一种高效植酸盐降解细菌水拉恩氏菌及其在促进植物生长中的应用

摘要

本发明公开了一种高效植酸盐降解细菌水拉恩氏菌及其在促进植物生长中的应用，该高效植酸盐降解细菌的分类命名为水拉恩氏菌（Rahnellaaquatilis）JZ-GX1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCNO：M2012439，保藏日期：2012年11月6日，保藏地址：中国武汉。本发明的水拉恩氏菌株JZ-GX1，具有较高的植酸酶活性，能够有效降解植酸钙等难溶性植酸盐，并且该菌株还能够产生植物生长素IAA。通过一系列的促生试验表明，与对照相比，该菌株对玉米的发芽和生长，以及对杨树和松树的生长都具有显著的促进作用。本发明为开发玉米、杨树和松树等植物的生物菌肥提供了优良的菌种资源。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株筛选自马尾松根际土壤的高效植酸盐降解菌株水拉恩氏菌JZ-GX1及其在促进玉米的发芽和生长、以及对杨树和松树的生长中的应用。 

背景技术

磷是植物生长所必须的第二大类营养元素，对植物而言，它们能够利用生物固氮功能直接从空气中获得氮素，而磷素则必须通过施用磷肥才能够获得。由于世界上大部分土壤都存在磷肥供应不足的问题，所以化学磷肥每年都被施用到土壤中以缓解磷肥供应不足。虽然施用了大量的化学磷肥，但其绝大部分在土壤中很快就转化为不能被植物直接吸收利用的螯合物，例如在在酸性土壤中与Fe³⁺、Al³⁺或者在碱性土壤中与Ca²⁺形成植物难以吸收利用的植酸铁、铝、钙等螯合物，即植物从肥料中获得的磷是有限的，在当年施用的磷肥中，只有10-20%能够被植物吸收利用。在农、林业生产中，磷供应不足是限制植物生长的关键因素之一。 

磷在土壤中的存在形式有无机磷和有机磷两种，调查显示，在全球土壤中，有机磷含量约占总磷含量的50%，在牧草土壤中甚至高达80%。在中国土壤中，植酸类磷以及它们与金属离子形成的各种形式的衍生物（例如植酸盐等）是土壤中有机磷的主要存在形式，其含量占总有机磷含量的60%，而在一些特殊土壤中，比例可能会达到80%以上。由于土壤中大多数的植酸盐难以溶解，所以能够直接供植物生长利用的磷素是非常匮乏的。为了能够利用植酸盐给植物生长提供所需的营养成分，就必须将其水解成无机磷形式。在植酸盐的水解过程中，植酸酶发挥着主要作用。事实上，土壤中绝大部分的植酸酶都来源于土壤微生物。在植物根际或者根际土壤中分离得到的部分微生物，能够分泌胞外植酸酶降解不同类型的植酸盐，这已得到证实，越来越多的研究表明：在将难溶性的植酸类有机磷水解成能直接供植物生长利用的无机磷的过程中，微生物起着至关重要的作用。此外，植酸盐降解细菌还能够促进植物对各种营养元素的吸收，改善植物的营养条件，促进植株根系的生长，提高植株的产量，增加植株的抗病能力，并且能够有效改良土壤性质，提高土壤有机质含量。因此，注重解磷微生物菌肥在农林业生产中的应用，有望有效保持农林业生产的可持续发展和生态环境平衡。 

在中国农林业生产系统中，玉米、杨树和松树是主要的栽培品种和造林树种。我国玉米常年种植面积达2400万hm²左右，分布在约24个省、市、自治区，位居世界第二，随着畜牧业和玉米加工业的发展，玉米在我国粮食生产中的地位将越来越重要。截止至2010年底，杨树种植面积已经超过了7570万公顷，松树的种植面积则占我国森林面积的23%。现如今，在我国大部分玉米、杨树种植区域，由于其快速生长，消耗了大量的土壤养分，再加上高复种指数，过度垦植，短轮伐期经营，盲目过量施肥等使土壤的生态环境遭到破坏，土壤肥力下降，以致玉米和杨树的生长受到很大影响。因此，施用生物磷肥被认为是能有效增加植物产量，维持土壤生态系统长期稳定发展的有效途径。然而，目前国内有关植物根际高效植酸盐降解细菌的筛选及其在农林业生产实践中的应用鲜见报道。 

