具有序列号8所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号11所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号55所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(4)作为正向引物使用具有序列号9所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号12所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号56所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(5)作为正向引物使用具有序列号13所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号14所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将216个碱基对的级分或确认具有序列号 57所示的核酸序列的寡核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(6)作为正向引物使用具有序列号15所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号16所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将168个碱基对的级分或确认具有序列号 58所示的核酸序列的寡核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(7)作为正向引物使用具有序列号13所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号16所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将336个碱基对的级分或确认具有序列号 59所示的核酸序列的寡核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(8)作为正向引物使用具有序列号17所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号22所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号60所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(9)作为正向引物使用具有序列号18所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号23所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号61所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(10)作为正向引物使用具有序列号19所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号24所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号62所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(11)作为正向引物使用具有序列号20所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号25所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号63所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(12)作为正向引物使用具有序列号21所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号26所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号64所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(13)作为正向引物使用具有序列号27所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号28所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 就得到的引物延伸物进行电泳，将156个碱基对的级分或确认具有序列号 65所示的核酸序列的寡核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(14)作为正向引物使用具有序列号29所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号30所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 就得到的引物延伸物进行电泳，将156个碱基对的级分或确认具有序列号 66所示的核酸序列的寡核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(15)作为正向引物使用具有序列号27所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号30所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将358个碱基对的级分或确认具有序列号 67所示的核酸序列的寡核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(16)作为正向引物使用具有序列号31所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号36所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号68所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(17)作为正向引物使用具有序列号32所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号37所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号69所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(18)作为正向引物使用具有序列号33所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号38所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号70所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(19)作为正向引物使用具有序列号34所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号39所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号71所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(20)作为正向引物使用具有序列号35所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号40所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号72所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(21)作为正向引物使用具有序列号41所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号42所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将163个碱基对的级分或确认具有序列号 73所示的核酸序列的寡核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(22)作为正向引物使用具有序列号43所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号44所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将158个碱基对的级分或确认具有序列号 74所示的核酸序列的寡核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(23)作为正向引物使用具有序列号41所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号44所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将387个碱基对的级分或确认具有序列号 75所示的核酸序列的寡核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(24)作为正向引物使用具有序列号45所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号49所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号76所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(25)作为正向引物使用具有序列号46所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号50所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号77所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(26)作为正向引物使用具有序列号47所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号51所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号78所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

(27)作为正向引物使用具有序列号48所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号52所示的核酸序列的寡核苷酸进行PCR后， 对得到的引物延伸物进行电泳，将确认具有序列号79所示的核酸序列的寡 核苷酸的级分的产物判定为阳性的方法。

上述方法中，优选(1)、(5)～(7)、(13)～(15)、(21)～(23)的方法。

(A-1-2)通过使用标记探针的杂交进行判定的方法

作为通过使用标记探针的杂交进行判定的方法，例如将电泳后得到的 电泳级分与用标记物质标记的本发明探针的标记探针进行杂交，通过检测 该标记探针的标记确认与该标记探针杂交的级分是否存在来判定阳性的方 法。

使用的探针和标记探针的标记物质的具体例子、以及探针的标记方法 如上所述。

作为通过(A-1-2)的方法进行的具体的判定方法，例如下述的方 法。

(1)作为正向引物使用具有序列号5所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号6所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR后， 对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的具有 含有序列号53所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的标 记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针杂交 的级分判定为阳性的方法。

(2)作为正向引物使用具有序列号7所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号10所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR后， 对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的具有 含有序列号54所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的标 记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针杂交 的级分判定为阳性的方法。

(3)作为正向引物使用具有序列号8所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号11所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR后， 对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的具有 含有序列号55所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的标 记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针杂交 的级分判定为阳性的方法。

(4)作为正向引物使用具有序列号9所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号12所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR后， 对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的具有 含有序列号56所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的标 记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针杂交 的级分判定为阳性的方法。

(5)作为正向引物使用具有序列号13所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号14所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR后， 对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的具有 含有序列号57所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的标 记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针杂交 的级分判定为阳性的方法。

(6)作为正向引物使用具有序列号15所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号16所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR后， 对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的具有 含有序列号58所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的标 记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针杂交 的级分判定为阳性的方法。

(7)作为正向引物使用具有序列号13所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号16所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR后， 对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的具有 含有序列号59所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的标 记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针杂交 的级分判定为阳性的方法。

(8)作为正向引物使用具有序列号17所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号22所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR后， 对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的具有 含有序列号60所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的标 记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针杂交 的级分判定为阳性的方法。

(9)作为正向引物使用具有序列号18所示的核酸序列的寡核苷酸，作 为反向引物使用具有序列号23所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR后， 对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的具有 含有序列号61所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的标 记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针杂交 的级分判定为阳性的方法。

(10)作为正向引物使用具有序列号19所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号24所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号62所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(11)作为正向引物使用具有序列号20所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号25所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号63所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(12)作为正向引物使用具有序列号21所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号26所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号64所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(13)作为正向引物使用具有序列号27所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号28所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号65所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(14)作为正向引物使用具有序列号29所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号30所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号66所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(15)作为正向引物使用具有序列号27所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号30所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号67所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(16)作为正向引物使用具有序列号31所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号36所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号68所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(17)作为正向引物使用具有序列号32所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号37所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号69所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(18)作为正向引物使用具有序列号33所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号38所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号70所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(19)作为正向引物使用具有序列号34所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号39所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号71所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(20)作为正向引物使用具有序列号35所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号40所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号72所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(21)作为正向引物使用具有序列号41所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号42所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号73所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(22)作为正向引物使用具有序列号43所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号44所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号74所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(23)作为正向引物使用具有序列号41所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号44所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号75所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(24)作为正向引物使用具有序列号45所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号49所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号76所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(25)作为正向引物使用具有序列号46所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号50所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号77所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(26)作为正向引物使用具有序列号47所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号51所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号78所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

(27)作为正向引物使用具有序列号48所示的核酸序列的寡核苷酸， 作为反向引物使用具有序列号52所示的核酸序列的寡核苷酸，进行PCR 后，对于得到的引物延伸物进行电泳，将得到的级分与用标记物质标记的 具有含有序列号79所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸 的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认与该标记探针 杂交的级分判定为阳性的方法。

