一类苯菲啶类生物碱及其抗心血管系统疾病的用途

摘要

本发明属于医药技术领域，涉及一类具有保护心肌细胞作用的新的苯菲啶类生物碱化合物（Ⅰ）及其制备方法和用途。所述化合物中：R

说明书

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，具体是一类苯菲啶类生物碱及其预防与治疗心血管系统疾病的用途。

背景技术：

    心肌血液供求失调所引起的心肌缺血缺氧状态是由于冠状动脉供血不足或心肌耗氧量增加引起的。在发达国家或是发展中国家，由心肌细胞缺血缺氧导致的心脏病(ischemic heart disease，IHD)，均是重要的致死性和致残性疾病，流行性广且危害严重，严重威胁着人类健康。

    既往认为心肌细胞坏死是心肌缺血损伤的病理机制，近年来细胞凋亡在心血管系统疾病(如心衰、心梗、心律失常等)发病机制中的作用逐渐被认识，有研究表明凋亡可能是心肌缺血损伤机制的一个重要环节。因此，改善心肌缺血缺氧环境，促进缺血缺氧状态下心肌细胞的再生，是预防和改善心血管系统疾病的重要策略。

    东北延胡索Corydalis ambigua Cham. et Schlecht. var. amurensisMaxim.为罂粟科紫堇属植物东北延胡索的干燥块茎。《中药志》和《全国中草药汇编》中介绍了其主要分布于东北，作为民间用药，具有活血、散瘀、理气、止痛的功效。早在《雷公炮炙论》中就有“心痛欲死、速觅延胡”，说明在南北朝时期就将其应用于治疗心脏系统疾病。

    据报道，同属植物延胡索中的总生物碱对急性心肌缺血具有改善和保护作用，前人只对东北延胡索镇痛和抗溃疡的作用进行了系统研究。在前期的研究中发现东北延胡索生物碱主成分与延胡索有很大差别，为进一步探讨东北延胡索的新用途，发明人采用活性追踪的方法对东北延胡索（C. ambigua var. amurensis）中的苯菲啶类生物碱化合物进行了分离和保护缺血缺氧心肌细胞活性测试及构效关系研究，发现了具有通式（I）的苯菲啶类生物碱化合物在治疗心肌缺血缺氧等心血管系统疾病中的新用途。

发明内容：

    本发明的目的在于提供一类预防与治疗心脏系统相关疾病的，从植物中提取分离或者通过合成、半合成手段获得的具有通式（I）的苯菲啶类生物碱及其衍生物、立体异构体、其立体异构体的外消旋或非外消旋混合物以及其所形成的在药学上可接受的盐或溶剂化物。

    具有通式(I)的苯菲啶类生物碱的结构如式I所示：

（I）

其中：

R₁至R₆、R₈至R₁₁为氢、羟基、具有1~12个碳原子的链或环烷基、烷氧基或酰氧基、苄氧基、卤素原子、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基和-OCONH₂，R₇为氢、氧或甲基；所述二氢苯菲啶类生物碱R₃与R₄、R₁₀与R₁₁形成双键，N原子为叔或季N形式，R₈为-CH₂COCH₂、O、NH时可与另一分子化合物形成二聚体；上述化合物及其立体异构体、其立体异构体的外消旋或非外消旋混合物。

二氢苯菲啶类生物碱8位立体构型为S时优先，所述取代基R₈为CH₂OH、CH₂COCH₃、OCH₃、OH、CH₃时优选；六氢苯菲啶类生物碱，取代基R₃为OH、CH₃COO、SO₃H或R₁为OH、OCH₃或R₅为OH、OCH₃或R₇为CH₃时优选。上述化合物及其衍生物、其立体异构体、其立体异构体的外消旋或非外消旋混合物，以及其所形成的在药学上可接受的盐或溶剂化物。

    对于本领域的技术人员而言，所述的药学上可接受的盐是指与无机酸如盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、碳酸，有机酸如甲酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、酒石酸、苯甲酸、对甲基苯磺酸、甲基磺酸、萘磺酸、葡萄糖酸，碱金属氢氧化物如氢氧化钠、氢氧化钾，碱土金属如氢氧化钙、氨，胺如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡萄糖胺、三-（羟甲基）-甲胺形成的化学计量形式和非化学计量形式的盐。

