一种昆明狼犬精液冷冻液配方及配制方法

摘要

本发明公开了一种可长期保存昆明狼犬精液的冷冻液配方，其组成成分为：三羟甲基氨基甲烷2.4～2.46g、柠檬酸钠1.26～1.27g、双羟乙基一氨基乙烷磺酸1.50g、甘油4ml、葡萄糖2.0～2.126g、家鸽卵黄20ml、加灭菌双蒸水到100ml、青霉素10万单位、链霉素5万单位。为进一步改进犬精液冷冻方法，提高冻配受胎率，本发明通过对不同配方的稀释液、添加不同剂量的不同维生素对解冻后精子活力影响的试验，提供了一种优良稀释液，达到提高冷冻精液精子成活率的目的。

说明书

技术领域

本发明属于精液冷冻液技术领域，尤其涉及一种昆明狼犬精液冷冻液配方及配制方法。 

背景技术

犬是最早被人类驯化的家畜，目前数量最多的也是犬科动物，是世界上外形差异最大、分布最广和品种最多的家畜。人工授精(AI)对犬业的发展至关重要，而人工授精技术的推广依赖于精液的长期保存。与其他动物(如牛、猪)相比，犬人工授精发展的速度缓慢，其主要原因是精液冷冻技术不过关，精液不能长期保存。 

发明内容

针对上述问题，本发明实施例的目的在于提供一种昆明狼犬精液冷冻液配方及配制方法。 

本发明实施例是这样实现的，一种昆明狼犬精液冷冻液配方，其组成成分为： 

三羟甲基氨基甲烷2.4～2.46g、柠檬酸钠1.26～1.27g、双羟乙基一氨基乙烷磺酸1.50g、甘油4ml、葡萄糖2.0～2.126g、家鸽卵黄20ml、加灭菌双蒸水到100ml、青霉素10万单位、链霉素5万单位。 

进一步，pH在6.5～6.8之间。 

进一步，每100ml所述昆明狼犬精液冷冻液配方可加入VB₁₂12ml、复合VB4ml、V_C0.50g。 

进一步，复合VB的组分为：每2ml含B₁20mg，B₂2mg，B₆2mg，烟酰胺30mg。 

进一步，复合VB的添加量为4mL/100mL、V_C的添加量为0.50g。 

为进一步改进犬精液冷冻方法，提高冻配受胎率，本发明通过对不同配方的稀释液、添加不同剂量的不同维生素对解冻后精子活力影响的试验，提供了一种优良稀释液，达到提高冷冻精液精子成活率的目的，为进一步在生产当中提高冷冻精液的品质提供一定参考。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

本发明实施例提供了一种昆明狼犬精液冷冻液配方及配制技术，其组成成分为：三羟甲基氨基甲烷2.4～2.46g、柠檬酸钠1.26～1.27g、双羟乙基一氨基乙烷磺酸1.50g、甘油4ml、葡萄糖2.0～2.126g、卵黄(家鸽)20ml、加灭菌双蒸水到100ml、青霉素10万单位、链霉素5万单位。pH在6.5～6.8之间。每100ml加入VB₁₂12ml、复合V_B(每2ml含B120mg，B22mg，B62mg，烟酰胺30mg)4ml、V_C0.50g更有助于保护精子。 

以下结合具体的试验结果对本发明作进一步的说明。 

1试验材料 

1.1试验动物：昆明狼犬5只、体重20～30kg、年龄2～8岁、健康、体况良好。 

1.2试验试剂：三羟甲基-氨基甲烷、双轻乙基-氨基乙烷磺酸、葡萄糖、乳糖、果糖、柠檬酸、甘油、青链霉素、卵黄、姬姆萨染液、伊红-苯胺黑死活染色液、维生素B₁₂、维生素C、复合维生素B等。 

1.3试验仪器：电光生物显微镜、细胞计数器、恒温箱、离心机、液氮罐、pH试纸等。 

1.4试验地点：四川农业大学动物医学院胚胎工程基地、奶牛疾病康复中 心。 

1.5试验动物处理：试验前2周进行犬瘟热、细小病毒疫苗免疫，适应性单笼饲养，主要以犬粮附以少量生肉及牛杂等定时、定量、由固定饲养员常规饲喂，自由饮水，采精后每只犬补食两枚生鸡蛋。 