上述方法中优选(1)、(5)～(7)、(13)～(15)、(21)～(23)的方法。

若对于本发明涉及的堪萨斯分枝杆菌的检测方法通过以例如作为正向 引物使用具有序列号5所示的核酸序列，作为反向引物使用具有序列号6 所示的核酸序列的寡核苷酸的PCR、以及电泳后，确认目标碱基对数的引 物延伸物级分的方法进行检测的情况(上述的(A-1-1)中的(1)的方法) 为例进行详细说明，如下所述。

首先根据上述的方法，从要检测有无堪萨斯分枝杆菌的样品中得到纯 化DNA样品。然后，用上述方法从本发明涉及的核苷酸使用DNA合成仪 根据亚磷酰胺法合成具有序列号5表示的序列的寡核苷酸(以下记为 Ic_plate1_Fw1。)以及具有序列号6所示的核酸序列的寡核苷酸(以下记 为Ic_plate1_Rv1)。

制备含有Ic_plate1_Fw1以及Ic_plate1_Rv1、1.0～4.0mM MgCl₂、 80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.005～0.2％聚氧乙烯辛基 酚醚、各0.1～0.6mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和10～80单位/ml 的Taq DNA聚合酶的10mM Tris-HCl(pH8.9)缓冲液，作为PCR用反 应液。

将纯化DNA样品添加到PCR用反应液中作为PCR用样品使用，通 过DNA热循环仪进行20-40个循环的PCR。将得到的PCR后的反应液 进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。然后进行溴乙锭染色后，检测紫外线下的荧光。 而分子量标记也与反应液同时电泳，通过相对迁移率的比较，算出检测的 DNA片段的长度。可预测在作为正向引物使用Ic_plate1_Fw1、以及作为 反向引物使用Ic_plate1_Rv1的PCR中，堪萨斯分枝杆菌的核酸序列中的 167个碱基对的DNA片段(序列号53)被复制。其中，被确认的167个 碱基对的荧光带的产物判定为阳性。

(A-2)利用实时PCR法的方法

在本发明的堪萨斯分枝杆菌的检测方法中，也可以使用实时扩增检测 系统(参照例如美国专利第5210015号、美国专利第5538848号所述)。

作为利用实时扩增检测系统的检测系统的例子，例如实时PCR检测系 统。

在本发明的堪萨斯分枝杆菌的检测方法中可以使用例如TaqMan^TM实时PCR法(例如参照美国专利第5538848号所述)、MGB Eclipse Probe System法(例如参照美国专利第5,801,155号所述)、Molecular Beacons Probe Technology法(例如参照美国专利第5925517号所述)、LUX Fluorogenic Primer法(Invitrogen公司)、Quenching probe-PCR(QP) 法(例如参照美国专利第6,492,121号所述)等各种实时PCR检测法。

更具体地讲，通过使用5′末端用例如FAM等荧光色素(报告分子)、 3′末端用例如TAMRA等猝灭色素标记的探针的实时PCR法(例如参照 美国专利第5538848号所述)，可以高灵敏度并且定量地检测目标的微量 DNA。

即，用含有序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列 的部分或者全部、或其互补序列的部分或者全部、并且与堪萨斯分枝杆菌 基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物(本发明的引物)，使用含有序 列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的部分或者全部或 其互补序列的部分或者全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交 的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)的5′末端用报告荧光色素标记的、3′末 端用猝灭色素标记的寡核苷酸作为标记探针，用样品中的核酸作为模板进 行PCR，通过检测对从该标记探针游离的标记物质来进行。

上述的实时PCR法的原理如下所述。

即，使用5′末端用荧光色素(报告分子)、3′末端用猝灭色素标记的 与目的基因的特定区域杂交的寡核苷酸探针。该探针在通常的状态下报告 的荧光被猝灭色素抑制。在使该荧光探针完全与目的基因杂交的状态下， 由其外侧使用DNA聚合酶进行PCR。一旦DNA聚合酶推进延伸反应， 其外切核酸酶活性催化荧光探针从5′端水解，报告色素游离，发荧光。实 时PCR法通过对该荧光强度进行实时监测，可以正确地定量模板DNA的 初期量。

作为本发明涉及的实时PCR检测系统中使用的5′末端用荧光色素(报 告分子)、3′末端用猝灭色素标记的探针中使用的探针，可以是上述的本 发明的探针。实际上，可以使用具有通过选择的正向引物和反向引物的组 合进行实时PCR时得到的扩增产物的碱基序列的探针、或具有进一步由该 序列设计的碱基序列的探针。例如，在使用序列号5和序列号6的引物进 行实时PCR时使用的探针如经该实时PCR扩增具有预想的序列号53的 碱基序列的核苷酸，或具有由序列号53的碱基序列设计的序列(例如序列 号80)的寡核苷酸。

而作为对5′末端进行标记的报告荧光物质，如FAM、HEX、TET、 Cy5、VIC等，其中优选FAM。作为对3′末端进行标记的猝灭色素，如 TAMRA等荧光物质、BHQ(例如BHQ2)、DABCYL等非荧光物质， 其中优选TAMRA。

作为本发明涉及的实时PCR检测系统中使用的正向引物和反向引物， 如上述PCR法中使用的引物，其中优选的具体例子以及优选的组合如上所 述。

实时PCR检测系统中使用的其它的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、 dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等试剂可以使用通常实时PCR中 使用的试剂，实时PCR的方法除了使用本发明的引物和探针以外，可根据 实时PCR的一般程序进行。

就利用本发明涉及的实时PCR检测系统的堪萨斯分枝杆菌的检测方 法的一个例子说明如下。

首先根据上述的方法，从要检测的堪萨斯分枝杆菌的样品中获得纯化 DNA样品。然后使用DNA合成仪，通过亚磷酰胺法合成序列号5所示的 序列(Ic_plate1_Fw1)、序列号6所示的序列(Ic_plate1_Rv1)的寡核苷 酸。

根据作为引物使用Ic_plate1_Fw1和Ic_plate1_Rv1经PCR扩增的序 列号53的核酸序列，设计用作探针的序列(例如序列号80)，合成该序 列的寡核苷酸。通过常规方法在该寡核苷酸的5′末端结合报告色素FAM， 在3’末端结合报告猝灭物TAMRA，得到荧光标记探针。

