用于检测弗氏枸橼酸杆菌的靶基因及检测试剂盒

摘要

本发明提供了用于检测弗氏枸橼酸杆菌的靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了实时荧光定量PCR引物和探针，引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4。本发明还提供了检测弗氏枸橼酸杆菌的试剂盒。本发明的检测方法及其试剂盒具有检测准确、灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测弗氏枸橼酸 杆菌的靶基因以及检测该基因的引物和探针，本发明还涉及利用该 引物和探针进行弗氏枸橼酸杆菌检测的试剂盒。

背景技术

弗氏枸橼酸杆菌（Citrobacter freundii）属于枸橼酸杆菌属，肠 杆菌科。革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，周身鞭毛，菌毛，无芽胞，无 荚膜。弗氏枸橼酸杆菌广泛存在自然界，是人类和动物肠道的寄生菌。 已有文献报道它可引起原发和继发的感染。弗氏枸橼酸杆菌可以在正 常人和动物的粪便以及环境中分离到。然而，研究者逐渐认识到弗氏 枸橼酸杆菌可以引起腹泻和其他感染如：尿道感染、脑膜炎、脓毒症 以及医院获得性感染。

与其他肠道病原菌如大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌等相比，弗 氏枸橼酸杆菌很少被报道引起腹泻等肠胃炎。这可能与临床样本筛查 中，很少将弗氏枸橼酸杆菌作为常规筛查的菌株。但是，弗氏枸橼酸 杆菌也能引起一些偶发和爆发的病例。弗氏枸橼酸杆菌也引起类似大 肠杆菌引起的重症肠胃炎。Tschape等报道弗氏枸橼酸杆菌在德国的 一家托儿所和幼儿园引起的暴发，造成肠胃炎152例，其中8例发展为 HUS。Ibenyassine等对食品进行调查发现食品中发现弗氏枸橼酸杆菌 的检出率可达18.7%，我国的多个研究中也表明食品中弗氏枸橼酸杆 菌也有较高的分离率。在我国，一些食物中毒或腹泻病人的粪便标本 中，不能分离到常见的致病菌，却能分离到弗氏枸橼酸杆菌。弗氏枸 橼酸杆菌也可能是院内感染最重要的致病菌之一，2002年在日本名古 屋的一所医院外科发生了耐三代头孢的弗氏枸橼酸杆菌感染的小型 暴发。研究提示弗氏枸橼酸杆菌可能是一种尚未被人们充分认识的肠 道病原菌。

在感染性腹泻病原菌检测过程中，往往忽略对弗氏枸橼酸杆菌的 检测，且目前没有特异的弗氏枸橼酸杆菌的筛选培养基。弗氏枸橼酸 杆菌很难和其他肠道菌区别，目前只能通过生化鉴定来进行分开。然 而生物鉴定费时费力，不利于临床对病原菌快速检测的要求。

近年来，实时荧光TaqMan PCR技术（real time TaqMan PCR, TaqMan是罗氏公司的注册商标）广泛应用于多种病原微生物的检测， 与普通PCR方法相比较，实时荧光TaqMan PCR技术在普通PCR的基 础上加入一条特异的荧光探针，并且该技术对引物与模板的同源性要 求也高于普通PCR。实时荧光TaqMan PCR中的探针序列必须与目标 序列完全匹配，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，但在PCR扩 增时，随着引物的延伸Tag酶的5’到3’外切酶活性将探针酶切降解，使 报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接受到荧光 信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信 号的累积与PCR产物形成完全同步。因此实时荧光定量PCR方法比普 通PCR法具有更高的特异性。但是在荧光TaqMan PCR技术的应用中， 探针的选择是一个重要因素，因为其涉及到与引物的匹配，以及最关 键的检测特异性的问题。

目前，在国内外研究中，没有对弗氏枸橼酸杆菌进行荧光定量 PCR检测方法的报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供用于检测弗氏枸橼酸杆菌的靶基 因。

本发明的第二个目的在于提供针对上述靶基因的特异性引物和 探针；

本发明的第三个目的在于提供检测弗氏枸橼酸杆菌的试剂盒。

基于以上目的，本发明对弗氏枸橼酸杆菌的TTRP基因与NCBI上 公布的其他细菌的核苷酸序列进行反复比对和筛选，发现弗氏枸橼酸 杆菌的TTRP基因仅与沙门氏菌同源性较高，同源性达到84%，其核 苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。而且该基因在100bp-650bp之间特异 性很高，具有高度的保守性，可以很好的区分弗氏枸橼酸杆菌与其相 近的沙门氏菌和枸橼酸杆菌属的其他种。

