用于神经病症的预后的HMGB1和抗HMGB1抗体

摘要

本发明涉及对获自患者的样品、特别是血清样品或脑脊液样品中所含的具有高迁移率族蛋白I(HMGB1)特异性的抗体进行定量的体外方法，还涉及该方法在神经病症的预后和/或诊断中的应用。这些方法特别可用于监测已知受HIV感染的受试对象的人免疫缺陷病毒(HIV)感染，和用于预后和/或诊断获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的进展状态或朝向AIDS进展的状态、特别是与AIDS相关的神经病症的进展状态或朝向其进展的状态。最后，本发明还涉及确定患者、特别是HIV感染患者的免疫缺陷或免疫活化水平的方法。

说明书

技术领域

本申请涉及对生物样品、特别是血清和脑脊液(CSF)中的蛋白 HMGB1或具有HMGB1特异性的抗体的定量，还涉及其与神经病症进 展状态或朝向神经病症进展的状态、特别是与HIV感染以及与诊断方 法相关的神经病症的进展状态的预后方法的对应相关性。本发明还涉 及蛋白HMGB1或具有HMGB1特异性的抗体与对HIV感染的监测或 与病毒载量的相关性，还涉及对AIDS进展状态的预后方法。

背景技术

在感染后不久，HIV-1能够穿透脑部，最终导致中枢神经系统(CNS) 中与HIV-1相关的并发症。HIV相关性痴呆(HAD)在临床上的特征在 于活动和行为功能障碍，从而导致癫痫、昏迷和发作6个月内死亡。 与HAD在病理上相关的HIV脑炎的特征在于广泛的星形胶质增生、 氧化应激、细胞因子/趋化因子失调和神经元退化(Gonzalez-Scarano和 Martin-Garcia，Nat Rev Immunol 2005,5:69-81)。由于神经元不受HIV-1 感染，目前认为这些细胞间接受到由活化的神经胶质细胞释放的促炎 性趋化因子损害。IP-10(CXCL10)是在星形神经胶质中被上调的神经毒 性趋化因子，且据表明其促进逆转录病毒感染并且介导神经元损伤。 在HIV-感染中，据报道CSF中的IP-10升高，且其水平与CSF HIV病 毒载量相关(Cinque P等，J Neuroimmunol 2005,168:154)。此外据报道， 在CSF巨噬细胞化学吸引性蛋白1(MCP-1或CCL2)水平与具有晚期 HIV感染的经历过HAART的同期组群中的HAD发展之间可能具有相 关性(Sevigny JJ,Albert SM,McDermott MP等，Neurology. 2004;63:2084)。另一个研究报道了血浆MCP-1水平与HIV相关痴呆之 间的相关性(Sevigny等，Arch.Neurol.2007,64:97)。

高迁移率族蛋白I(HMGB1)是非组蛋白染色体蛋白，其在从活化 的巨噬细胞、单核细胞、树突细胞或如NK细胞等其他细胞主动分泌 时充当蛋白促炎性细胞因子。HMGB 1充当炎症触发物从而吸引炎性细 胞，并充当组织修复触发物从而募集干细胞并促进其增殖。而且， HMGB1使树突细胞(DC)活化并促进其功能性成熟以及其对淋巴结趋 化因子的响应。活化的白细胞在微环境中主动分泌HMGB1。因此， HMGB1以自分泌/旁分泌方式起作用，并维持长期修复和防御程序 (Bianchi和Manfredi,2007;Lotze和Tracey,2005)。

在近期研究中，据显示HMGB1会触发受HIV感染的DC中的HIV 复制，由此促进DC中病毒贮存体的构建(Saidi H,Melki M-T,Gougeon M-L,PLoS One 2008)。考虑到DC是粘液感染的起初数小时中HIV的 首要靶标，而DC其后迁移至次级淋巴样器官并在那里将HIV输送至 T细胞，这些发现提出了HMGB1在体内在触发病毒复制和更新病毒 贮存体中的参与的问题。HMGB 1在受HIV感染的DC与活化的NK 细胞之间的交叉交流期间产生，此外还导致HIV感染的DC对NK杀 伤的辅助。DC存活与两种细胞凋亡抑制剂(受感染DC中的c-IAP2和 c-FLIP)的上调相关，后者由HMGB1所诱导(Melki M-T等，PLoS Pathogens 2010,6(4)e1000862)。特定的抑制剂(如甘草甜素或阻断抗体) 对HMGB1的阻断废止了受感染DC中的HIV复制(Saidi H,Melki M-T, Gougeon M-L,PLoS One 2008)，并恢复了受感染DC对NK杀伤的易感 性(Melki M-T等，PLoS Pathogens 2010,6(4)e1000862)。这些发现提供 了HIV如何绑架DC以促进病毒散播和维持贮存体的长期活力的新视 角，且已作为专利申请PCT/EP2009/06828的主题。

这些发现也提出了HMGB1在体内在触发病毒复制和更新病毒贮 存体中的参与的问题。为了应对上述问题，已对在来自HIV感染患者 的血清中的HMGB1浓度进行了定量(Elisa、Shino测试、IBL)，以评 估循环性HMGB1对血浆HIV病毒载量和对疾病进展的体内贡献。而 且，考虑到具有HMGB1特异性的自体抗体可见于如SLE(狼疮)等自 体免疫疾病中(Hayashi等，2009)，开发了一种特异性Elisa测试以检验 是否在HIV疾病中检测到来自HIV感染患者的血清中的抗HMGB1特 异性抗体。

对患者血清中的HMGB1和抗HMGB1抗体的测定已于专利申请 PCT/EP2009/06828中报道。得出了以下结论：

(i)慢性HIV感染触发了HMGB1的产生，后者在来自受感染患者 的血清中以升高水平被检出并进而诱导中和抗体的产生；

(ii)在HMGB1和抗HMGB1抗体(Abs)之间检测到反相关性，从 而表明当HMGB1与所述抗体结合时，其不再在血清样品中被检出；

(iii)血清中的抗HMGB1抗体越多(意味着较早时产生的HMGB1 越多)，则CD4T细胞越少，从而表明升高的血清抗HMGB1抗体水平 与疾病进展相关；和

(iv)强力抗逆转录病毒疗法(HAART)同时降低HMGB1和抗 HMGB1抗体的血清水平并可能将其正常化至低于基线水平。

专利申请PCT/EP2009/06828还提出以下假设：血清中的抗 HMGB1抗体越多，血清病毒载量越小。然而，该假设在所进行的实验 和在更大群体的患者中并未得到验证。事实上，后来据显示专利 PCT/EP2009/06828中公开的于抗HMGB1抗体和血清病毒载量之间确 立的相关性源于从既包含未经治疗患者又包含受治疗患者(治疗对病 毒载量有影响)的患者群体所得到的结果的不当统计分析。

发明内容

本发明针对基于对HMGB1和抗HMGB1抗体的定量以监测HIV 感染和在某些情况下监测病毒载量的方法的问题，还针对HMGB1、抗 HMGB1抗体和趋化因子在AIDS和与AIDS或HIV感染相关的神经病 症的发生的预后方法以及在HIV感染患者的诊断方法中的可能参与的 问题。更一般而言，本发明还涉及基于对HMGB1、抗HMGB1抗体和 可选的趋化因子的定量的对神经病症的进展状态或朝向神经病症进展 的状态的预后方法，还涉及诊断方法。最后，本发明还涉及基于对 HMGB1、抗HMGB1抗体和可选的趋化因子的定量的体外预后方法， 所述方法针对其中据显示涉及HMGB1(例如，其中HMGB1水平高于 健康患者或健康人群的HMGB1水平)的疾病或病症的进展状态。