使用上述制备的Ic_plate1_Fw1作为正向引物，Ic_plate1_Rv1作为反 向引物，例如像下述那样进行实时PCR。

即，制备含有各1μM的引物Ic_plate1_Fw1、以及引物Ic_plate1_Rv1、 100～1000nM的荧光标记探针、1.0～4.0mM MgCl₂、80mM KCl、500 μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.005～0.2％TritonX-100、各0.2mM的dATP、 dCTP、dGTP、dTTP、10～80单位/ml的Taq DNA聚合酶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为反应液。将向反应液20μl中加有纯化 DNA样品1ng的溶液作为PCR用样品，然后加入到96孔反应板的孔中， 使用适当的实时PCR检测仪器等进行实时PCR。反应反复进行30～50个 循环，每1循环都测定报告色素的发光量。

在堪萨斯分枝杆菌的判定中，测定到报告色素的发光量的情况可判定 为堪萨斯分枝杆菌阳性。

在实时PCR法中由于可做成校正曲线，所以可得到样品中堪萨斯分枝 杆菌的基因组DNA数(拷贝数)。而该数值与堪萨斯分枝杆菌的数成比 例，所以也可得到样品中的堪萨斯分枝杆菌的数。校正曲线的作成方法可 以是根据实时PCR法通常运用的常规方法。例如，作为标准使用拷贝数已 知的堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA样品，制备稀释系列浓度(拷贝数) 的PCR用DNA样品。然后使用各稀释系列的PCR用DNA样品根据上述 方法进行实时PCR，测定报告色素的发光量。对于各稀释系列的每个PCR 用DNA样品，做成将测定的发光量的测定值(Rn、y轴)对PCR的各循环 数(x轴)作图的扩增曲线。然后，选择发光量指数函数扩增的Rn部分， 画临界线(Threshold line(Th))。将Th与各PCR用DNA样品的扩增 曲线交叉的点作为临界循环(Threshold cycle(Ct))值。然后将Ct值(y 轴)对所用的各PCR用DNA样品的拷贝数的对数值(x轴)作图，可将 相对于各Ct得到的近似曲线作为校正曲线。

为了对样品中的堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA数(拷贝数)进行定 量，首先从要检测堪萨斯分枝杆菌的样品中分离纯化DNA后，对得到的 DNA样品进行实时PCR，同样做成扩增曲线。得到做成校正曲线时的Th 与得到的扩增曲线交叉的Ct值。通过将该Ct值应用于校正曲线，由此可 以获得样品中的堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA量(拷贝数)。

本发明在核酸扩增步骤中可以利用RNA转录产物的检测法。例如， NASBA(基于核酸序列的扩增)法(日本专利第2650159号)、3SR(自 我维持的序列扩增)法(特公平7-114718号)、TAS(基于转录的扩增系 统)法(特表平2-500565号：国际公开WO88/10315号)、TMA(转录 介导的扩增)法(特开平11-46778号)等，其中利用逆转录酶和RNA聚 合酶的协同作用(在逆转录酶和RNA聚合酶协同作用那样的条件下反应) 的特定温度核酸扩增法适于测定系统的自动化。

(A-3)对使用标记引物进行PCR得到的引物延伸物的标记进行测定 的方法

作为该方法，如使用将本发明的引物用上述方法标记的标记引物，以 样品中的核酸作为模板进行PCR，通过测定得到的引物延伸物的标记，当 可检测到标记时，判定为堪萨斯分枝杆菌阳性的方法。作为该方法中使用 的正向引物和反向引物，如在上述的PCR法中使用的引物，其中优选的具 体例子和优选的组合如上所述。

当利用上述方法进行PCR之后，除去游离的标记引物，测定引物延伸 物的标记，可以检测到标记时，判定为堪萨斯分枝杆菌阳性。

作为除去游离的标记引物的方法，将经PCR反应得到的反应物中的引 物延伸物通过使核酸沉淀的常规方法(使用乙醇沉淀法、异丙醇的沉淀法 等)沉淀后，除去没有沉淀的含有游离的标记引物的上清的方法等。

另外，如将经PCR反应得到的反应物在适当的条件下通过凝胶层析处 理后使引物延伸物与游离的标记引物分离的方法，通过电泳法分离的方法 等。

(B)使用本发明的寡核苷酸经标记物质标记后作为标记探针的方法

作为本发明的堪萨斯分枝杆菌的检测方法，如作为标记探针使用含有 序列号1、序列号2、序列号3或序列号4所示的核酸序列的部分或者全部、 或其互补序列的部分或者全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂 交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)经标记物质标记的寡核苷酸，使该标 记探针与样品中的核酸杂交，除去游离的标记探针后，对杂交的复合体的 标记进行检测的方法。

具体的例如

(B-1)使本发明的寡核苷酸与固相载体结合，用作捕捉探针，与样 品中的核酸杂交，使来自样品中的堪萨斯分枝杆菌的核酸固定在固相上的 检测法(例如参照特开昭62-265999号所述)，

(B-2)使用(B-1)的捕捉探针和对本发明的探针进行标记的标记探针 与样品中的核酸杂交，使捕捉探针和来自堪萨斯分枝杆菌的核酸与标记探 针的复合体在固相载体上形成，对标记探针的标记进行测定的夹心分析(例 如参照特开昭58-40099号所述)方法，

(B-3)使用用生物素标记的本发明的探针，与样品中的核酸杂交后， 通过抗生物素蛋白结合载体捕捉样品中的来自堪萨斯分枝杆菌的核酸的方 法等。

另外，在本发明的堪萨斯分枝杆菌的检测方法中使用的试剂中，作为 通常该领域中使用的试剂类，例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂等，可以使用 不抑制共存的试剂等的稳定性，不抑制PCR和杂交反应的试剂。而其浓度 也适宜从该领域通常使用的浓度范围选择。

缓冲液的具体例子，例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、巴比妥缓冲液、 硼酸缓冲液、优良缓冲液等、实施通常的PCR和杂交反应时使用的缓冲液， 其pH也没有特别限定，通常优选5～9的范围。