发明内容

发明目的：针对目前需要大量的高植酸酶活性菌株为生产高效的生物解磷菌肥提供原材料，而这类高效植酸盐降解细菌却很少的现状，本发明目的是提供一种高效植酸盐降解细菌水拉恩氏菌。此外，本发明的另一目的是提供上述水拉恩氏菌在促进玉米、杨树和松树生长中的应用。 

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为： 

一种高效植酸盐降解细菌，分类命名为水拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）JZ-GX1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO：M2012439，保藏日期：2012年11月1日，保藏地址：中国武汉。 

该水拉恩氏菌株JZ-GX1，分离自广西壮族自治区南宁市广西林科院70年生的马尾松纯林根际土壤，为一株好氧细菌，主要生物学特征如下：在NA培养基平板上，菌落较小、圆形，边缘整齐，中间凸起，表面光滑湿润，半透明，呈亮白色；菌体短杆状，不产生芽孢和荚膜，具有游动性，极生单根长鞭毛；革兰氏染色阴性，KOH试验阳性，过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性，甲基红试验阳性，V.P.试验阳性，柠檬酸盐利用试验阴性，H₂S产生试验阳性，淀粉水解试验阴性，明胶水解试验阴性，吲哚产生试验阴性。 

通过Biolog自动分析系统鉴定，菌株JZ-GX1为Rahnella aquatils，其Biolog可能性为0.992，相似值为0.758，高出鉴定结果的置信范围（相似值≥0.5）。该菌株的16SrDNA基因序列，见SEQ ID NO1。将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，JZ-GX1菌株与水拉恩氏菌菌株 （Rahnella aquatilis）的同源性很高，其相似度都高达99%以上。结合形态、生理生化特征，Biolog自动分析系统鉴定结果和16SrDNA序列分析结果，该菌株被鉴定为水拉恩氏菌（Rahnella aquatilis），鉴定结果准确、可靠。 

上述的高效植酸盐降解细菌JZ-GX1在降解植酸盐中的应用。 

上述的高效植酸盐降解细菌JZ-GX1在促进玉米发芽和生长中的应用。 

上述的高效植酸盐降解细菌JZ-GX1在促进杨树生长中的应用。 

上述的高效植酸盐降解细菌JZ-GX1在促进松树生长中的应用。 

一种高效降解植酸盐类有机磷的菌剂：含有上述的水拉恩氏菌JZ-GX1，菌体浓度为7~8×10⁸cfu/mL。 

有益效果：本发明的水拉恩氏菌JZ-GX1在液体摇培的情况下，与对照菌株相比，表现出较强的植酸酶活性；将JZ-GX1菌株制成菌剂接种玉米、杨树和松树，结果表明，该菌剂能显著促进玉米的发芽和生长，以及有效促进杨树和松树苗木的生长。因此，本发明为玉米、杨树和松树等植物的专用解磷生物菌肥提供了优良的菌种资源。 

附图说明

图1是水拉恩氏菌JZ-GX1降解植酸盐后产生的透圈试验结果图； 

图2是水拉恩氏菌JZ-GX1的植酸酶活性试验结果图；图中所加的误差线为标准误差线，柱形图上不同的字母表示存在显著差异，方差分析结果依据Tukey’sHSD检验，P≤0.01； 

图3是水拉恩氏菌JZ-GX1对玉米种子发芽的促进作用试验结果图； 

图4是经水拉恩氏菌JZ-GX1发酵液浸泡处理的玉米种子发芽率试验结果图；图中所加的误差线为标准误差线，柱形图上不同的字母表示存在显著差异，方差分析结果依据Tukey’s HSD检验，P≤0.05； 

图5是接种水拉恩氏菌JZ-GX1对玉米幼苗各部分生物量的影响试验结果图；图中所加的误差线为标准误差线，柱形图上不同的字母表示存在显著差异，方差分析结果依据Tukey’s HSD检验，P≤0.05； 

图6是水拉恩氏菌JZ-GX1对杨树生长的促进作用试验结果图； 

图7是水拉恩氏菌JZ-GX1对松树生长的促进作用试验结果图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。 