HMGB1是公知的出现在细胞核中的蛋白，此外还已知其为细胞因 子。HMGB1的物理特性和功能特性公开于Lotze等，Nature Reviews, Immunology 5:351(2005)中，此处通过援引并入其内容。

与HMGB1结合的抗体是已知的且可由本领域公知方法制备。可 商购的抗HMGB1抗体的一个实例是对人HMGB1的兔多克隆一抗 (Abcam ref.18256)，其针对源自人HMGB1的150号残基至其碳端的 KLH缀合合成肽。这些方法包括产生针对HMGB1的多克隆抗体和针 对HMGB1或针对HMGB1的特定片段的单克隆抗体。在治疗性应用 中使用的抗体具有阻断特性，例如，尤其是其会干扰HMGB1诱导的 受感染树突细胞中的HIV复制。这些抗体优选源自与其所施用于和所 识别的受试对象相同的物种，或其被诱导而抵抗其所施用于的相同物 种的HMGB1。这些抗体可以具有不同的同种型，如IgA、IgG或IgM 同种型。也可以采用与HMGB1结合的抗体片段，包括Fab、Fab₂以及 单链抗体或其片段。

本发明涉及用于对获自受试对象的脑脊液样品中所含的HMGB1 具有特异性的抗体、尤其是总抗体进行定量的体外方法，所述方法包 括：(a)如果待定量的抗体是总抗体，则优选采用1.5M甘氨酸在低pH 下通过酸处理对脑脊液样品进行处理，以便使样品中发现的涉及 HMGB1的免疫复合物解离；(b)在任何情况下，将所述生物样品、可 选的是经处理的生物样品与天然HMGB1蛋白或其衍生物接触；和(c) 对具有HMGB1特异性的抗体、尤其是总抗体进行定量。

表述短语“脑脊液”或“CSF”是指占据大脑周围和内部的蛛网膜下 空间和心室系统的液体。CSF占据蛛网膜与软脑膜之间的空间。其构 成脑内的室、池和沟以及脊髓的中央管的内容物。CSF通常通过腰椎 穿刺获取。

在一个优选实施方式中，酸处理由以下组成：将脑脊液样品与具 有低pH(优选为pH 1~3)的酸性解离溶液接触，所述酸性解离溶液被选 用于在所述脑脊液样品中将HMGB1蛋白从与其免疫结合的抗体分离 而不改变该抗体的结合能力。在一个具体实施方式中，酸性解离溶液 为处于低pH、优选为pH 1~3(例如1.85)的甘氨酸(例如1.5M)。然后 用中和缓冲液(如Tris，例如pH9的1.5M Tris)中止酸处理。在另一个 优选实施方式中，不管是否与前述酸处理结合，在20℃~37℃(优选 25℃)进行与酸性解离溶液的温育，并且/或者中和步骤在冰上进行。

在本发明中，术语“定量(quantitating)”涵盖了术语“(对数量)定量 (quantifying)”以及对HMGB1蛋白或特定抗体的合适的信息确定。

“循环”是指残留抗体见于样品、特别是血清或CSF中，即抗体以 非复合形式(与蛋白HMGB)出现。术语“循环”也适用于未经处理而定量 的残留HMGB1蛋白。

“总”是指循环抗体和免疫复合的抗体的总和或综合量。

本申请公开并在CSF中实施的所有方法均可通过类推方式执行， 即类似地用于其它生物样品、特别是血清、血液、血浆、唾液或组织。

在一个具体实施方式中，本发明还涉及用于监测HIV感染的体外 方法，所述方法通过对液体样品中所含的具有高迁移率族蛋白I (HMGB1)特异性的抗体、尤其是具有HMGB1特异性的总抗体进行定 量，其中所述液体样品为获自受HIV感染的受试对象的血清样品和/ 或脑脊液样品，所述方法包括：

a)使所述液体样品与天然HMGB1蛋白或其衍生物接触；和

b)对具有HMGB1特异性的抗体进行定量，其中所检测到的抗 HMGB1抗体的量与感染的预后相关，特别是其中所述相关性与所述受 试对象中的病毒载量无关。

本文所公开的制备脑脊液样品中的具有HMGB1特异性的总抗体 的处理步骤类似地适用于从血清样品中获取此类抗体。

本发明的方法适用于监测受HIV、尤其是HIV-1或HIV-2感染的 受试对象的状况。在一个具体实施方式中，本发明的方法被实施于处 于逆转录病毒疗法下或是无病毒血症(aviremic)患者(即40份HIV RNA 拷贝/ml血液)的HIV感染患者。处于逆转录病毒疗法下的HIV感染患 者通常显示出受阻抑的病毒载量、通过CD4计数和最低CD4计数测定 的中度免疫缺陷，以及通过表达活化标记物CD38和HLA-DR的CD8⁺T细胞测定的中度免疫活化。例如，显示出如图14所示的“所有患者” 组的临床参数的HIV感染患者，更特别的是显示出1.6log₁₀份HIV RNA拷贝/ml(即无病毒血症患者)和/或300~800CD4⁺T细胞/mm³的 HIV感染患者，通常是处于逆转录病毒疗法(HAART)下的HIV感染患 者。

受试对象的“状况”是指受试对象受HIV感染后的临床状况，或指 该受试对象朝AIDS或HIV相关神经病症进展的风险。

本发明还涉及用于监测已知受HIV感染的受试对象中的HIV感染 的体外方法，所述方法包括对获自该受试对象的脑脊液样品中所含的 具有高迁移率族蛋白I(HMGB1)特异性的抗体进行定量，其中定量所 针对的抗体为具有HMGB1特异性的总抗体或其循环组分(循环抗体) 或其免疫复合组分。

本文所公开的用于监测HIV感染的方法、用于评估免疫缺陷或用 于确定免疫活化水平的方法以及预后和/或诊断方法(包括当所述方法 与对病毒载量的平行确定同时进行时)可以基于对具有HMGB1特异性 的循环抗体(残留抗体)的定量，或基于对具有HMGB1特异性的总抗体 的定量，或者基于对免疫学HMGB1特异性抗体复合物的组分的定量。

本文所公开的用于评估免疫缺陷或用于确定免疫活化水平的方法 以及预后和/或诊断方法基于对样品(如CSF样品和/或血清样品)中的具 有HMGB1特异性的抗体的定量。对于这些方法中的一些，如诊断方 法，额外的步骤可能是适当或必须的，以便得到诊断结果。