根据需要，可使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录 酶等)、酶相应的底物(dNTP、rNTP等)、以及双链嵌入剂(溴乙锭、 SYBR^TM Green等)或FAM和TAMRA等标记检测物质等。

作为本发明涉及的堪萨斯分枝杆菌检测用试剂盒，如“包含作为引物 (本发明的引物)或/和探针(本发明的探针)的含有序列号1、序列号2、 序列号3或序列号4所示的核酸序列的部分或全部、或其互补序列的部分 或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交的寡核苷酸的堪萨斯 分枝杆菌检测用试剂盒”。引物可以是用标记物质标记的引物。该标记物 质的具体例子如上所述。

在含有本发明的引物的试剂盒中也可包括含有一组正向引物和反向引 物的引物组成。作为其优选的实施方式，例如下述的例子。

(1)包含作为构成试剂的含有序列号5所示的核酸序列的部分或全部、 或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交 的寡核苷酸的正向引物和含有序列号6所示的核酸序列的部分或全部、或 其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列杂交的 寡核苷酸的反向引物。

(2)包含作为构成试剂的含有序列号13所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的正向引物和含有序列号14所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的反向引物。

(3)包含作为构成试剂的含有序列号15所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的正向引物和含有序列号16所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的反向引物。

(4)包含作为构成试剂的含有序列号13所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的正向引物和含有序列号16所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的反向引物。

(5)包含作为构成试剂的含有序列号27所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的正向引物和含有序列号28所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的反向引物。

(6)包含作为构成试剂的含有序列号29所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的正向引物和含有序列号30所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的反向引物。

(7)包含作为构成试剂的含有序列号27所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的正向引物和含有序列号30所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的反向引物。

(8)包含作为构成试剂的含有序列号41所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的正向引物和含有序列号42所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的反向引物。

(9)包含作为构成试剂的含有序列号43所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的正向引物和含有序列号44所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的反向引物。

(10)包含作为构成试剂的含有序列号41所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的正向引物和含有序列号44所示的核酸序列的部分或全 部、或其互补序列的部分或全部，并且与堪萨斯分枝杆菌基因的核酸序列 杂交的寡核苷酸的反向引物。

上述试剂盒还可以包含用标记物质标记的本发明的寡核苷酸作为标记 探针。

另外，如“含有作为探针的本发明寡核苷酸的堪萨斯分枝杆菌检测用 试剂盒”。该探针可以是用标记物质标记的探针。

构成这些试剂盒的构成试剂的优选方式和具体例子如上所述。

另外，在本发明的堪萨斯分枝杆菌的检测用试剂盒中，也可包含例如 缓冲剂、稳定剂、防腐剂等不抑制共存的试剂等的稳定性、不抑制PCR和 杂交反应的试剂。而其浓度也适宜从该领域通常使用的浓度范围选择。

缓冲液的具体例，例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、巴比妥缓冲液、硼 酸缓冲液、优良缓冲液等、实施通常的PCR和杂交反应时使用的缓冲液， 其pH也没有特别限定，通常优选5～9的范围。

根据需要，也可包含核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转 录酶等)、酶相应的底物(dNTP、rNTP等)、以及双链嵌入剂(溴乙锭、 SYBR^TM Green等)或FAM和TAMRA等标记检测物质等。

以下给出实施例，对本发明进行更具体的说明，但本发明并不受这些 例子的任何限定。

另外，在实施例中使用的细菌无论那一个都是临床分离株，培养后， 通过菌落的形状和现有的各种生物化学试验等，菌种都已经被鉴别。

实施例

实验例1.来自堪萨斯分枝杆菌基因组的克隆的选择

(1)DNA样品的制备

首先，使小川培养基上的堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii) 菌落悬浮在纯化水中，高压灭菌釜处理(120℃，2个大气压，20分钟)后， 经菌体的粉碎处理(通过直径2mm玻璃珠物理破碎)，离心分离，得到 上清。由所得的上清，使用Qiagen公司制的离子交换树脂型DNA提取纯 化试剂盒Genomic-tip进行DNA的提取、纯化。获得来自堪萨斯分枝杆菌 的基因组DNA。

将所得的纯化DNA最后配制成400ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液、 pH8.9)，作为DNA样品。

另外，作为阳性对照制备对特开平11-155589号所述的堪萨斯分枝杆 菌的KATS2、以及对日本专利申请2004-129272号说明书中以序列号8给 出的结核分枝杆菌(人型结核菌)特异的序列(本说明书中以序列号81 表示)，作为阴性对照使用根据大肠杆菌的DNA提取方法的常规方法对 DNA进行提取、纯化的来自大肠杆菌的DNA，同样制备DNA样品，同样 进行以下处理。

(2)全基因组鸟枪法文库的制作

以上述(1)得到的DNA样品24μg作为材料，用以下的方法(对Science. 2001年2月16日；291(5507)：1304-51，Venter等人所述的全基因组鸟枪法 进行了改变)进行全基因组鸟枪法文库的制作。

首先，利用雾化器(Invitrogene公司生产)，在终浓度20％的甘油存 在下，于5kPa～9kPa压力下进行约10分钟处理，使DNA样品片段化， 可以有效回收目标500～1000bp大小的级分。将得到的级分利用Qiagen 公司生产的提取柱进行纯化。

然后，使用Takara Bio公司生产的DNA Blunting Kit，利用T4DNA 聚合酶的5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性，将得到的DNA片段 的末端平端化。然后将它与已平端化末端处理完的pBSII sk+载体 (Stratagene公司)进行连接反应，制作在pBSII sk+载体(amp^r)中整合了 DNA片段的重组DNA。

使用Takara Bio公司生产的大肠杆菌JM109感受态细胞，根据该制 品说明书，用上述得到的重组DNA进行大肠杆菌JM109感受态细胞的转 化，将得到的转化体于含有100μg/ml的氨苄青霉素、0.2mM IPTG、40 μg/ml X-Gal的LB-琼脂培养基进行平板培养后，挑出白色菌落，获得导 入整合了目的DNA片段的重组DNA的转化体(堪萨斯分枝杆菌基因组的 全基因组鸟枪法克隆)的文库。