本发明针对弗氏枸橼酸杆菌的一个三羧酸循环调控基因(简称 TTRP)特有序列设计引物和TaqMan探针，并将获得的特异性引物和探 针在NCBI数据库进行比对，以排除引物-探针与其他物种序列可能存 在的非特异性匹配，最终获得优化后的引物、探针序列。

进一步，本发明提供用于特异性扩增上述靶基因序列或其特异片 段的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。其中探针的5’标记 荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1。上游引物选自于TTRP基因的 第211到229位核苷酸。下游引物选自TTRP基因的第104到126位 核苷酸。

本发明提供的优选的引物序列为：

上游引物：GCAGGACAGGAAGCGTCTG，

下游引物：CAGCCGACCATCTTTTACATAGC。

探针序列序列为：

FAM-AGCCGCTGAACGACTTCCAGACCA-BHQ1

本发明提供一种弗氏枸橼酸杆菌的实时荧光定量PCR检测方 法，包括以样品总DNA为模板，利用本发明提供的引物和探针进行 实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲 线判定结果。

本发明提供了一种用于检测弗氏枸橼酸杆菌的试剂盒，其包括 上述能特异地扩增出如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或其特异性片 段的特异性引物以及配合引物使用的Taqman探针。

本发明试剂盒的引物序列为：

上游引物：GCAGGACAGGAAGCGTCTG，

下游引物：CAGCCGACCATCTTTTACATAGC。

探针序列序列为：

FAM-AGCCGCTGAACGACTTCCAGACCA-BHQ1

本发明提供的试剂盒，还可进一步包括DNA裂解液，荧光定量 反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性 模板为弗氏枸橼酸杆菌基因组DNA。

本发明的试剂盒，其20μL总工作体系为：

其工作程序为：95℃预变性30sec，1个循环；95℃变性5sec， 60℃退火30sec，40个循环。

本发明还提供了含有上述引物和探针的诊断试剂。

本发明每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中 两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值<35.0时样品结果为阳性；

Ct值≥40.0的样品结果为阴性；

Ct值在35.0~40.0之间时，样品需要重复，重复试验如Ct值依然低于40 判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

本发明提供的用于检测弗氏枸橼酸杆菌的特异性引物和探针， 建立了检测弗氏枸橼酸杆菌的荧光定量PCR方法，是首次将荧光探 针运用到了弗氏枸橼酸杆菌的检测，与普通PCR相比，实时荧光 TaqMan PCR方法主要有三个优点：1.实时荧光TaqMan PCR检测 方法比普通PCR方法的灵敏度高，最低可以检测到10¹拷贝/μL的 质粒标准品。2.实时荧光TaqMan PCR对样本检测所需时间短，整 个反应在2小时内完成，降低了检测成本。3.实时荧光TaqMan PCR 方法的特异性更好，TaqMan探针的使用避免了非特异性扩增。

附图说明

图1为普通PCR方法对质粒标准品检测灵敏度的电泳图；图中泳道 M分子量Marker DL2000;泳道10为阴性对照；泳道1-9分别是模板量为 1.0×10⁸～1.0×10⁰拷贝/μl的质粒标本。

图2中a图为实时荧光TaqMan PCR对质粒标准品的扩增曲线图；图 中1-7是模板量依次为1.0×10⁸～1.0×10²拷贝/μl的质粒标本；NTC 是阴性对照；b图为实时荧光TaqMan PCR对质粒标准品的扩增的标准 曲线。

图3为实时荧光TaqMan PCR对牛奶模拟标本的扩增图；图中1-7 是模板量依次为1.0×10⁸～1.0×10²cfu/ml的菌量；NTC是阴性对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。实施例中使用的试剂和仪器如下：热启动DNA聚 合酶TaKaRa Ex Taq HS及Buffer(Premix Ex TaqTM Kit)购自宝生物 工程（大连）有限公司。无DNA酶和RNA酶超纯水 （UtraPureTMDnase/RNase-Free Distilled Water）购自美国 InvitrogenGIBCO公司。细菌基因组DNA抽提试剂盒（Genomic DNAPurification Kit）购自Promega公司。PCR产物胶回收 试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit），购自德国Qiagen公司。PCR 产物克隆试剂盒购自宝生物工程（大连）有限 公司。Marker DL2000Marker和EasyDilution均购自宝生物工程（大 连）有限公司。其余试剂均为市售分析产品。PCR仪为Sensoquest Labcycler购自德国Sensoquest公司，离心机为Eppendorf5415D购自 德国Eppendorf公司，电泳设备购自北京君意东方电泳设备有限公 司；凝胶成像仪为Bio-Rad Gel Doc XR购自美国Bio-Rad公司；Rotor Gene Q实时荧光定量PCR仪购自德国QIAGEN公司。