在本文所公开的用于定量具有HMGB1特异性的抗体的体外方法、 用于监测HIV感染的体外方法、用于评估免疫缺陷或用于确定免疫活 化水平的方法以及预后和/或诊断方法的具体实施方式中，可以将所定 量的患者的具有HMGB1特异性的抗体与从健康群体(例如，未受HIV 感染)、从不具有所观测的神经病症的受试对象群体(不管是否有病)(例 如，未患HAND的HIV感染患者群)或从被划分为处于该疾病特定进 展阶段的患病患者群(例如，1期至4期的HIV感染患者)确定的具有 HMGB1特异性的抗体的量进行比较。还可以将所定量的患者的具有 HMGB1特异性的抗体与在一个或多个不同时间点在相同患者中确定 的具有HMGB1特异性的抗体的量进行比较；在后一种情形中，可以 计算所获得的定量值之比并可确定具有HMGB1特异性的抗体的量的 进展。相同的比较步骤也适用于对趋化因子(如IP-10和/或MCP-1)的 定量。

在一个具体实施方式中，所有这些方法均基于(涵盖)对循环的(所 谓残留的)特异性抗体的定量或对总的特异性抗体的定量。

可能优选对具有HMGB1特异性的总抗体的定量。

当定量基于具有HMGB1特异性的总抗体时，本发明的方法还包 括适于解离与HMGB1特异性抗体形成的免疫复合物的步骤，例如， 本发明的方法使用或包括基于上文所述的酸处理、特别是实施例中所 公开的那些的定量方法。当定量基于具有HMGB1特异性的循环抗体 时，所述解离步骤不是必须的。

在一个具体实施方式中，所述对具有HMGB1特异性的抗体的定 量通过使脑脊液样品(获自受试对象)与高迁移率族蛋白I(HMGB1)或 其衍生物接触而进行。脑脊液样品与所述蛋白的接触以及对所形成的 复合物的定量在体外进行。

在一个具体实施方式中，所述对具有HMGB1特异性的抗体的定 量通过使血清样品(获自受试对象)与高迁移率族蛋白I(HMGB1)或其 衍生物接触而进行。血清样品与所述蛋白的接触以及对所形成的复合 物的定量在体外进行。

可以理解，在本发明的设计用于监测HIV感染的方法(特别是当伴 随对病毒载量的确定时)、用于评估免疫缺陷的方法和用于确定免疫活 化水平的方法以及预后和/或诊断方法中，可以使用全长HMGB1蛋白 (源自哺乳动物、优选源自人类，如登录号NP 002119限定的蛋白)或 者源自HMGB1的任何肽(10到30个氨基酸残基)或多肽(30到215个 氨基酸残基，优选30~50个、30~100个或30~150个残基)(HMGB1蛋 白衍生物)，条件是这些衍生物与HMGB1特异性抗体结合和/或能够对 抗HGB1抗体进行定量。这些衍生物选自由以下组成的组：重组 HMGB1(例如，商品化蛋白HMG Biotech HM-115)、HMGB1的免疫反 应性部分、其序列为不同来源的HMGB1蛋白所共有的HMGB1的免 疫反应性序列。它们的一个实例是来自对应于HMGB1的人和小鼠共 有序列的HMGB1的重组BOXB(HMGbiotech HM-051)。

“HIV感染的患者”或“已知受HIV感染的受试对象”是指已被准确 地诊断为对HIV病毒呈阳性，并且其HIV感染在相关测试后已得到证 实的受试对象或患者。HIV感染的患者可以根据如病毒载量、CD4T 细胞数或AIDS临床症状等几个参数而进行划分。

在罹患神经病症的患者中，一种具体分类基于由临床医师确定的 与HIV感染相关的那些神经病症，如下：

-1期，具有正常NP(神经心理学)测试；

-2期，在一个认知测试中具有低于平均值至少2SD(标准偏差)， 或在检测相同区域的多于1个测试中具有低于平均值至少1 SD。这些结果限定了ND(神经心理缺陷)状况；

-3期，包括具有ANI(无症状神经认知障碍)标准的患者；和

-4期，包括患有MCD(轻微神经认知障碍)的患者。

这种分类可以与由Antinori等(Neurology.2007年10月30日； 69(18):1789-99)提出的以下分类相结合：未患有HAND(HIV相关神经 病症)的患者包括1期和2期，而患有HAND的患者包括3期和4期。

如上文所公开，通过进行在血清样品中对HMGB1或抗HMGB1 抗体的检测或定量来对HIV感染的检测或监测可以伴随通过公知技术 对病毒载量的确定。

在本发明的一个具体实施方式中，对所述病毒载量的确定可以通 过执行本发明的方法自身(尤其是在所诊断患者未接受针对HIV感染 的治疗时)来实现。

因此，本发明在一个具体实施方式中还涉及监测已知受HIV感染 的受试对象的HIV病毒载量的方法，其包括在样品、特别是血清或脑 脊液样品中进行对总的HMGB1特异性抗体进行定量的方法，其中 HMGB1特异性抗体越多，则病毒载量越高。该监测病毒载量(VL)的方 法在已知受HIV感染但尚未在进行病毒载量监测时针对该感染进行治 疗的患者或其VL未受控制的患者中将是相关的。

“病毒载量”是指HIV RNA(源自病毒颗粒且存在于血浆中)或HIV DNA(在细胞基因组中整合并存在于细胞中)。在一个具体实施方式中， 本发明的基于对HMGB1特异性抗体的定量的方法适用于监测HIV RNA病毒载量。

“监测HIV感染”是指按时对HIV感染的跟踪。HIV感染可以通过 许多参数如对病毒载量的测定、CD4T细胞计数和/或与疾病进展相关 的临床参数来进行评估。HIV感染的进展，即受测参数与先前测试相 比的下降、上升或保持稳定将决定对患者的护理方式。HIV感染的进 展反映了HIV复制和/或HIV基因组向靶细胞的基因组中的整合。

此外，本发明还针对对HIV感染患者的获得性免疫缺陷综合征 (AIDS)进展状态或朝AIDS进展的状态、或者朝HIV感染相关神经病 症进展的状态的体外预后方法，包括在获自HIV感染后(优选在原发或 急性感染期间、或在慢性感染期间)的患者的样品、特别是血清或脑脊 液样品中执行上文所公开的定量方法或HIV感染监测方法，且其中 HMGB1特异性抗体水平越高，发展出AIDS或晚期AIDS的风险越大， 特别是发展出HIV感染相关神经病症的风险越大。

此外，本发明还针对对神经病症进展状态或朝神经病症进展的状 态的体外预后方法，其包括：

a)使获自所述患者的脑脊液样品、血清样品或血清样品和脑脊液 样品一起与天然HMGB1蛋白或其衍生物接触；和

b)对所述脑脊液样品、血清样品或血清样品和脑脊液样品一起的 具有高迁移率族蛋白I(HMGB1)特异性的抗体进行定量，

HMGB1特异性抗体水平越高，则发展出神经病症或发展出晚期神 经病症的风险越高。

在一个具体实施方式中，当所述神经病症由(病原体、细菌或病毒 的)感染所致或疑似由该感染所导致时，所述样品在原发或急性感染期 间或在慢性感染期间获取。

术语“预后”是指在对获自患者的样品进行HMGB1特异性抗体定 量时，评估该患者发展出神经病症或朝其进展的风险、或在HIV感染 患者中发展出AIDS或朝AIDS进展的风险的可能性。