(3)微阵列制作

用下述方法，通过使用上述(2)得到的堪萨斯分枝杆菌基因组的全基因 组鸟枪法克隆进行PCR，制备固定于载玻片上的探针材料。

制备含有各1μM的引物M13Primer M1(Takara Bio公司生产)和引 物M13Primer RV(Takara Bio公司生产)、1.5mM MgCl₂、80mM KCl、 500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％Triton X-100(聚氧乙烯辛基酚醚， Rohm&Haas公司商品名)、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和Taq DNA聚合酶(Nippon Gene公司生产)40单位/ml的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为PCR用反应液。

根据常规方法从上述(1)中得到的堪萨斯分枝杆菌基因组的全基因组 鸟枪法克隆纯化DNA，把它悬浮添加到PCR用反应液20μl后的溶液用 作为PCR用样品(作为模板)，利用MJ Research公司的DNA热循环仪 (DNA Engine PTC200)，按照下述的反应条件进行30个循环的PCR。

PCR反应条件：

热变性：94℃、0.5分钟

退火：55℃、1分钟

聚合反应：75℃、0.5分钟。

将得到的PCR产物纯化后，与固定缓冲液(终浓度3x SSC)混合。

使用点印用装置(GTMAS Stamp II；日本激光电子公司生产)，被点 印的PCR产物的终浓度按照300ng/μL那样进行调整，将装置内的湿度设 定为55％，在载玻片(CMT GAPS-II；Corning公司生产)上点印得到的 PCR产物(点径150-250μm)。将点印完了的载玻片移到UV交联仪(UV Stratalinker1800；Stratagene公司制)，进行150mJ/cm²的UV照射，将 PCR产物(目的DNA)固定，做成微阵列。

(4)目标基因组DNA的荧光色素标记与微阵列杂交

i)目标基因组DNA的荧光色素标记

首先，利用BioPrime DNA labeling system(Invitrogene公司生产)， 将来自堪萨斯分枝杆菌(ATCC12478)的基因组以及对照用基因组(牛型 结核菌、ATCC19274)DNA各2μg与各个制品中的随机引物溶液20μL 进行混合，进行热变性(95℃、5分钟)处理。

然后，向各个热变性处理物中添加0.1M DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTP (各5mM)的混合液2μl、2.5mM dTTP 0.8μl、5mM Ha-dUTP 1.6μl、 Klenow酶(40U/μL)1μl，按照总体积最终达到50μL那样加去离子灭菌 水，于37℃进行3小时的延伸反应。将microconeYM-30(Millipore公司 生产)的超滤柱装到附带的1.5ml管中，将上述反应产物加到柱上，于 14000rpm离心4分钟后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机 (CentriVap离心浓缩机；LABCONCO公司生产)完全干燥。

向得到的干燥反应产物中加10μl 50mM NaHCO₃，并混合，于常温 下静置2～3分钟。

另外，制备将1mg的Cy3(Amersham Bioscience株式会社)或Cy5 (Amersham Bioscience株式会社)溶于105μl DMSO的溶液中。将该10 μl Cy-dye Solution Cy3加到使用对照用基因组(牛型结核菌)得到的上述 反应产物中，将10μl Cy-dye Solution Cy5加到使用堪萨斯分枝杆菌基因 组得到的上述反应产物中，分别于40℃温育60分钟左右(避光)。

再分别向各个反应产物中加10μl 4M NH₂OH(使用前制备)，搅拌 后通过温育15分钟左右(避光)，得到各个标记产物，即Cy3标记的对 照用基因组(牛型结核菌)DNA和Cy5标记的堪萨斯分枝杆菌基因组DNA。

将microconeYM-30(Millipore公司生产)的超滤柱装到附带的1.5ml 管中，将上述得到的基因组DNA的标记产物加到柱上，于14000rpm下将 得到的标记产物离心4分钟后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心 机(CentriVap离心浓缩机；LABCONCO公司生产)完全干燥。

ii)标记产物的片段化步骤

对于上述(4)i)得到的干燥状态的基因组DNA的标记产物，添加制备 的40μL终浓度为0.04M Tris-醋酸(pH8.1)、0.1M醋酸钾、0.03M醋酸镁 四水合物组成的溶液，使其悬浮混合。然后于94℃加热处理15分钟，可 得到100个碱基～300个碱基的基因组DNA的标记产物片段化的生成物。

另外使用BcaBEST DNA聚合酶(Takara Bio公司生产)和rBst DNA 聚合酶(EPICENTRE公司生产)研究标记效率(碱基/染料)，结果确认 在对照用基因组(牛型结核菌)DNA的约20个碱基中掺入了1分子染料，在 堪萨斯分枝杆菌基因组DNA的约10个碱基中掺入了1分子染料。

将各个Cy3标记产物溶液和Cy5标记产物溶液加到microcone YM-10 (Millipore公司生产)的超滤柱中，于14000rpm下离心4分钟后，将浓缩 液回收到微管中，用真空干燥离心机(CentriVap离心浓缩机；LABCONCO 公司生产)使其完全干燥。然后向微管中加以下试剂(以下使用的微阵列用 的盖玻片为24×55mm时)，使上述得到的Cy3标记产物与Cy5标记产 物悬浮于同一溶液中，并混合。

ArrayHyb杂交缓冲液(SIGMA公司生产)；40μL

鲑精DNA(10mg/mL)；0.5μL

甲酰胺；5μL

总共40～50μL

悬浮混合后，于95℃温育5分钟，在杂交前保存在70℃。

iii)微阵列杂交

将上述(4)ii)制备的Cy3标记产物和Cy5标记产物的混合溶液都加到上 述(3)制作的微阵列(DNA芯片)上，盖上盖玻片，但不要进入气泡。将它 装到杂交盒中，置于用蒸馏水弄湿的无尘纸(kimtowel)上的Tupper中 密闭，于65℃反应8小时以上，进行杂交(避光)。杂交后，通过于室温 下将DNA芯片连同盖玻片一起浸入到2×SSC-0.1％SDS溶液中，于溶液 中轻轻地摇动DNA芯片，使盖玻片脱离。然后用1×SSC、0.03％SDS溶 液(60℃)清洗10分钟，用0.2×SSC溶液(42℃)清洗10分钟，用0.05 ×SSC溶液(室温)清洗10分钟后，将DNA芯片迅速移到新的干的管架 中，立刻于800rpm下离心5分钟使其干燥。