2试验方法 

2.1精液的采集 

用拇指和食指握住犬阴茎，轻拉包皮，将龟头球握在手掌内并给予适当压力，待阴茎充分勃起，用集精漏斗收集精液。 

2.2精液品质的常规检查 

2.2.1精液的气味与色泽的检查：无异味、乳白色或淡乳白色者为正常精液；否则均为不正常。 

2.2.2精液的pH值检查：取一小滴精液用pH值为5.0～8.4的精密试纸测定。 

2.2.3精子活力的检查：将精液置于37℃的显微镜下，放大400～600倍镜检，用10级评分法作初步评分。进一步用伊红一苯胺黑死活染色法检测(活精子不着色)。 

精子活率＝呈直线运动精子数/总精子数×100％。 

2.2.4精子密度的测定(血细胞计数法)：血细胞计数法，在400倍显微镜下目测活力，将精液用生理盐水20倍稀释后用血细胞计数板计算密度。 

2.2.5顶体完整率：用姬姆萨染色法，滴压制片，在1000倍显微镜下检测(活精子不着色)。 

精子顶体完整率＝顶体完整型精子数/精子总数×100％。 

1.4.5精子畸形率的检查：用姬姆萨染色法，每样品做两个涂片。在每片左右二个不同部位各数100个精子，用血细胞计数器记录下每个部位的畸形精子数；每样品两个涂片的平均畸形精子数，代表此精液样品的畸形精子数。 

畸形率＝(片1左右部畸形总数+片2左右部畸形总数)/400×100％。 

2.3精液的稀释 

根据原精子的活力、密度等因素采用一步稀释法对精液进行稀释。稀释前，先将稀释液预热到38℃左右。试验中一般将精液密度保持在1.0×10⁸/mL左右，不应过高，这样有利于解冻后精子活力的检测。稀释液现配现用，配好后摇匀，1500r/min离心5min。 

在大量预备试验的基础上，筛选出效果较好的稀释液I、II、III，其配方见表1。 

表1稀释液配方 

2.4精液的降温与平衡： 

把稀释好的精液包上8～16层纱布，转移到4℃的恒温环境中进行降温平衡3.5～4.0h。 

2.5犬颗粒冻精制作 

用泡沫塑料改制成炸熏盒，内设两室：一室内上置铜纱网，下盛液氮，并设一盖子，为“熏室”；另一室内可直接盛放液氮，为“炸室”。将平衡后的精液直接滴于炸室内液氮中，滴后静置5～8s，在移入熏室中加盖熏蒸6min，收集装袋，浸入液氮。 

2.6精液的解冻 

将试管预热到35℃～40℃，从液氮罐内取出颗粒精液迅速投入试管内，轻 轻摇动，待颗粒融化到2/3时，即从水浴中取出，继续摇动使其全部融化。 

3试验结果 

3.1不同稀释液类型对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 

表2所示，I、II、III三种稀释液制作的冻精解冻后活率均大于30.00％，I液的冻后平均活率最高，但I和II液差异不显著(P＞0.05)，都与III液差异显著(P＜0.05)；顶体完整率和畸形率I液优于II、III液，差异显著(P＜0.05)，II液与III液之间差异不显著(P＞0.05)。 

表2不同稀释液类型对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 

注：同列内上标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，上标字母相邻表示差异显著(P＜0.05)，上标字母相间表示差异极显著(P＜0.01)(下同)；以下试验均选择组方I为基础方。 

3.2添加不同剂量的维生素B₁₂对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 

表3可知，随着维生素B₁₂量的增加，解冻后精子的活率、精子顶体完整率变化不大，差异均不显著(P＞0.05)，畸形率以12mL组和16mL组较低，与其他组差异显著(P＜0.05)。 

表3添加不同剂量的维生素B₁₂对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 

3.3添加不同剂量的复合维生素B对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 

复合维生素B(每2mL含B120mg，B22mg，B62mg，烟酰胺30mg)的添加如 表4可知，4mL/100mL组的活率平均高于其他组，与对照组和6mL/100mL、8mL/100mL差异显著(P＜0.05)，顶体完整率与精子活率的结果相似，而精子畸形率以8mL/100mL组最高，与其他组差异显著(P＜0.05)，4mL/100mL、2mL/100mL组最低在23.58～24.15范围内，与其他组差异显著(P＜0.05)。 

表4添加不同剂量的复合维生素B对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 

3.4添加不同剂量的维生素C对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 

不同维生素C(0.25g/2mL)浓度量添加精子平均活率0.50g/100mL组高于其他组(见表5)与1.00g/100mL差异显著(P＜0.05)，同其他添加组及对照组差异不显著(P＞0.05)。顶体完整率以0.50g/100mL、0.75g/100mL组最高，分别为74.58±1.59、74.39±1.78，两组间差异不显著(P＞0.05)，二者均与其他组差异显著(P＜0.05)。精子畸形率以对照组最高31.81±2.30，加入维生素C后，畸形率有所降低，其中0.75g/100mL组最低为25.57±2.49，与对照组差异显著(P＜0.05)。 