此外，本发明还涉及将以下组合的诊断方法：(1)通过常规临床标 准在患者中对神经病症的存在的评估、或在HIV感染患者中对与AIDS 相关神经病症的存在的评估；和(2)通过确定免疫学参数、特别是对 HMGB1特异性抗体的定量(和可选的对IP-10和/或MCP-1等趋化因子 的定量)的对这些神经病症的出现的确证或关联，可选地与对容量和/ 或代谢变化的确定相组合。对特定HMGB1抗体的定量如本申请中对 于预后方法所述那样进行。因此，HMGB1特异性抗体水平可以与对验 证临床诊断的常规临床标准的观测相关联。术语“诊断性”和“诊断”是 指，在对获自患者的样品进行HMGB1特异性抗体定量时，通过依赖 常规临床标准和免疫参数来确定该患者的神经病症的存在或者缺失、 或在HIV感染患者中确定AIDS相关神经病症的存在或缺失的可能性。 在诊断方法进程中的HMGB1特异性抗体定量特别适于其中常规临床 标准无法给出出现神经病症的确定结论的患者。例如，在划分为2期(神 经心理缺陷)的HIV感染患者中，对HMGB1特异性抗体的定量可以是 证实、预示或验证用常规临床标准获得的神经病症诊断的有效补充性 指示。

在一个具体实施方式中，本体外预后方法和/或诊断方法通常适用 于其中据显示HMGB1涉及和关联着病理学风险或病况的疾病或病症。

因此，本发明的方法可以实施于：

(1)其中存在神经病症(不论其来源)的疾病或病症中。该类别包括 但不限于：源自感染(例如，细菌感染、病原体感染、病毒感染或朊病 毒感染)的疾病或病症。具有神经病症的感染性病症的一个具体实例是 HIV感染。该类别还包括但不限于非感染来源(例如，源自创伤)或来源 未知的疾病或病症，例如，急性神经元损伤、创伤性脑损伤、阿尔兹 海默病、亨廷顿病、缺血后脑损伤、帕金森症、任何影响周围神经系 统和/或脊髓的病症(如脊髓损伤)、肌萎缩性侧索硬化和脱髓鞘病(如多 发性硬化(MS))。

“神经病症”是指例如痴呆综合症(ADC)、脑病、中枢神经系统淋巴 瘤、隐球菌脑膜炎、巨细胞病毒(CMV)脑炎、带状疱疹病毒引起的脑 炎和脊髓炎、神经病变(周围神经病变和远端感觉神经病变)、神经梅毒、 进行性多灶性白质脑病(PML)、弓形虫脑病或脑弓形虫病以及空泡性脊 髓病。

(2)源自感染(细菌、病原体或病毒)或源自自体免疫的不具有神经 病症的疾病或病症中，其中据显示涉及HMGB1蛋白。第二类疾病的 实例包含蛋不限于1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节 炎、HSV-2感染、慢性乙型肝炎、军团菌感染、脓毒症或哮喘。

更特别地，本发明针对对HIV感染患者的获得性免疫缺陷综合征 (AIDS)相关神经病症进展状态或朝向与HIV感染或AIDS相关的神经 病症进展的状态的体外预后方法，其包括在获自感染后(优选在原发性 或急性感染期间或者慢性感染期间)的所述患者的样品、特别是血清或 脑脊液样品中执行上文所公开的定量方法或HIV感染监测方法，且其 中HMGB1特异性抗体水平越高，发展出AIDS相关神经病症或发展 出晚期的与AIDS相关的神经病症或者与晚期AIDS相关的神经病症的 风险越高。

表述短语“AIDS进展状态或朝向AIDS进展的状态”是指在AIDS 进展或朝向其进展中遇到的各个阶段，特别是指由世界卫生组织制定 和更新的用于HIV感染和疾病的WHO疾病分期系统，总结如下。I 期：HIV疾病无症状且未分类为AIDS；II期包括轻微皮肤粘膜表现和 复发性上呼吸道感染；III期包括持续超过一月的无因慢性腹泻；而IV 期包括大脑弓形虫病、食道、气管、支气管或肺的念珠菌病以及卡波 西肉瘤。

表述短语“朝向神经病症的进展状态”在应用于HIV感染患者时是 指上文所述的神经病症阶段(1至4)。替代性地，也可以考虑由Antinori 等提出的涉及非HAND(HIV相关神经病症)和HAND患者的分类。

表述短语“获得性免疫缺陷综合征相关的神经病症”或“AIDS相关 神经病症”涵盖了直接由HIV病毒造成的、由某些癌症和/或机会性感 染造成的神经系统的神经病症，以及受该病毒影响但尚不知晓由该病 毒直接造成的未知来源的病症。这些AIDS相关神经病症中的一些可 以以上文所述的疾病进展状态来表征。AIDS相关神经病症的实例为 AIDS痴呆综合症(ADC)或HIV相关性脑病、中枢神经系统淋巴瘤、隐 球菌脑膜炎、巨细胞病毒(CMV)脑炎、带状疱疹病毒引起的脑炎和脊 髓炎、神经病变(周围神经病变和远端感觉神经病变)、神经梅毒、进行 性多灶性白质脑病(PML)、弓形虫脑病或脑弓形虫病以及空泡性脊髓 病。某些具有受控病毒载量(VL)的尚未处于AIDS阶段的患者(例如处 于强力抗逆转录病毒疗法(HAART)下的患者)可能发展出神经病症。关 于这些神经病症的临床分类如上文所公开。

在本发明的一个优选实施方式中，在来自具有受控病毒载量(VL) 的尚未处于AIDS阶段的患者(例如处于强力抗逆转录病毒疗法 (HAART)下的患者)的生物样品上执行下述方法：对HIV感染或获得性 免疫缺陷综合征(AIDS)相关的神经病症的进展状态或者朝向与HIV感 染或AIDS相关的神经病症进展的状态的体外预后方法。

本发明还涉及用于评估患者、特别是已知受HIV感染的受试对象 的免疫缺陷的体外方法，其包括在获自所述受试对象的样品、特别是 血清或脑脊液样品中进行上文所述的定量方法或HIV感染监测方法， 其中HMGB1特异性抗体越多，免疫缺陷越高。关于HIV感染患者， 在感染后观察到的免疫缺陷是CD4T细胞减少的结果，这已在本发明 中显示与特异性的抗HMGB1抗体水平负相关。

本发明的一部分还涉及用于确定免疫活化、尤其是持续性免疫活 化或身体某些腔室中的持续性免疫活化(其尤其是引起患者、特别是已 知受HIV感染的受试对象的持续性炎性状态)的水平的体外方法，其包 括在获自所述受试对象的样品、特别是血清或脑脊液样品中进行上文 所述的定量方法，其中HMGB1特异性抗体越多，免疫活化持续地越 久。持续性(或慢性)免疫活化与CD8T细胞上的活化标记物、特别是 CD38和/或HLA-DR的高表达相关。因此，本发明已给出证据表明， 高水平的HMGB1特异性抗体与高水平的CD8⁺CD38⁺T细胞和CD8⁺HLA-DR⁺T细胞相关。

免疫活化具体是指在处于HIV感染急性期的患者中观察到的免疫 活化，或者在具有慢性HIV感染的患者中观察到的免疫活化，尤其是 当所述患者未处于抗逆转录疗法下或表现出HIV感染相关神经病症 时。