(5)荧光强度的测定；从信号检测至数量化

使用荧光解读扫描仪(Protein Array Scanner；日本激光电子公司生 产)，测定上述(4)iii)中得到的微阵列上的荧光强度，得到使用2通道(Cy3、 Cy5)的荧光检测数据。荧光信号的数量化使用日立软件公司生产的 DNASIS^TM-Array(DNA芯片发现图像解析软件)，按照软件的操作步骤， 可进行点自动识别、背景计算、荧光强度比的规一化。另外，确定置信界 限线，通过对该界限线以下区域的数据不处理，求归一化的可置信的荧光 强度比。

另外，在微阵列上点印上阳性对照(对结核分枝杆菌特异的DNA片 段、堪萨斯分枝杆菌的KATS2序列片段)以及阴性对照(来自大肠杆菌 的DNA片段)。

为了筛选用于特异检测堪萨斯分枝杆菌的候补序列，以在DNA芯片 上检测的Cy3/Cy5的荧光强度比(Ratio)为基础，进行散点图(scatter block)解析。结果如图5所示。

作为比较，使用特开平11-155589号所述的堪萨斯分枝杆菌的KATS2 序列、以及日本专利申请2004-129272号说明书所述的来自结核分枝杆菌 的序列号8(在本说明书中为序列号81)，进行同样处理，对Cy3和Cy5 的荧光进行检测的结果也一并表示在图5中。

在图5中，给出了整个散点图以及对绘制集中的(虚线圈起的)部分 放大的图。散点图用双对数图表示，纵轴表示相对于横轴Cy3荧光强度的 Cy5荧光强度。在图5中，(2)和(3)以外的点表示各微阵列上使用PCR产 物的结果，作为(2)以圆圈表示的点是使用特开平11-155589号所述的堪萨 斯分枝杆菌的KAS序列的结果，作为(3)以圆圈表示的点表示使用日本专 利申请2004-129272号说明书所述的来自结核分枝杆菌的序列号8(本说明 书中为序列号81)时的结果。

图5上的各条线的意思如下。

(a)表示Cy5荧光强度/Cy3荧光强度的比率≥10.0的线

(b)表示Cy5荧光强度/Cy3荧光强度的比率≥5.0的线

(c)表示Cy5荧光强度/Cy3荧光强度的比率≥2.0的线

(a’)表示Cy3荧光强度/Cy5荧光强度的比率≥10.0的线

(b’)表示Cy3荧光强度/Cy5荧光强度的比率≥5.0的线

(c’)表示Cy3荧光强度/Cy5荧光强度的比率≥2.0的线。

即，表示处于(a)的线之上的点，Cy5的荧光强度与Cy3的荧光强度比 较，强10倍以上，处于(b)的线之上的点，Cy5的荧光强度与Cy3的荧光 强度比较，强5～10倍以上，处于(c)的线之上的点，Cy5的荧光强度与 Cy3的荧光强度比较，强2～5倍以上。而处于(a’)的线之下的点，Cy3的 荧光强度与Cy5的荧光强度比较，强10倍以上，处于(b’)的线之下的点， Cy3的荧光强度与Cy5的荧光强度比较，强5～10倍以上，处于(c’)的线 之下的点，Cy3的荧光强度与Cy5的荧光强度比较，强2～5倍以上。

如图5表明的那样，由于(3)的点处于线(b’)与线(c’)之间，表示Cy3的 荧光强度比Cy5的荧光强度强5～10倍，可知该点与牛型结核菌基因组 DNA杂交。另外，由于(2)的点处于线(c)与线(b)之间，表示Cy5的荧光 强度比Cy3的荧光强度强2～5倍，可知该点与堪萨斯分枝杆菌的基因组 DNA杂交。

而当作为阴性对照使用大肠杆菌的基因组DNA时，散点图上的点由 于Cy5荧光强度/Cy3荧光强度的比率在1付近，荧光强度处于非常低的位 置，图5没有表示。

图5中，由进行筛选的各微阵列的PCR产物中，由于用圆圈圈起来的 (1)中显示的8个点(由于点重叠，可看到5个，实际有8个点)检测到比 (2)更强的Cy5荧光，所以判断与(2)(特开平11-155589号所述的堪萨斯分 枝杆菌的KATS2序列)相比对堪萨斯分枝杆菌的特异性高。因此将这8 个克隆选作为候补克隆。

(6)确定候补克隆的碱基序列

对上述(5)中选择的8个候补克隆，用下面的方法确定碱基序列。

即，使用Big Dye Terminator试剂盒(Applied Biosystems公司生产)， 根据制品说明书，按照以下的步骤进行序列解析。

候补DNA(候补克隆)；2μL(100ng)

M13Primer M1；1μL(5pmol)

premix；8μL

向上述混合物中加去离子灭菌水使总体积达到20μL，通过MJ Research公司的DNA热循环仪(DNA Engine PTC200)于下面的反应条 件下进行30个循环的测序反应。

96℃2分钟→(96℃10秒→50℃5秒→60℃4分钟)×25→4℃

将得到的测序反应产物经QIAGEN公司制的凝胶过滤柱纯化后，使用 MJ Research公司制的测序仪(BaseStation)，按照仪器附带的操作说明 书完成所有候补序列的序列解读。

将得到的结果在数据库(NCBI BLAST)中进行检索，结果发现虽然 也来源于基因组序列未破译的生物种堪萨斯分枝杆菌，但就数据库上来说， 候补的所有8个克隆都是未登录的新的序列。

实施例1.候补克隆的堪萨斯分枝杆菌特异性评价

对于实验例1得到的8个候补克隆，通过利用PCR扩增系统的琼脂糖 凝胶电泳检测实施评价实验，研究这些候补克隆是否可以在使用基因扩增 检测系统的堪萨斯分枝杆菌特异的检测系统中利用。