实施例1弗氏枸橼酸杆菌特异DNA序列的确定

本发明对弗氏枸橼酸杆菌的TTRP基因与NCBI上公布的其他细 菌的核苷酸序列进行反复比对和筛选，发现弗氏枸橼酸杆菌的TTRP 基因仅与沙门氏菌同源性较高，同源性达到84%，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。而且该基因在100bp-650bp之间特异性很高，具有 高度的保守性，可以用于区分弗氏枸橼酸杆菌与其相近的沙门氏菌和 枸橼酸杆菌属的其他种。

实施例2弗氏枸橼酸杆菌特异性引物和探针的设计

本发明经反复筛选和验证，得到一对用于检测弗氏枸橼酸杆菌 的荧光定量PCR引物和与引物配合使用的TaqMan探针，由上海基 康生物公司合成。该探针5’标记荧光基团（FAM），3’标记淬灭基 团（BHQ1）。

本发明得到的引物序列为：

上游引物：GCAGGACAGGAAGCGTCTG，

下游引物：CAGCCGACCATCTTTTACATAGC。

探针序列序列为：

（FAM）-AGCCGCTGAACGACTTCCAGACCA-（BHQ1）。上 述引物扩增的特异性片段总长为126bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。经测序鉴定，确认该序列属于弗氏枸橼酸杆菌TTRP基 因。

实施例3弗氏枸橼酸杆菌基因组DNA质粒标准品的构建

1、细菌基因组DNA的抽提

细菌基因组DNA的抽提使用Promega公司的DNA Purification Kit，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定 细菌基因组DNA的纯度和浓度，弗氏枸橼酸杆菌ATCC43864基因组 DNA用EasyDilution缓冲液稀释至3×10⁵~5×10²pg/ul的浓度梯度，阴性 对照用EasyDilution缓冲液稀释至3×10⁵pg/ul，基因组DNA均少量分 装，-20℃保存备用。

2、普通PCR反应体系的建立

普通PCR反应20μl体系如下：

PCR反应条件：

反应结束后，取5μl PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳， 并在凝胶成像系统上观察分析结果。

3、质粒标准品的构建与制备

(1)以实施例2中的引物对弗氏枸橼酸杆菌基因组DNA进行PCR，扩 增目的基因126bp；（2）切胶回收，纯化PCR产物；（3）连接到T载 体；（4）转化JM109感受态细胞；（5）筛选阳性克隆子，用PCR进行 验证，最终测序确认为TTRP基因；（6）提取质粒，根据质粒的分子 量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度；每μl样品中检测基因的拷贝数 =浓度（ng/μl）×阿佛加德罗常数×10^-9／（660×重组质粒碱基数）。 （7）用EasyDilution将上述质粒依次稀释成1.0×10⁰～1.0×10⁸拷贝／μ l，共9个浓度梯度。

将质粒梯度稀释进行普通PCR扩增显示，当每反应体系中TTRP特 定序列重组质粒的模板数降到10⁴拷贝/μl以下，普通PCR扩增后电泳 图上未出现目的条带，阴性对照也未见扩增条带(图1）。

实施例4检测弗氏枸橼酸杆菌的荧光定量PCR检测方法的建立

采用实施例2的引物和探针，以实施例3中的弗氏枸橼酸杆菌 基因组DNA为模板，以实施例3制得的质粒标准品为阳性对照，以 无核酸双蒸水为阴性对照，建立荧光定量PCR检测体系。

其20μL总工作体系为：

其工作程序为：95℃预变性30sec，1个循环；95℃变性5sec， 60℃退火30sec，40个循环。扩增结束后，扣除本底荧光信号后取 同一阈值分析数据，确定各样本的Ct(cycle threshold)值。

每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对 照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值<35.0时样品结果为阳性；

Ct值≥40.0的样品结果为阴性；

Ct值在35.0~40.0之间时，样品需要重复，重复试验如Ct值依 然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

实施例5弗氏枸橼酸杆菌荧光定量PCR检测方法的特性评价

1、灵敏度评价

取质粒标准品1.0×10⁰～1.0×10⁸拷贝／μl，共9个浓度梯度作为模板 进行实时荧光PCR检测。结果当质粒标准品浓度为1.0×10⁸～1.0×10⁰拷贝/μl时，均有阳性扩增。而且当质粒标准品浓度为1.0×10⁸～1.0× 10²拷贝/μl时，在该PCR检测体系中，靶基因扩增反应的Ct值与模板 浓度之间均存在良好的线性关系，相关系数为0.998（见图2）。