在用于评估免疫缺陷或用于确定免疫活化水平的体外预后和/或诊 断的方法中，所述定量方法为例如包括以下步骤的方法：

a)使获自所述患者、优选在原发性感染或急性感染期间或者慢性 感染期间获得的脑脊液样品、血清样品或血清样品和脑脊液样品一起 与天然HMGB1蛋白或其衍生物接触；和

b)对所述脑脊液样品、所述血清样品或所述血清样品和脑脊液样 品一起所含的具有高迁移率族蛋白I(HMGB1)特异性的抗体进行定 量。

在基于对抗HMGB1抗体的定量的体外预后方法、免疫缺陷评估 方法或确定免疫活化水平的方法的一个具体实施方式中，与健康人群 或不具有HAND的HIV感染患者群中的抗HMGB1抗体水平相比，高 于20%的抗HMGB1抗体水平的增加与持续性免疫活化、更高的发展 出晚期神经病症的风险和/或更高的免疫缺陷相关。

本发明的方法还包括在步骤a)之前的以下步骤：其适于解离与 HMGB1特异性抗体形成的免疫复合物，从而总的特异性抗HMGB1 抗体得到定量。例如，该额外步骤包括酸处理，如实施例中所公开的 那种。在一个具体实施方式中，这种酸处理由以下组成：将样品(脑脊 液和/或血清)与具有低pH(优选为pH 1~3)的酸性解离溶液接触，所述 酸性解离溶液被选用于在所述样品中将HMGB1蛋白从与其免疫结合 的抗体分离而不改变该抗体的结合能力。在一个具体实施方式中，酸 性解离溶液为处于低pH、优选为pH 1~3(例如1.85)的甘氨酸(例如1.5 M)。然后用中和缓冲液(如Tris，例如pH9的1.5M Tris)中止酸处理。 酸处理导致对生物样品(CSF、血清等)的稀释。在另一个优选实施方式 中，不管是否与前述酸处理结合，在20℃~37℃(优选25℃)进行与酸 性解离溶液的温育，并且/或者中和步骤在冰上进行。

在一个具体实施方式中，所述对HMGB1特异性抗体的定量通过 在体外将样品与高迁移率族蛋白I(HMGB1)或其衍生物接触来进行。 因此，所述定量使用全长HMGB1蛋白(源自哺乳动物、优选源自人类， 如登录号NP_002119限定的蛋白)或者源自HMGB1的任何肽(10到30 个氨基酸残基)或多肽(30到215个氨基酸残基，优选30~50个、30~100 个或30~150个残基)(HMGB1蛋白衍生物)的序列来进行，条件是这些 衍生物与HMGB1特异性抗体结合和/或能够对抗HGB1抗体进行定 量。这些衍生物选自由以下组成的组：重组HMGB1(例如，商品化蛋 白HMG Biotech HM-115)、HMGB1的免疫反应性部分、其序列为不同 来源的HMGB1蛋白所共有的HMGB1的免疫反应性部分。它们的一 个实例是来自对应于HMGB1的人和小鼠共有序列的HMGB1的重组 BOXB(HMGbiotech HM-051)。

本发明所公开的体外方法的每一种和所有均可选地进一步包括对 样品(如血清或脑脊液样品)中发现的其它分子、特别是趋化因子进行定 量。能够进行独立测试和定量的趋化因子的实例有趋化因子IP-10和趋 化因子MCP-1。人趋化因子IP-10(10kDa的经γ干扰素诱导的蛋白) 也称作趋化因子(C-X-C基序)配体10或CXCL10，且以NCBI登录号 NP_001556引用；人趋化因子MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)也称作趋 化因子(C-C基序)配体2(CCL2)且以NCBI登录号NP_002973引用。

当应用于分子、特别是如趋化因子IP-10和趋化因子MCP-1等趋 化因子时，术语“定量(quantitating或quantitation)”涵盖了术语“(对数量) 定量(quantifying)”以及对趋化因子IP-10和趋化因子MCP-1水平的任 何合适信息的确定。

具体而言，本发明涉及用于监测已知受HIV感染的受试对象的状 态的体外方法，其包括在获自所述受试对象的样品、特别是血清或脑 脊液样品中进行本文所公开的定量方法(对HMGB1特异性抗体的定量) 以及对趋化因子IP-10和/或趋化因子MCP-1进行定量的步骤。

在另一个实施方式中，本发明还涉及对神经病症进展状态或朝向 神经病症进展的状态进行预后的体外方法或诊断方法，其包括在获自 患者的样品、特别是血清和/或脑脊液样品中进行本文所述的定量方法 以及对趋化因子IP-10和/或趋化因子MCP-1进行定量的步骤，且其中 HMGB1特异性抗体水平越高，则发展出神经病症或发展出晚期神经病 症的风险越大。

此外，本发明还涉及对HIV感染患者的与获得性免疫缺陷综合征 (AIDS)或与一般性HIV感染相关的神经病症进展状态或朝向与AIDS 或一般性HIV感染相关的神经病症进展的状态进行预后的体外方法， 其包括在获自感染后的患者的样品、特别是血清或脑脊液样品中进行 本文所述的定量方法(对HMGB1特异性抗体的定量)以及对趋化因子 IP-10和/或趋化因子MCP-1进行定量的步骤，且其中HMGB1特异性 抗体水平越高以及趋化因子IP-10和/或趋化因子MCP-1越多，发展出 与AIDS或一般性HIV感染相关的神经病症或发展出晚期的与AIDS 或一般性HIV感染相关的神经病症的风险越大。

对于本文所公开的所有预后方法，特别地，趋化因子定量步骤与 HMGB1特异性抗体定量步骤同时进行。

本发明还涉及包括在HIV感染的个体的脑脊液样品中和血清样品 中进行HMGB1特异性抗体定量(例如如上文所述)的方法，两种定量均 在同一个体和取自同时的样品上进行，以及可选地，对于趋化因子 IP-10和/或趋化因子MCP-1的定量，同时在相同个体的脑脊液样品和 血清样品中进行且所述样品取自同时。

这种基于在两种不同样品中进行HMGB1特异性抗体平行定量的 方法可以用于以下应用中：

-用于监测已知受HIV感染的受试对象中的人免疫缺陷病毒(HIV) 的体外方法；

-针对HIV感染患者(优选处于原发性或急性感染期间或者处于 慢性感染期间)的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)进展状态或朝 向AIDS进展的状态的体外预后方法；

-针对患者的神经病症进展状态或朝向神经病症进展的状态的体 外预后方法；

-针对HIV感染患者(优选处于原发性或急性感染期间或者处于 慢性感染期间)的与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)或HIV感染 相关的神经病症进展状态或朝向与AIDS或HIV感染相关的神 经病症进展的状态的体外预后方法；和

-当与其它方法关联时，用于针对患者的神经病症进展状态或朝 向神经病症进展的状态的诊断方法，特别是用于HIV感染的患 者的与AIDS或HIV感染相关的神经病症进展状态或朝向与 AIDS或HIV感染相关的神经病症进展的状态的诊断方法。

“同时”是指在其中临床症状、特别是神经病症(如AIDS或HIV相 关神经病症)、AIDS疾病期和/或所述HIV感染患者的血清或CSF病毒 载量相似或相同的时期内，从既定患者获取样品。具体地，该时期不 超过(少于)6个月、3个月、1个月或2周。