(1)PCR引物的合成

首先，根据确定的候补克隆1的序列的解析结果，使用引物设计用的 Web tool Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)设计PCR 扩增检测用的引物序列。使用设计的“CGGCCATTGTTCTACAGTCT” (序列号5，以下称为1c_plate1Fw1)和“TAGAGATCCATCGCTTTGGT” (序列号6、以下称为1c_plate1_Rv1)，进行如下的PCR。使用ABI公司 DNA合成仪392型，用亚磷酰胺法合成设计的寡核苷酸。合成方法根据 ABI公司手册，可通过将寡核苷酸的氨水溶液于55℃加热过夜实施各种寡 核苷酸的去保护。然后通过使用Pharmacia公司制FPLC进行阴离子交换 柱层析纯化合成的寡核苷酸。

而由序列的解析结果得到的候补克隆1的碱基序列如序列号1所示。

(2)样品的制备

使用以下给出的细菌，用下面的方法对DNA进行提取和纯化，得到 DNA样品。细菌都是临床分离株，培养后，菌种已经通过菌落的形状和现 有的各种生物化学的试验等被鉴别。

a：大肠杆菌(Escherichia coli)

b：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis；人型结核菌)

c：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)

d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)

e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)

f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)

g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)

h：斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)

i：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)

j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)

k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)

l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)

m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)

n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)

o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)

p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)

q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)

r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)

s：外来分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)

首先，对于分枝杆菌(Mycobacterium)属细菌，将小川培养基上的 菌落悬浮于纯化水中，高压蒸气灭菌处理(120℃·2气压、20分钟)后， 经菌体的粉碎处理(通过直径2mm玻璃珠物理破碎)，离心分离，获得 上清。使用Qiagen公司制的离子交换树脂型DNA提取纯化试剂盒 Genomic-tip从得到的上清进行DNA的提取、纯化。而对于大肠杆菌，根 据大肠杆菌的DNA提取方法的常规方法，提取、纯化DNA。

将得到的纯化DNA制备成最终1ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液、 pH8.9)，作为DNA样品。

(3)PCR

使用以候补克隆的碱基序列(序列号1)为基础，用上述方法设计、 合成的引物序列1c_plate1_Fw1和1c_plate1_Rv1，如下那样进行PCR。 而候补克隆1的碱基序列上的各引物的所在位置如图1所示。

首先，制备含有各1μM的引物1c_plate1_Fw1和引物1c_plate1_Rv1、 1.5mM MgCl₂、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％Triton X-100(聚氧乙烯辛基酚醚、Rohm&Haas公司商品名)、各0.2mM的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP和Taq DNA聚合酶(Nippon Gene公司生 产)40单位/ml的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为PCR用反应 液。

使用在20μl的PCR用反应液中添加1ngDNA样品的溶液作为PCR 用样品，运用MJ Research公司的DNA热循环仪(DNA Engine PTC200)， 在下面反应条件下进行30个循环的PCR。

PCR反应条件：

热变性：94℃、0.5分钟

退火：55℃、1分钟

聚合反应：75℃、0.5分钟。

(4)电泳

将上述(3)中得到的PCR后的反应液5μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。 电泳的电压条件为恒电压100V，电泳30分钟。操作方法以及其它条件根 据生物实验指导2卷，p53-63(秀润社、中山广树著)所述的一般用的方法。 然后经溴乙锭染色后，用UV样品摄影装置FAS-III系统(东洋纺织公司 生产)检测紫外线下的荧光。另外，分子量标记也与反应液同时电泳，通 过比较相对迁移率，算出检测的DNA片段的长度。而分子量标记使用 X174/HaeIII消化物(标记4、Nippon Gene公司生产)。

得到的电泳的结果如图6所示。

图6中，各泳道的数字分别表示使用以下各个样品时的结果。

M4：分子量标记(标记4)

a：大肠杆菌(Escherichia coli)

b：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis；人型结核菌)

c：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)

d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)

e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)

f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)

g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)

h：斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)

i：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)

j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)

k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)

l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)

m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)

n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)

o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)

p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)

q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)

r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)

s：外来分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)

通过使用正向引物1c_plate1_Fw1和反向引物1c_plate1_Rv1的PCR 可预测到位于堪萨斯分枝杆菌基因组中的候补序列1的167个碱基对的 DNA片段(序列号53)被复制。因此，可将确认有167个碱基对的荧光 带的判定为阳性。

就像图6的结果表明的那样，使用本发明的引物1c_plate1_Fw1和引 物1c_plate1_Rv1进行的PCR的结果可以确认只有堪萨斯分枝杆菌作为样 品时(c)，可确认167个碱基对的荧光带，判定为阳性。而相反，当以其 它分枝杆菌属细菌和其它属的细菌大肠杆菌的样品为样品时(a和b、d～ s)，不能确认该荧光带，都判定为阴性。

由以上实验表明候补克隆1是具有对堪萨斯分枝杆菌特异的碱基序列 的寡核苷酸，通过使用该序列为基础设计的引物进行PCR的方法判断可以 特异检测堪萨斯分枝杆菌。另外由于利用PCR等核酸扩增进行的检测预期 灵敏度高，没有必要分离细菌，有可能可直接对临床材料进行检测，所以 对于用以往的在细菌培养之后进行检测的方法要经培养数周的堪萨斯分枝 杆菌的检测，最长1日以内也可完成检测。

实施例2.使用本发明的引物进行堪萨斯分枝杆菌的检测1

对于实验例1(6)中得到的候补克隆2，以该碱基序列为基础，通过与 实施例1(1)同样的方法设计6c_plate1_Fw1(候补序列13)作为正向引物 和设计6c_plate1_Rv1(候补序列14)作为反向引物，进行合成。然后使 用与实施例1(2)～(4)同样的样品和试剂，用同样的方法进行PCR和电泳。

另外，由序列解析结果得到的候补克隆2的碱基序列如序列号2所示， 候补克隆2的碱基序列上的设计的各引物所在位置如图2所示。

通过使用正向引物6c_plate1_Fw1和反向引物6c_plate1_Rv1的 PCR，预测位于堪萨斯分枝杆菌基因组中的候补序列2的216个碱基对的 DNA片段(序列号57)被复制。在此216个碱基对的荧光带被确认的片 断判定为阳性。

该结果表明，此时只有以堪萨斯分枝杆菌作为样品时(c)可确认216 个碱基对的荧光带，判定为阳性。与此相反，当以其它分枝杆菌属细菌或 其它属的细菌大肠杆菌的样品作为样品时(a和b、d～s)，不能确认该荧 光带，都可判定为阴性。