实施例1水拉恩氏菌JZ-GX1的植酸盐降解能力测定试验。 

植酸盐固体筛选培养基：葡萄糖10g，Phytin 4.0g，MgCl₂·6H₂O 5.0g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，KCl 0.2g，（NH₄）₂SO₄ 0.1g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，用0.1MNaOH溶液调节pH至7.0。 

将活化后的JZ-GX1菌株及对照菌株CK（实验室前期筛选保藏的解有机磷细菌YY-SX1）点接到植酸盐固体筛选培养基平板上，将平板放置在28℃的恒温培养箱中培养三天，每个处理3个重复。然后测定各菌株的菌落直径以及透圈和菌落直径，计算其比值，将比值命名为HE。 

结果如表1和图1所示，可初步判断菌株JZ-GX1具有较好的植酸盐降解能力，极显著高于对照菌株，其产生的降解植酸盐的透圈直径（图1黑色箭头所示）高达22.52mm，HE值为3.85，是对照菌株的2.8倍。 

表1水拉恩氏菌JZ-GX1的HE值 

菌株 菌落直径（mm） 菌落和透圈直径（mm） HE值 CK 5.76 8.01 1.39±0.04B JZ-GX1 5.85 22.52 3.85±0.16A

注：HE值后面所加的字母不相同表示差异显著，方差分析结果依据Tukey’sHSD检验，P≤0.01。 

实施例2水拉恩氏菌JZ-GX1的植酸酶活性测定试验。 

NB培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2~7.4。 

植酸盐液体发酵培养基：除不加琼脂外，其他成分与植酸盐固体筛选培养基相同。 

将活化的JZ-GX1菌株和对照菌株（实验室前期筛选保藏的解无机磷细菌YY-SX1）接种至中NB培养基中，30℃，180r/min振荡培养18~24h制成种子液，取0.5mL种子液分别接种于含50mL植酸盐液体发酵培养基的100mL三角瓶中，每个处理3个重复，30℃，180r/min振荡培养72h后，发酵液4℃，10000r/min离心10min，取上清液即粗酶液测定植酸酶活性。酶活性单位（U）定义为：在一定条件下（37℃、pH 5.5），每分钟从0.0076mol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol无机磷所需要的酶量为一个酶活单位，用U表示。 

结果如图2所示，在供试的菌株中，菌株JZ-GX1具有较高的植酸酶活性， 其酶活力高达2.58U/mL，是对照菌株的8.9倍，极显著高于对照菌株。 

实施例3水拉恩氏菌JZ-GX1产生长素IAA测定试验。 

TSB培养基：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl5g，蒸馏水1L，pH7.2~7.4。 

每个摇瓶分装50mL的TSB培养液，然后添加L-色氨酸分别至浓度为0、100、200、300和500μg/mL（L-色氨酸母液：用30-40℃的蒸馏水配制成2mg/mL，用细菌过滤器除菌保存待用）。 

将活化的JZ-GX1菌株接种至NB培养基中，30℃，180r/min振荡培养18~24h制成种子液，取0.5mL种子液分别接种于含50mL TSB培养基的100mL三角瓶中，每个处理3个重复，30℃，180r/min振荡培养，于72h后测定产生的生长素IAA的含量。发酵液4℃，5000r/min离心20min，去除菌体，取1mL上清液与4mL Salkowski’s反应指示剂混合，40℃下显色反应20min后在535nm处测定吸光光度值OD₅₃₅。通过IAA标准曲线确定IAA含量。 

结果如表2所示，由表2可知JZ-GX1菌株具有较强的IAA合成能力，甚至在不添加色氨酸的情况下也检测到有IAA生成。当向培养基中添加色氨酸时，刺激了IAA的产量，在实验设定的范围内，IAA的产量随着色氨酸的添加量增多而升高，当色氨酸的添加量为500ug/mL时，IAA的产量最大，高达10.4ug/mL。 

表2水拉恩氏菌JZ-GX1在不同色氨酸浓度下IAA的产量 

L-色氨酸浓度（ug/mL） IAA产量（ug/mL） 0 0.3±0.78e 100 1.7±0.07d 200 4.0±0.07c 300 5.2±0.07b 500 10.4±0.05a