与如上所述的体外预后和/或诊断方法、用于免疫缺陷评估的体外 方法、用于确定免疫活化水平的体外方法和对脑脊液样品和血清样品 中的HMGB1特异性抗体定量的方法中的每一种和所有平行地，使用 常规方法(例如PCR)来确定HIV病毒载量。表述短语“平行地”是指同 时在获自相同患者的样品中执行所述方法。

令人感兴趣的是，虽然患者的血清和/或CSF病毒载量可能无法检 测并揭示出血液和/或CNS中的HIV病毒复制缺乏，但对大量HMGB1 特异性抗体的定量(可能地伴以大量的趋化因子IP-10和/或趋化因子 MCP-1)揭示出在其它腔室或器官(如肝、脑或小肠)中的HIV病毒复制。 这可以解释根据已知标准具有较低或无法检测的HIV病毒载量的受治 疗HIV感染患者虽然表现出神经病症但不会朝AIDS进展。这一观察 证明，可以实施与血清病毒载量的确定平行的其它测试(如HMGB1特 异性抗体的定量)，以考虑到事实上HIV病毒在各种器官和腔室中的感 染和保持。

体外预后和/或诊断的方法还可以包括设计用于证实或验证神经病 症进展状态或朝向神经病症、特别是AIDS或HIV感染相关的神经病 症进展的状态的互补性测试。这些测试包括:

(a)鉴定所述患者基底神经节中的体积变化，优选通过磁共振成像 测量；和/或

(b)鉴定所述患者基底神经节中的代谢变化，优选通过计算血清胆 碱/N-乙酰天冬氨酸之比(Cho/NAA)。

本文所述所有方法均在体外实施。

本发明还涉及上文所述天然HMGB1蛋白或其衍生物在制造试剂 盒、标记物或手段中的应用，所述试剂盒、标记物或手段用于对患者、 特别是HIV感染患者的神经病症进展状态或朝向神经病症进展的状态 的体外预后，所述预后和诊断获自包括以下步骤的方法：

a)使获自所述患者、优选在原发性感染或急性感染期间或者慢性 感染期间获得的脑脊液样品、血清样品或血清样品和脑脊液样品一起 与天然HMGB1蛋白或其衍生物接触；和

b)对所述脑脊液样品、所述血清样品或所述血清样品和脑脊液样 品一起所含的具有高迁移率族蛋白I(HMGB1)特异性的抗体进行定 量；

其中HMGB1特异性抗体水平越高，发展出神经病症或发展出晚 期神经病症的风险越大，特别是发展出HIV感染相关神经病症或发展 出晚期的HIV感染相关神经病症的风险越大。

本发明还涉及上述天然HMGB1蛋白或其衍生物在用于评估患者、 特别是已知受HIV感染的受试对象的免疫缺陷的试剂盒、标记物或手 段的制备中的应用，所述评估通过包括以下步骤的方法获得：

a)使获自所述患者的脑脊液样品、血清样品或血清样品和脑脊液 样品一起与天然HMGB1蛋白或其衍生物接触；和

b)对所述脑脊液样品、所述血清样品或所述血清样品和脑脊液样 品一起所含的具有高迁移率族蛋白I(HMGB1)特异性的抗体进行定 量；

其中HMGB1特异性抗体水平越高，免疫缺陷高的情况越大。

本发明还涉及上述天然HMGB1蛋白或其衍生物在用于确定患者、 特别是已知受HIV感染的受试对象中的免疫活化水平的试剂盒、标记 物或手段的制备中的应用，所述确定通过包括以下步骤的方法获得：

a)使获自所述患者的脑脊液样品、血清样品或血清样品和脑脊液 样品一起与天然HMGB1蛋白或其衍生物接触；和

b)对所述脑脊液样品、所述血清样品或所述血清样品和脑脊液样 品一起所含的具有高迁移率族蛋白I(HMGB1)特异性的抗体进行定 量；

其中HMGB1特异性抗体水平越高，免疫活化持续地越久。

本发明还涉及上述天然HMGB1蛋白或其衍生物在用于患者、特 别是已知受HIV感染的受试对象的本发明诊断方法的试剂盒、标记物 或手段的制备中的应用。

除天然HMGB1蛋白或其衍生物以外，上述试剂盒、标记物或手 段的制备还可以包括适于使HMGB1/抗HMGB1抗体免疫复合物解离 的酸性解离溶液的应用和/或对趋化因子(如IP-10和/或MCP-1)进行定 量的方法的应用。在一个具体实施方式中，上述试剂盒、标记物或手 段的制备还可以包括天然HMGB1蛋白或其衍生物以及适于使 HMGB1/抗HMGB1抗体免疫复合物解离的酸性解离溶液的应用。在另 一个实施方式中，上述试剂盒、标记物或手段的制备还可以包括天然 HMGB1蛋白或其衍生物以及对趋化因子IP-10进行定量的方法的应 用。

涉及对HMGB1特异性抗体的定量的任何上述体外方法都可以通 过实施ELISA或其它免疫检测方法、使用涂布于固体基质上的高迁移 率族蛋白I(HMGB1)或其衍生物以及可选地使用能够检测HMGB1特 异性抗体的二抗来进行。

当考虑对趋化因子IP-10和/或趋化因子MCP-1的定量时，可以使 用ELISA或本领域已知的任何其它方法。

本发明人还证实，蛋白HMGB1自身在脑脊液样品中可以得到检 测。

因此，本发明的再一个方面涉及检测来自HIV感染受试对象的脑 脊液样品中HMGB1的浓度降低。可以利用脑脊液样品中病毒载量与 HMGB1浓度的正相关来监测HIV感染。HMGB1浓度可以通过公知的 诊断测试(如ELISA测试)来进行定量。重组hHMGB1、抗hHMGB1 单克隆抗体和兔抗hHMGB1血清可商购获得且可用于此类诊断测试 中。

本发明还涉及监测HIV感染的受试对象中的HIV感染的体外方 法，其包括对获自所述受试对象的脑脊液样品中所含的高迁移率族蛋 白I(HMGB1)进行定量(特别是通过使来自所述HIV感染受试对象的生 物样品与和高迁移率族蛋白I(HMGB1)免疫结合的抗体相接触)，其中 定量所针对的HMGB1蛋白为总HMGB1蛋白或其循环组分(残留循环 HMGB1)或其免疫复合组分。

本发明还涉及用于监测已知受HIV感染的受试对象的HIV病毒载 量的体外方法，其包括在获自所述受试对象的脑脊液样品中进行对 HMGB1蛋白的定量，其中HMGB1蛋白越多，病毒载量越高。“病毒 载量”是指HIV RNA(源自病毒颗粒且存在于血浆中)或HIV DNA(在 细胞基因组中整合并存在于细胞中)。在一个具体实施方式中，本发明 的基于对HMGB1特异性抗体的定量的方法适用于监测HIV RNA病毒 载量。

监测HIV感染或病毒载量的方法可以基于对循环(残留)HMGB1 的定量、基于对总HMGB1的定量或基于对免疫HMGB1/特异性抗体 复合物的组分的定量来实施。

在一个具体实施方式中，这些方法基于对循环HMGB1或总 HMGB1的定量。当定量基于总HMGB1时，本发明的方法还包括适于 使与HMGB1特异性抗体形成的免疫复合物解离的步骤，且例如本发 明的方法使用或包括对脑脊液样品的酸处理。

