一种同时分离王不留行黄酮苷和王不留行总皂苷的分离方法

摘要

一种同时分离王不留行黄酮苷和王不留行总皂苷的分离方法，属于中药有效物质提取领域。本发明提供一种可同时分离和制备王不留行黄酮苷和王不留行总皂苷的方法，用含水有机溶剂来提取王不留行脱脂干粉，并将提取液过滤，浓缩，干燥后继续用大孔树脂进行分离和制备，洗脱液经浓缩，干燥而成。本发明首次用一种方法同时制备王不留行中对人微血管内皮细胞的增殖具有相反作用的两种组分，分离效率比较高，分离得到的王不留行黄酮苷和王不留行总皂苷提取物可用于药物，食品，保健品和/或化妆品等用途。

说明书

技术领域

本发明涉及中药有效物质提取的技术领域，采用乙醇回流提取，HPD-100大孔树脂分离的方法一步同时获得王不留行中王不留行黄酮苷和王不留行总皂苷，并评价、比较了这两类组分对新生血管生成方面的作用。 

背景技术

中药回流提取法是用乙醇等易挥发的有机溶剂提取原料成分，将浸出液加热蒸馏，其中挥发性溶剂馏出后又被冷却，重复流回浸出容器中浸提原料，这样周而复始，直至有效成分回流提取完全的方法。回流提取可以将中药中的有效成分很好地提取出来，又可以尽量避免部分杂质的溶出。通过选择不同溶剂可以针对性的提取出所需组分，或者改变溶剂的浓度更多的提取出有效成分，减少杂质的溶出。采用乙醇回流提取时，可以减少溶剂的添加量，也可以回收乙醇，减少成本，这种方法已经成为现阶段提取中药有效成分的常规方法。 

大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，故可根据所需提取物质的极性，以及与大孔吸附树脂吸附性能的强弱来选择合适的大孔树脂和相应的洗脱溶剂将混合物中目标组分与非目标组分进行分离。大量研究报告表明，大孔树脂内部具有三维空间立体孔结构，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用，近年来在我国也已广泛用于中草药有效成分的提取、分离、纯化工作中。本发明涉及的HPD-100型大孔树脂为非极性大孔树脂，主要适用于天然产物中皂苷和黄酮苷的提取分离。 

王不留行是中国药典一部收录的一味常用中药，为石竹科植物麦蓝菜Vaccaria segetalis(Neck.)Garcke.的干燥成熟种子，具有活血通经，下乳消肿，利尿通淋等功效，用于经闭，通经，乳汁不下，乳痈肿痛，淋证涩痛等症[1、国家药典委员会.中国药典第一部，中国医药科技出版社，北京，p49.]。王不留行的药用部位，具本草记载，多系根，茎，叶，花与种子并用，而目前则用种子。王不留行中主要含有三萜皂苷，黄酮苷，环肽，类脂和脂肪酸，单糖等。[2、李帆，梁敬钰.王不留行的研究进展[J].海峡药学.2007，19(3)]。前期研究发现，王不留行中存在对新生血管生成具有相反作用的不同物质，因此，选择合适的分离方法将这两种对血管生成具有相反作用的物质分离开具有较好的现实意义。所以本发明采用乙醇回流提取，HPD-100型大孔树脂分离的方法一步同时获得这两类组分，并对其进行理化性质的鉴定和对新生血管生成作用的活性检测，以期后续对这两类组分加以综合利用。 

新生血管在人体正常发育和许多疾病的发生发展中发挥重要作用，具有抑制或促进血管生成作用的物质在医药、食品、保健品、化妆品等领域中均具有良好的应用前景和巨大的市场需求。例如，在治疗心血管疾病的过程中，可以通过在缺血心肌已有的血管床上促进内皮细胞发芽并长出新枝形成血管网，从而有效的改善心血管疾病的生命体征。肿瘤生长到一定阶段也必须依赖相关的血管才能完成其生长，扩散和转移的恶性行为，因此通过抑制肿瘤新生血管的生长来治疗肿瘤已成为国内外众多药学工作者的研究热点。而血管内皮细胞的增殖是促使新生血管生成的首要条件，所以本发明选用的HMEC细胞，即人微血管内皮细胞，以其体外细胞增殖率为生物学活性评价模型，来评价所得组分对新生血管生成的影响是可行的方法 之一。 

发明内容

本发明的目的是获得一种能够从王不留行中同时获得王不留行黄酮苷和王不留行总皂苷分离方法。 

本发明所涉及的工艺参数为：将王不留行药材粉碎，加4倍石油醚脱脂两次，每次12小时，挥干溶剂后，脱脂药材加10倍体积70％乙醇回流提取两次，每次2小时，所得提取液经过滤后旋转浓缩至干，加水复溶后经减压真空干燥得干粉。所得提取干粉后续采用HPD-100型大孔树脂进行分离，具体操作是待样品上柱吸附2小时后，依次用6倍柱体积去离子水，10％乙醇，30％乙醇和70％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为4ml/min。收集洗脱液并经旋转浓缩和真空干燥得干粉，其中，30％乙醇洗脱组分即为王不留行黄酮苷组分，70％乙醇洗脱组分即为王不留行总皂苷组分。 

本发明的有益效果： 

本发明所述工艺可以同时从王不留行中分离得到对血管新生具有相反作用的两种物质，分离效率比较高，对于今后这两种对新生血管具有相反作用的物质规模化生产和综合利用提供了技术支持。 