以上实验表明候补克隆2也是具有对堪萨斯分枝杆菌特异的碱基序列 的寡核苷酸，可知通过使用以此寡核苷酸为基础设计的引物进行PCR的方 法可以特异检测堪萨斯分枝杆菌。

实施例3.使用本发明的引物进行堪萨斯分枝杆菌的检测2

对于实验例1(6)中得到的候补克隆3～8，以该碱基序列为基础，通过 与实施例1(1)同样的方法进行引物的设计、合成。除了使用的各个引物以 外，其它使用与实施例1(2)～(4)同样的样品和试剂，用同样的方法进行 PCR和电泳。

可知该结果在考虑对堪萨斯分枝杆菌的特异性时，候补序列3和4对 堪萨斯分枝杆菌的特异性高，对该判定是有效的。

另外，由序列解析结果得到的候补克隆3的碱基序列如序列号3所示， 在候补克隆3的碱基序列上设计的各引物所在位置如图3所示。

另外，由序列解析结果得到的候补克隆4的碱基序列如序列号4所示， 在候补克隆4的碱基序列上设计的各引物所在位置如图4所示。

实施例4.通过实时PCR扩增系进行堪萨斯分枝杆菌的检测

(1)堪萨斯分枝杆菌检测用PCR引物的合成

使用与实施例1(1)同样的仪器，通过同样的操作合成1c_plate1_Fw1 (序列号5)和1c_plate1_Rv1(序列号6)的寡核苷酸。

(2)堪萨斯分枝杆菌检测用探针的制作

由通过作为引物使用1c_plate1_Fw1和1c_plate1_Rv1的PCR扩增的 序列号53的寡核苷酸序列(167个碱基对)设计用作探针的序列 “ACTCAATGCCCTTCGATCCCGGCGAAC”，合成该序列的寡核苷酸 (以下记为KAN1c_F1R1_FAMTAM。序列号80)。在该寡核苷酸的5′末 端结合报告色素FAM，3′末端结合报告猝灭物的TAMRA，得到标记的寡 核苷酸探针(TaqManT M荧光探针，Applied Biosystems Japan公司生产)。

(3)PCR用DNA样品的制备

对于由实验例1(1)制备的堪萨斯分枝杆菌样品得到的DNA样品，通过 测定吸光度测定样品中的DNA量。通过将得到的DNA量与已知的堪萨斯 分枝杆菌的基因组DNA量比较，确定样品中的基因组DNA量(基因组拷 贝数)。得到10⁸个拷贝/μl的基因组DNA。

然后使用pH8.9的10mM Tris-HCl缓冲液，制备将DNA样品稀释为 10⁵，10⁴，10³，10²，10，5，2个拷贝/μL的稀释系列样品，作为PCR用DNA 样品。

(4)实时PCR

使用上述(1)制备的1c_plate1_Fw1作为正向引物，1c_plate1_Rv1作为 反向引物，像下面那样进行实时PCR。

即制备含有各1μM的引物1c_plate1_Fw1和引物1c_plate1_Rv1、 195nM的上述(2)制备的荧光标记探针KAN1c_F1R1_FAMTAM、1.5mM MgCl₂、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、 各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP以及Taq DNA聚合酶(Nippon Gene公司生产)40单位/ml的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为 反应液。

将在20μl反应液中加了各稀释系列的DNA样品1μL后的溶液作为 PCR用样品，将该样品溶液加到96孔反应板(Applied Biosystems Japan 公司生产)的孔中，使用TaqMan^T M PCR专用热循环仪检测器(ABI7500、 Applied Biosystems Japan公司生产)进行实时PCR。反应于95℃保温10 分钟后，按照95℃15秒、60℃1分钟的反应为一个循环，反复进行50个 循环，每1循环都测定报告色素的发光量。而发光量可用测定中使用的热 循环仪将供测定的96孔反应板每块板相对的荧光强度比数值化的功能求 得。

(5)结果

由得到的实验数据根据实时PCR法中运用的常规方法做成校正曲线。

对于每个PCR用DNA样品，制作将报告色素的发光量(Rn、y轴)对 PCR的各循环数(x轴)作图的扩增曲线。然后，选择发光量呈指数函数 扩增的Rn部，引入临界线(Threshold line)(Th)。Th和各个PCR用 DNA试样的扩增曲线的交叉点为临界循环(Threshold cycle)(Ct)值。然 后将Ct值(y轴)对所用的各PCR用DNA样品的拷贝数的对数值(x轴， 对数值)作图，可将相对于各Ct得到的近似曲线作为校正曲线。得到的校 正曲线如图7所示。

y＝-3.348x+32.61

R²＝0.995

以上实验可判定由于通过实时PCR可检测发光，所以通过在PCR中 使用本发明涉及的寡核苷酸作为引物，由成为其扩增区域的序列设计标记 探针，进行实时PCR，可以检测堪萨斯分枝杆菌。

而根据能够做成校正曲线，可判定如果通过使用本发明的引物和探针 的实时PCR法，堪萨斯分枝杆菌的定量是可能的。另外，由图7可知如果 利用使用本发明的引物和探针的实时PCR法，即使作为初期量存在2个拷 贝的堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA的条件下，堪萨斯分枝杆菌的检测也 是可能的。

另外，在利用实时PCR法时，由于对该荧光强度可实时监测，所以可 对模板DNA的初期量正确定量，可有效进行堪萨斯分枝杆菌的检测。

产业上利用的可能性

通过使用本发明的引物或/和探针的堪萨斯分枝杆菌的检测方法，与通 过现有的菌的培养检查等鉴定菌种的方法比较，可极其迅速且高精度地进 行堪萨斯分枝杆菌的检测。另外通过使用本发明的检测方法进行堪萨斯分 枝杆菌的检测，与现有的通过使用引物或/和探针的PCR法的诊断方法比 较，有可能排除诊断上的假阳性，可更高精度地进行堪萨斯分枝杆菌的检 测和诊断。另外，通过使用本发明的检测方法，可起到也能够进行堪萨斯 分枝杆菌菌体定量的效果。

【序列表】

D：\F-1665.txt