合适的酸处理包括使将脑脊液样品与具有低pH(优选为pH 1~3) 的酸性解离溶液接触，所述酸性解离溶液被选用于将HMGB1蛋白从 与特异性抗体分离而不改变HMGB1蛋白及其被该特异性抗体识别的 能力。在一个具体实施方式中，酸性解离溶液为处于低pH、优选为pH 1~3(例如1.85)的甘氨酸(例如1.5M)。然后用中和缓冲液(如Tris，例 如pH9的1.5M Tris)中止酸处理。在另一个优选实施方式中，不管是 否与前述酸处理结合，在20℃~37℃(优选25℃)进行与酸性解离溶液 的温育，并且/或者中和步骤在冰上进行。

对HMGB1蛋白的定量可以与来自获自未受HIV感染的受试对象 的脑脊液样品的HMGB1量进行比较，或与来自在不同时间获自相同 受试对象的脑脊液样品的HMGB1量进行比较。

本发明还涉及用于相同应用的包括在HIV感染个体的脑脊液样品 中和血清样品中进行HMGB1定量的方法(例如如上所述)，两种定量均 同时在相同个体中进行，且所述方法可选地包括同时在相同个体的脑 脊液样品和血清样品中对趋化因子IP-10和/或趋化因子MCP-1进行定 量。

本发明的另一方面涉及可用于实施以下应用之一的试剂盒：监测 HIV感染受试对象的免疫缺陷病毒(HIV)；监测未处于针对HIV感染的 治疗的HIV感染受试对象的HIV病毒载量；进行对HIV感染患者的 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)进展状态或朝AIDS进展的状态的预后； 进行对患者的神经病症进展状态、特别是与获得性免疫缺陷综合征 (AIDS)或HIV感染相关的神经病症的进展状态的预后或者对患者朝神 经病症进展的状态、特别是与HIV感染患者的AIDS或HIV感染相关 的神经病症；评价患者、特别是HIV感染受试对象的免疫缺陷；确定 患者、特别是HIV感染受试对象的免疫活化、尤其是持续性免疫活化 的水平；监测HIV感染患者的状态；以及本发明的诊断方法。

该试剂盒包含如上所述的天然HMGB1蛋白或其衍生物、可选的 适于使在从患者取样时从生物样品中发现的HMGB1/抗HMGB1抗体 免疫复合物解离的酸解离溶液(如上所述的那些)以及可选的对趋化因 子IP-10定量的手段和/或对趋化因子MCP-1定量的手段。可选地，该 试剂盒还可含有中和缓冲液(例如上文所述)和/或与HMGB1/特异性抗 体复合物结合和/或揭示其形成的二抗。可选地，该试剂盒还可含有使 用说明(手册)。在一个具体实施方式中，试剂盒含有天然HMGB1蛋白 或其衍生物以及适于使HMGB1/抗HMGB1抗体免疫复合物解离的酸 解离溶液。在另一个实施方式中，试剂盒包含天然HMGB1蛋白或其 衍生物和对趋化因子IP-10定量的手段。

所述试剂盒被实施用以对来自任何生物样品、特别是来自HIV感 染患者的脑脊液样品或来自HIV感染患者的血清样品的抗HMGB1抗 体进行定量，或者在需要对来自所述HIV感染患者的脑脊液样品和血 清样品两者平行定量时实施。

附图说明

图1：对来自HIV-1感染患者的CSF中的HMGB1和抗HMGB1 抗体的检测。A-左图。在来自10个健康捐献者(HD)和23个患有神经 病症的HIV-1感染患者的CSF中通过Elisa(Shinotest,IBL)对HMGB1 浓度进行定量。盒形图表示两组中CSF HMGB1浓度的平均值±SD(检 出限为0.25ng/ml)[HD中为0.5ng/ml(范围是0.25ng/ml~1.47ng/ml)， 相比患者中为1.67ng/ml(范围是0.25ng/ml~15.9ng/ml)]。A-右图。根 据神经病症严重性将HIV感染患者分为2期至4期，仅从3期和4期 患者获取CSF。在来自3期患者的CSF中监测到相对于HD浓度增加 的HMGB1，但由于数值的可变性，来自两组的HD和患者之间的差异 不具有统计显著性。B-左图。在来自10个健康捐献者(HD)和23个患 有神经病症的HIV-1感染患者的CSF中通过Elisa对于抗HMGB1Abs 浓度进行定量。盒形图表示CSF抗HMGB1浓度的平均值±SD(在方 框上标出平均值和范围值)。报道了显著性差异的p值(非参数 Mann-Whitney测试)。B-右图。对3期患者(n=12)和4期患者(n=11)的 CSF测试了抗HMGB1Abs并与HD(n=10)比较。盒形图表示抗HMGB1 浓度的平均值±SD。报道了显著性差异的p值(非参数Mann-Whitney 测试)。

图2：病毒载量对CSF中的HMGB1和抗HMGB1抗体水平的影 响。A：根据CSF病毒载量(VL)将患者分为2组：不可检测(即<40份 拷贝/ml)和阳性(VL>40份拷贝/ml)。在各方框上标出平均值。在这2 组之间进行HMGB1和抗HMGB1浓度的比较，并报道了p值(非参数 Mann-Whitney测试)。B：HMGB1或抗HMGB1抗体的CSF浓度与CSF Log VL的Spearman相关性。报道了相关系数(r)和p值。C：血清VL 与CSF HMGB1浓度(左图)或与CSF VL(右图)的Spearman相关性。报 道了相关系数(r)和p值。

图3：CSF中的抗HMGB1抗体水平与疾病进展的相关性。A：周 围CD4T细胞数目与疾病进展相关。将患者根据其血液CD4T细胞数 分为3组，并在3组之间比较HMGB1和抗HMGB1抗体水平。报道 了p值(非参数Mann-Whitney测试)。B：HMGB1或抗HMGB1Abs的 CSF浓度与CD4T细胞数的Spearman相关性。报道了相关系数(r)和p 值。

图4：CSF HMGB1和抗HMGB1抗体水平与免疫活化的相关性。 A：在根据患者的CD4T细胞数分组的3组患者之间比较CSF VL、T CD8⁺HLA-DR⁺%和T CD8⁺CD38⁺%。报道了p值(非参数 Mann-Whitney测试)。B：CSF或血清VL与CD8⁺CD38⁺T细胞%或 CD8+HLA-DR+T细胞%之间的Spearman相关性。报道了相关系数(r) 和p值。C-顶图：CSF抗-HMGB1抗体与CD4⁺HLA-DR⁺T细胞%或 CD8⁺HLA-DR⁺T细胞%之间的Spearman相关性。底图：CSF HMGB1 与CD8⁺HLA-DR⁺T细胞%之间的Spearman相关性。报道了相关系数 (r)和p值。

图5：对3期和4期患者的CSF中的24种细胞因子和趋化因子的 定量。已通过MAP计数(Luminex)从来自HD、3期和4期患者的CSF 中对一组24种细胞因子和趋化因子进行了定量。盒形图表示了趋化因 子组的平均值±SD。仅检测到IP-10和MCP-1处于显著水平。对在患 者与HD之间的统计性比较报道了p值(非参数Mann-Whitney测试)。