附图说明

图1和图2分别涉及实施案例2和实施案例3中有关的王不留行黄酮苷的检测和相关组分细胞活性的测定。图1为用高效液相色谱法检测30％乙醇洗脱组分和70％乙醇洗脱组分中是否含有王不留行黄酮苷，(1：HPD-100 70％乙醇洗脱组分检测图 2：HPD-100 30％乙醇洗脱组分检测图 3：王不留行黄酮苷标准品检测图)。图2为王不留行黄酮苷组分和王不留行总皂苷组分对人微血管内皮细胞体外增殖率的影响。 

具体实施方式

实施例1：王不留行样品的回流提取方法和HPD-100型大孔树脂分离 

100g王不留行脱脂干燥粉末用1000ml 70％乙醇回流提取两次，每次2小时，冷却后，过滤，旋转蒸发至干，去离子水复溶，真空干燥得干粉，备用。将HPD-100型大孔树脂用95％乙醇浸泡后湿法装柱，径高比为1∶7。先用95％乙醇洗至洗脱液与2倍去离子水混合后不显浑浊后，继续用去离子水洗柱，待洗脱液中无乙醇味时，备用。将上述制得的王不留行干粉加去离子水溶解，精密吸取王不留行样品液20ml(0.013g/ml)上柱(18cm×2.5cm)，吸附两小时后，依次用6倍柱体积蒸馏水，10％乙醇，30％乙醇，70％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为4ml/min。将大孔树脂各醇洗脱组分旋转蒸发至干，加水复溶，真空干燥，得干粉，备用。其中，30％乙醇洗脱组分的提取率为1.32％((洗脱组分干粉质量/药材脱脂干粉质量)×100％)，70％乙醇洗脱组分的提取率为2.02％((洗脱组分干粉质量/药材脱脂干粉质量)×100％) 

实施例2：HPD-100型大孔树脂30％乙醇洗脱组分和70％乙醇洗脱组分的定性鉴别 

2.1王不留行黄酮苷的检视： 

根据中国药典2010版第一部中HPLC方法检测王不留行黄酮苷的条件，对HPD-100型大孔树脂30％乙醇洗脱组分中王不留行黄酮苷进行检视，具体色谱条件为：以甲醇为流动相A，以0.3％磷酸溶液为流动相B，检测波长为280nm；按下表中的规定进行梯度洗脱。 

表1高效液相色谱法检测王不留行黄酮苷的流动相洗脱梯度表 

时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0～10 35 65 10～20 35→40 65→60 20～35 40→50 60→50

按上述HPLC检测条件，以王不留行黄酮苷为对照品，对HPD-100型大孔树脂30％乙醇洗脱组分和70％乙醇洗脱组分进行检测，检测结果在图1中显示。 

图1结果显示，王不留行黄酮苷标准品的保留时间为8.693min，王不留行黄酮苷在HPD-100型大孔树 脂30％乙醇洗脱组分中得到富集，在70％乙醇洗脱组分中没有被检测到。 

2.2总皂苷的定性反应选取下述3个反应进行： 

2.2.1、泡沫实验：取适量上述大孔树脂洗脱组分加水溶解，强烈振摇后，能产生持久性泡沫则为阳性反应。 

2.2.2、醋酐-浓硫酸反应：取适量上述大孔树脂洗脱组分溶于醋酐中，加浓硫酸-醋酐(1∶20)，产生黄、红、紫、蓝等颜色变化，最后褪色的则为阳性反应。 

2.2.3、氯仿-浓硫酸反应：取适量上述大孔树脂洗脱组分溶于氯仿中，加入浓硫酸后，在氯仿层呈现红色或蓝色，氯仿层有绿色荧光出现的则为阳性反应。 

实验结果如下表。 

表2大孔树脂各组分皂苷定性检测结果 

注：“-”为阴性反应；“+”为阳性反应。 

根据表2结果可以确定，HPD-100型大孔树脂30％乙醇洗脱组分为王不留行黄酮苷组分，70％乙醇洗脱组分为王不留行总皂苷组分。 

实施例3：细胞活性评价 

取对数生长期HMEC-1细胞，按每孔8000个细胞接种于96孔板中，放置于37℃、50ml/LCO₂的培养箱中培养24h，加入HPD-100型大孔树脂30％和70％乙醇洗脱组分作用时间48h，以不加药组为阴性对照组，每组同时设3个复孔，每批样品重复3次试验。加药后培养至72h，去上清液，每孔轻轻加入100g/L三氯醋酸100μl固定，静置5min后移到4℃再放置40min，倾掉固定液，用去离子水洗5遍，空气干燥。每孔加入4g/L乙酰磺酰明B(SRB)100μl室温放置30min，用10ml/L醋酸液洗5遍，加入150μl10mmol/L Tris碱液(pH10.5)溶解，用MK3型酶标仪在波长A540处测定每孔A值。抑制率＝[(对照组的A值-药物组的A值)/(对照组的A值-空白组的A值)]×100％。 

对上述所得到的HPD-100型大孔树脂30％乙醇洗脱组分和70％乙醇洗脱组分活性检测结果在图2中显示。 

结果表明，HPD-100型大孔树脂分离收集到的30％乙醇洗脱组分，即王不留行黄酮苷组分具有促进内皮细胞增殖的作用，70％乙醇洗脱组分，即王不留行总皂苷组分有抑制内皮细胞增殖的作用。 

本发明是结合实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说，显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的，即所有上述这些等价形式和所有对工艺参数的改进和变动都同样属于本发明的权利要求书所限定的范围。