在本发明的一些实施方案中，具有通式(I)的苯菲啶类生物碱可以制备成晶形或非晶形，并且如果是晶体，则其可以任选成为溶剂化物，例如作为水合物。本发明在其范围内包括化学计量的溶剂化物（水合物）以及含有可变量溶剂（例如水）的化合物。

本发明在另一方面提供一种药物组合物，采用以单体化合物或者选择其中任意两个或者多个单体以任意比例进行组合的复方形式，其中可含有具有通式(I)的苯菲啶类生物碱、其衍生物、药学上可接受的盐或溶剂化物。

    在本发明的药物组合物中，还可选含有任何适用的药用辅料或载体。该药用辅料或载体是任何适用于制备该制剂的常规药用辅料或载体。

    本发明的药物组合物可以使用各种合适的剂型。该剂型是按照常规方法制成的口服给药的内用剂型及非口服给药的注射剂和外用剂型。

根据本发明的一些实施方案，所述的与心肌细胞缺血缺氧相关的疾病包括心肌梗死、冠心病、心律不齐、心肌炎、气滞血瘀引起的心绞痛等心血管系统疾病。

根据本发明的一些实施方案，具有通式（I）的苯菲啶类生物碱及其衍生物、立体异构体、其立体异构体的外消旋或非外消旋混合物，以及其所形成的在药学上可接受的盐或溶剂化物，亦可用于与心肌细胞缺血缺氧相关疾病的预防和治疗。

在前期的研究中，发明人对由东北延胡索中分离得到的各种生物碱类化合物进行了保护心肌细胞的测试实验和构效关系研究，结果发现只有通式（I）的苯菲啶类生物碱对缺血性心肌细胞和心脏器官具有强烈的保护作用，表明该类生物碱化合物可能会是新型有效的治疗心血管系统疾病的药物。

附图说明：

    图1为化合物1~17在四个不同浓度下对诱导大鼠缺血缺氧心肌细胞保护的存活率实验结果。所有的化合物均能显著增加细胞存活率，每一浓度下重复测定三次。（*p<0.05 VS Control, **p<0.01 VS Control）。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：苯菲啶类生物碱1-17的制备

东北延胡索根茎40.8 kg，粉碎后用80%乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至干得浸膏6.8kg，将浸膏用1%盐酸溶解，调PH3-4，静置12h，滤去沉淀，上清液用氨水调PH10，分别用等体积石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取6次，得石油醚层151.5g，氯仿层263.2g，乙酸乙酯层19.6g，正丁醇层343.9g，对富有生物碱的石油醚层和氯仿层进行硅胶柱色谱分离。将石油醚层通过硅胶柱色谱分离，采用石油醚：丙酮系统洗脱，分成六个馏分A-F，其中馏分C（2.9g）经氧化铝柱色谱（石油醚：丙酮 10:1）、凝胶柱色谱得到次馏分C1、C2，C1经凝胶柱色谱（二氯甲烷：甲醇 1:1）、高效液相制备色谱（甲醇：水 90:10）得化合物7, C2经反复氧化铝柱色谱、高效液相制备色谱（甲醇：水 80:20）得化合物8、9；馏分D（0.8g）经氧化铝柱色谱、凝胶柱色谱得化合物1、4、6；馏分E（10.0g）经氧化铝柱色谱，采用石油醚：丙酮洗脱得次馏分E1、E2，其中E1经凝胶柱色谱（二氯甲烷：甲醇 1:1）得化合物5、11；E2经重结晶（二氯甲烷：甲醇 2:1）和手性制备色谱（Hexane：DCM：IPA =50：20：30）得化合物2、3。将氯仿层通过硅胶柱色谱分离，采用二氯甲烷：甲醇系统洗脱，分成A-D四个馏分，其中馏分A经重结晶得化合物10；馏分B经硅胶柱色谱，采用二氯甲烷：丙酮洗脱，得次馏分B1、B2，其中B1经凝胶色谱（二氯甲烷：甲醇 1:1）、重结晶（二氯甲烷：甲醇 5:1）得化合物14；B2经硅胶柱色谱（石油醚：二氯甲烷：丙酮=5:5:1）得化合物12、13、15。馏分C经硅胶柱色谱（二氯甲烷：丙酮=2:1）、凝胶柱色谱（二氯甲烷：甲醇 1:1）和液相制备色谱（甲醇：水=60:40）得化合物16、17。利用一维、二维核磁共振波谱技术及CD、X-ray方法确定了化合物的平面及立体结构。