表5添加不同剂量的维生素C对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 

3.5犬冷冻精液人工授精 

每只母犬发情从接受交配起进行3次子宫内输精，用自制的输精器，每次输 精量为2.5ml，每次间隔24小时。人工授精试验结果如表6所示，经过子宫输精后鲜精的受胎率为80.00％，冷冻精液受精率为76.00％。 

表6鲜精和冷冻精液授精结果 

4分析与讨论 

4.1选择不同的冷冻稀释液对于犬冷冻精液的品质起着十分关键的作用，试验证明筛选出的3种稀释液均能较好的保持精子的活力，I、II、III三组稀释液制作的冷冻精液解冻后的活率均大于30.00％，稀释液I的活率为最高达到了43.35±0.85，3者均达到了可用于AI冻精的最低标准，对精子复苏后各项指标进行分析，说明这3种配方均能在犬精液冷冻生产中使用。这3种稀释液中的Tris和柠檬酸钠的作用机理是调节精液的pH值，使精子的存活时间延长。对精子的保护作用较为明显。而I、II组之间的精子活力无显著差异(P＞0.05)，说明这两种稀释液对犬精子的保护效果基本相同。其中葡萄糖、果糖、卵黄等提供营养，以补充精子所消耗的能量。一些分子能渗透精子膜到细胞内，参与精子代谢，给精子提供外源性能量，减缓内源性物质的消耗，从而延长精子在外界的存活时间。在前人研究的基础上，本试验均加入了甘油作为超低温保存防低温打击物质，卵黄和糖类在一定程度上也起到了这种作用。由于精液和稀释液都是营养丰富的物质，是细菌等微生物孪生的适宜环境，它们的存在与繁殖在精液保存过程中可能直接影响到精子的活率，所以抗菌素的添加必不可少，一般常常加入青霉素和链霉素，可以达到有效的抗阴性菌和阳性菌的作用。 

4.2通过3种维生素的添加发现能明显提高冻精解冻后的精液品质，利于精液冷冻保存。精子呼吸代谢产生的活性氧族，可氧化精子细胞质膜上的不饱和脂肪酸，使质膜发生不可逆的氧化损伤，丧失流动性，使细胞内酶缺失，引 起DNA损伤。维生素B12作为辅酶能使氧化型(-S-S-型)谷胱甘肽还原成还原型(-SH-型)，-SH-型的谷胱甘肽能还原活性氧族，减少精子质膜的氧化损伤，保护精子质膜的完整性；从试验结果可以看出，解冻后精子的活率平均值都高于对照组，但差异均不显著(P＞0.05)，而且随着维生素B12量的增加，活率变化不大。试验结果表明：添加复合维生素B的量为4mL/100mL较理想，但其活率与对照组差异不显著(P＞0.05)，顶体完整率最高，精子畸形率最低，与对照组差异显著(P＜0.05)。但添加复合维生素B后能提高犬冻后精子活率的理论依据并不清楚，其复杂性和不稳定性还有待于进一步的研究；维生素C一方面作为抗氧化剂清除细胞呼吸而产生的活性氧离子，从而保护精子不受由于冷冻而产生的自由基毒害；另一方面维生素C可促进包括细胞内维生素E在内的一些其他抗氧化剂物质生成。本试验结果得出：0.50g/100mL的维生素C精子活率最高，但与对照组差异不显著(P＞0.05)，顶体完整率最高，精子畸形率低，与对照组差异显著(P＜0.05)，说明适量添加维生素C能保护精子顶体，降低畸形率；而过量添加(1g/100mL)时，品质会降低，可能是因为维生素C是酸性抗氧化剂，过量添加会使稀释液pH值降低、渗透压增大，使精子的顶体和质膜受到损伤。 

5结论 

5.1I、II、III三种稀释液制作的冻精解冻后活率均大于30.00％，I液的冻后平均活率最高，但I和II液，差异不显著(P＞0.05)，III液最低，差异显著(P＜0.05)；顶体完整率和畸形率I液均优于II、III液，差异显著(P＜0.05)，II液与III液之间差异不显著(P＞0.05)。I号稀释液为本试验中最佳稀释液，其冷冻精液解冻后活率可达43.35±0.85。 

5.2在稀释液中添加维生素B₁₂，对解冻后精子的活率、精子顶体完整率变化不大，但平均值都高于对照组，并且随着维生素B₁₂量的增加，精子畸形率有继续降低趋势。 

5.3添加复合维生素B、维生素C对昆明狼犬精子均有较好的保护作用， 但其添加量并非越多越好，以每100ml液体添加复合维生素B4mL、维生素C0.50g添加为宜。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。