注：IAA产量值后面所加的字母不相同表示差异显著，方差分析结果依据Tukey’s HSD检验，P≤0.05。 

实施例4水拉恩氏菌JZ-GX1对玉米发芽的促进试验。 

将玉米种子浸泡在70%的乙醇溶液中消毒1min，用无菌蒸馏水冲洗两次，然后再浸泡在5%的NaOCl溶液中消毒3min，用无菌蒸馏水冲洗15次。将表面 消毒风干后的玉米种子浸泡在用无菌生理盐水稀释至浓度为7~8×10⁸cfu/mL的JZ-GX1的发酵液中（对照组单独浸泡在无菌蒸馏水中），浸泡10min，待风干后将种子摆放在1%的水琼脂培养皿中，置于25℃黑暗中培养。每个处理3个重复，每个重复20粒种子。统计玉米种子的发芽率。 

如图3和图4所示，结果表明菌株JZ-GX1能有效提高玉米的发芽率，经JZ-GX1发酵液浸泡处理的玉米种子的发芽率显著高于对照，其发芽率为83.33%，与对照相比提高了43%。 

实施例5水拉恩氏菌JZ-GX1对玉米、杨树和松树生长的促进试验。 

将JZ-GX1活化后，用接种环挑取少量菌体接种于装有50mL NB培养基的100mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养24h。发酵液离心（4℃，10000r/min）10min，去除上清，用无菌生理盐水润洗菌体2~3次后，再用无菌生理盐水调节菌悬液至7~8×10⁸cfu/mL，即为JZ-GX1的液体菌剂。选择生长情况一致的玉米（苗龄10天）、杨树（苗龄270天）和松树（苗龄300天）幼苗进行接种试验，以等量无菌生理盐水为对照（CK），接种量为玉米10mL/株，杨树和松树25mL/株。每处理8个重复，置于温室统一管理，光照为12h，黑暗12h，适时浇水。接种60d后测定玉米的根、茎叶的生物量以及杨树和松树的生长量。 

玉米各部分的生物量如图5所示，接种JZ-GX1菌剂对玉米幼苗的生长有显著的促生作用，玉米根和茎叶部分的生物量相对于对照都有不同程度的显著增加。其中，根和茎叶的干重达0.10g/株、0.47g/株，分别是对照的1.3倍和1.4倍。 

接种JZ-GX1菌剂对杨树生长量的影响如表3和图6所示，从表3可知：接种JZ-GX1菌剂对杨树实生苗的生长具有明显的促生作用。接种处理使杨树实生苗的苗高、地径比对照都有显著增加。其中，苗高为66.8cm，地径为4.80mm，比对照分别增加了17.40%和27.66%。 

表3接种水拉恩氏菌JZ-GX1对杨树生长的影响 

处理 苗高（cm） 增长率（%） 地径（mm） 增长率（%） CK 56.9±3.78b - 3.76±0.22b - 接种JZ-GX1 66.8±3.06a 17.40 4.80±0.11a 27.66

注：苗高和地径后面所加的字母不相同表示差异显著，方差分析结果依据Tukey’s HSD检验，P≤0.05。 

松树实生苗接种JZ-GX1菌剂60d后的生长情况如表4和图7所示。由表4可知接种JZ-GX1菌液后，松树苗高为24.3cm，增长率高达40.46%，地径为2.64mm，与对照相比同比增加了13.30%，均显著高于对照。 

表4接种水拉恩氏菌JZ-GX1对松树生长量的影响 

处理 苗高（cm） 增长率（%） 地径（mm） 增长率（%） CK 17.3±1.1b - 2.33±0.29b - 接种JZ-GX1 24.3±2.05a 40.46 2.64±0.36a 13.30

注：苗高和地径后面所加的字母不相同表示差异显著，方差分析结果依据Tukey’s HSD检验，P≤0.05。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京林业大学

 

<120>  一种高效植酸盐降解细菌水拉恩氏菌及其在促进植物生长中的应用

 

<130>  100

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1400

<212>  DNA

<213>  水拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）JZ-GX1

 

<400>  1

aagtcgagcg gcagcgggaa gtagcttgct actttgccgg cgagcggcgg acgggtgagt     60

 

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