实施例1所得具有通式（I）的苯菲啶类生物碱及其¹³C-NMR数据、理化常数数据见附表1~4。

实施例2：实施例1中具有通式（I）的苯菲啶类生物碱化合物对缺血缺氧心肌细胞的保护作用试验

    细胞存活率实验：

采用MTT法测试了苯菲啶类生物碱化合物1-17在缺血缺氧培养条件下，对H₉C₂心肌细胞的体外保护作用（结果见附图1）。活性测试方法如下：

实验设正常组（有血有氧条件）、阴性对照组（无血无氧条件）、阳性对照组（丹酚酸B/Sal B）、和四个不同浓度（0.01, 0.1, 1, 10, 100 μM）的待测样品（化合物1-17）。H₉C₂心肌细胞正常培养至80%-90%融合，胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基配成5×10⁴/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100ul，十字摇匀放入HF-90培养箱，37℃、5%CO₂正常培养24h。实验组更换新的含不同浓度被测样品的无血清DMEM低糖培养液，阴性对照组则更换新的含等体积溶剂的无血清DMEM低糖培养液，每组设3个平行孔，放入HF-100培养箱37℃、5% CO₂、1%O₂培养24h。弃去上清液，加入2倍于培养液的PBS，静置30S，吸去PBS，每孔加80ul无血清DMEM低糖培养基，20ul MTT，放入HF-90培养箱37℃、5% CO₂孵育4h。4h后，每孔加入50ul三联液，第二天用酶标仪在595nm波长下进行检测吸光度值。按下列公式计算药物对心肌细胞存活率的影响：

心肌细胞存活率（%）= A₅₉₅（实验组）/ A₅₉₅(正常组) ×100%

以不同样品浓度为横坐标，以细胞存活率为纵坐标作图，用spss13.0软件中的One-Way ANOVA分析LSD和Dunnett’s T3检验评价实验组与对照组存活率的差异，活性测试结果见附图1。

    细胞外液LDH活性测定：

如细胞存活率实验中所述，取心肌细胞悬液接种到24孔板，每组3孔，取化合物10的四个不同浓度（0.01, 0.1, 1, 10, 100 μM），分组及药物处理同前述。收集各组细胞上清培养液，按照试剂盒要求的方法检测培养液中LDH含量，测定结果见附表6。

    细胞内MDA、ATP酶含量测定：

如细胞存活率实验中所述，取心肌细胞悬液接种到24孔板，每组3孔，取化合物10的四个不同浓度（0.01, 0.1, 1, 10, 100 μM），分组及药物处理同前述。收集各组细胞，用超声波细胞粉碎仪将其破碎，按照试剂盒要求的方法检测细胞内MDA及ATP酶含量，测定结构见附表6。

实施例3：实施例1中具有通式（I）的苯菲啶类生物碱化合物对离体兔心血管作用的实验

离体兔心灌注实验：体重2.0kg 雌雄家兔6只，按照Langendorff氏法灌注心脏，分别从插管注入各化合物0.1mg、0.3mg ，间隔一定时间测定每30s内冠脉流量，同时连续扫描记录心收缩曲线。

测定数据见附表7，结果表明，各化合物均能明显减弱心肌收缩力，表现为心肌收缩曲线的振幅明显降低，而冠脉血流显著增加。

 

注：*p<0.05 VS 阴性对照组, **p<0.01 VS 阴性对照组, ^#p<0.05 VS 阳性对照组(100 μM/L)，与损伤组比较，化合物10在10^-6和10^-5 mol/L时LDH外漏减少，MDA含量显著减少，ATP酶活力显著增加，表明缺氧损伤心肌细胞得到一定恢复。

 

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