2、最低检测限

为了更好的评价该PCR检测体系的检测下线，本发明对质粒标 准品浓度为1.0×10²～1.0×10⁰拷贝/μl三个稀释浓度分别进行了4 次平行实验。结果1.0×10²~1.0×10⁰拷贝/μl的4次反应均有检测 信号，但是1.0×10⁰拷贝/μl质粒标准品的检测ct值在35.0~40.0之 间。因此本发明的检测下限为1.0×10¹拷贝/μl。

由此可见，本发明建立的实时荧光PCR检测体系对弗氏枸橼酸杆菌 质粒标准品的检测灵敏度比普通PCR方法高1000倍。

3、特异性评价

又称真阴性率评价，即实际上不是弗氏枸橼酸杆菌，而按照该 检测方法的标准被正确地判为非弗氏枸橼酸杆菌的百分比。用优化 了的real-time PCR检测杨氏枸橼酸杆菌、布氏枸橼酸杆菌、科氏枸 橼酸杆菌、罗氏枸橼酸杆菌、肠产毒素型大肠埃希菌（ETEC）、肠 侵袭型大肠埃希菌(EIEC)、肠致病型大肠埃希菌（EPEC）、肠出血 型大肠埃希菌（EHEC）、肠集聚型大肠埃希菌（EAEC）、阪崎肠杆 菌、丹增李斯特菌、粘质沙雷菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、福 氏志贺氏菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌和产气肠杆菌为本科 室保存或购自ATCC菌种库。用于特异性检测的其他细菌核酸由中 国疾病预防控制中心传染病预防控制所各科室提供，包括甲型副伤 寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门菌、羊布鲁氏菌、流感嗜 血杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、巴尔通体、结核分枝杆菌、金黄色 葡萄球菌，细菌的来源见表1为模板评价本发明的实时荧光TaqMan PCR体系的特异性。实施例3制得的弗氏枸橼酸杆菌基因组DNA 质粒标准品为阳性对照，结果除阳性对照扩展外，其余检测结果均 为阴性。说明本发明的检测弗氏枸橼酸杆菌的实时荧光TaqMan PCR 方法的特异性为100%。

表1实验菌株及TTRP检测结果

4、重复性评价

4.1批内可重复性评价

每个检测标本、质粒标准品的各个浓度梯度、阴性对照和阳性 对照每次实验均设三个平行。结果每个样品的平行性很好。

4.2批间可重复性评价

用质粒标准品进行该PCR检测体系的灵敏度检测时，我们进行 了3次平行的独立实验。均得到相同的结果。为了更好的评价该PCR 检测体系的检测下线，我们对质粒标准品浓度为1.0×10²～1.0×10⁰拷贝/μl三个稀释浓度分别进行了4次平行实验。结果为1.0× 10²~1.0×10⁰拷贝/μl的4次反应均有检测信号，但是1.0×10⁰拷贝 /μl质粒标准品的检测ct值在35.0~40.0之间。

实施例6检测牛奶标本中的弗氏枸橼酸杆菌

取弗氏枸橼酸杆菌甘油菌1支，接种环蘸取一环接种于LB培养 基，37℃过夜培养。接种于5mL LB培养液中，37℃过夜，取1mL菌 液与9mL PBS培养液混匀，为10⁹稀释，依此稀释至10¹。取10⁴、10³、 l0²、10¹四个稀释度的菌液涂板，每个稀释度平行涂两板，37℃培养 24h后进行菌落计数。将各个稀释度的菌液污染牛奶：取1mL牛奶， 加入0.1mL各个稀释度的菌液，取100uL奶样分别加人0.05mg蛋白酶 K、50uL 0.1％Triton X-100，混匀，37℃30min，加入900uL 150mmol ／LNaCI，反复混匀，13000r／min离心10min，小心弃去上清，取 沉淀用100uL 150mmol／L NaCI重悬。用试剂盒提取基因组DNA，3 个平行样品按照实施例4的方法进行。结果见图3。

当1ml牛奶加入的菌量为1.0×10⁸～1.0×10²cfu/ml时用实时荧光 TaqMan PCR体系检测结果显示，在该PCR检测体系中，靶基因扩增反 应的Ct值与菌量稀释度之间均存在良好的线性关系，相关系数为 0.998。提示实时荧光PCR检测体系对牛奶模拟样本中弗氏枸橼酸杆菌 检测下限为1.0×10²cfu/ml的菌量。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明 作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。