图6：CSF IP-10和MCP-1水平与CSF病毒载量和疾病进展的相 关性。A：CSF IP-10与CSF VL、T CD8⁺CD38⁺%和CD8⁺HLA-DR⁺% 之间的Spearman相关性。B、C：CSF MCP-1与血液CD4T细胞数、 CD8⁺CD38⁺T细胞%(B)和CSF IL-10(C)之间的Spearman相关性。报 道了相关系数(r)和p值。

图7：3期和4期患者中的CSF IP-10与MCP-1的相关性以及其与 抗HMGB1抗体的相关性。A：对处于3期或4期的患者与HD中的 IP-10(顶图)和MCP1(底图)浓度的比较。对在患者与HD之间的统计 性比较报道了p值(非参数Mann-Whitney测试)。B：显示了CSF抗 -HMGB1抗体与CSF IP-10或CSF MCP1之间的Spearman相关性。报 道了相关系数(r)和p值。

图8：处于2期的血清抗HMGB1抗体水平与血浆VL的相关性。 A：处于1期(n=33，无神经病症)、2期(n=41，轻度神经病症)、3期 (n=17)和4期(n=13)的HIV感染患者中的血清HMGB1(左图)和抗 HMGB1抗体(右图)的比较。对患者组之间的统计性比较报道了p值(非 参数Mann-Whitney测试)。B：根据CSF VL将患者分为2组：无法检 测(即<40cp/ml,n=55)和阳性(VL<40cp/ml,n=28)。在这2组之间比较 抗-HMGB1Abs和CD4T细胞数并报道了p值(非参数Mann-Whitney 测试)。C：如x轴上所指示，根据VL将患者分组。对每组比较了抗 HMGB1抗体和HMGB1浓度(左上图和底图)并报道了p值(非参数 Mann-Whitney测试)。右上图显示了105位患者中的抗HMGB1抗体与 血清VL之间的Spearman相关性。报道了相关系数(r)和p值。

图9：血清抗HMGB1抗体水平与IP-10之间的相关性。A：来自 106位患者的血清中的抗HMGB1抗体水平与IP-10(左图)或HMGB1 (右图)的Spearman相关性。报道了相关系数(r)和p值。B：分别来自 105位和86位患者的血清中IP-10与CD4T细胞数(左图)或T CD8⁺HLA-DR⁺%(右图)之间的Spearman相关性。报道了相关系数(r)和p值。

图10：HAART对VL的阻抑与CSF抗HMGB 1、HMGB1、IP-10、 MCP-1和免疫活化的减少有关。根据患者接受HAART或未接受抗逆 转录病毒疗法的事实将患者分组。在两组之间比较了病毒载量(VL)、 HMGB1、抗-HMGB 1抗体(Abs)(A)、CD8+CD38+和CD8+HLA-DR+ 细胞的百分比(B)以及IP-10和MCP1的水平(C)。报道了p值。

图11：来自具有受阻抑病毒载量的患者的CSF中HMGB1、抗 HMGB1、IP-10和MCP1的持续性。在具有VL<40cp/ml的66名患者 和10名健康捐献者(HD)的CSF中比较了抗HMGB1、IP-10和MCP1 水平。显示了平均值(25%~75%的百分比)。用非参数Mann-Whitney测 试进行统计性比较。报道了p值。

图12：神经病症与具有受阻抑VL的患者中的血清抗HMGB1 Abs 水平升高有关。在不同的神经病症阶段(A)或者在2、3、4期患者(n=45) 与1期患者(n=21)(B)之间比较抗HMGB1抗体(Abs)和HMGB1水平， 其均呈现出VL<40cp/ml。显示了平均值并用非参数Mann-Whitney测 试进行统计性比较。报道了p值。

C：对于所指定参数进行了与B相同(1期相比之2、3、4期患者) 的比较。对于任何上述参数均未发现统计性差异。

图13：具有受抑制的病毒载量的2、3、4期患者中的抗HMGB1、 MCP1、IP-10和免疫活化之间的相关性。A、B、C：在来自具有VL<40 cp/ml的2、3、4期患者的血清中所指定参数之间的Spearman相关性。 报道了相关系数(r)和p值。

图14：研究中所包括的患者的临床和免疫学参数。不论CD4细胞 计数和病毒载量如何，在超过18岁的受试对象中随机选择HIV感染受 试对象。排除标准为：此前诊断有HAND、活跃的机会性感染、任何 神经病症史。HAND如本文上下文中所述而限定。如本申请中所述对 HMGB1、抗HMGB1、IP-10和MCP1进行定量。用Mann-Whitney测 试确定P值。P<0.05则认为显著。

图15：HAND患者和非HAND患者显示出相当的临床和病毒学参 数。对于每名患者，对所指定参数(招募时的CD4计数、最低点CD4、 血浆HIV-RNA、HIV-DNA、活化标记物)进行记录或定量。在患HAND 的患者和未患HAND的患者中比较这些标记物。对于任何标记物均未 检测到显著差异(Mann-Whitney测试)。

图16：在病毒血症或无病毒血症的HAND患者和非HAND患者 中的HMGB1和抗HMGB1水平具有显著差异。根据本申请所述的方 法对所有患者的HMGB1和抗HMGB1血清水平进行定量。不论其病 毒载量如何，或者仅考虑病毒血症或无病毒血症患者，比较HAND患 者和非HAND患者的HMGB1和抗HMGB1水平。使用Mann-Whitney 测试进行统计分析。P<0.05则认为显著。

图17：血清IP-10水平与免疫活化、MCP1、抗HMGB1和最低点 CD4相关性。显示了血清IP-10水平与所指定免疫参数之间的相关性。 使用Spearman相关性测试。P<0.05则认为显著。

图18：血清MCP1水平与免疫活化、IP-10、HMGB1和最低点CD4 相关性。显示了血清MCP1水平与所指定免疫参数之间的相关性。使 用Spearman相关性测试。P<0.05则认为显著。

图19：患HAND患者中的基底神经节体积变化以及与代谢变化的 相关性。如说明书中所述，通过MRI测定基底神经节(BG)体积变化与 Cho/NAA比。患HAND患者具有较大的壳核(低于1的Jacobian值)(A) 和在BG的MRI谱上更高的Cho/NAA比(B)。更大的壳核体积与更高 的Cho/NAA值相关(p=0.02)(C)。

图20：神经损伤(Cho/NAA比)与抗HMGB1Abs和IP10水平相关。 免疫活化增加(CD8+CD38+HLA-DR+T细胞%)以及抗HMGB1 Abs和 IP10水平升高与Cho/NAA值增加相关。使用Mann-Whitney测试进行 了统计分析。P<0.05则认为显著。

实施例

I.样品(血清和/或人脑脊液)中的HMGB1蛋白和抗HMGB1抗体的检测

根据ELISA试剂盒Shino测试(IBL)，对来自HIV感染患者的样品 中的HMGB1蛋白(即残留循环HMGB1蛋白)的浓度进行定量。

而且，开发了用于检测总的抗HMGB1特异性抗体的特定Elisa试 剂盒。使用了以下试剂：

-兔抗人HMGB1多克隆一抗(Adcam ab18256)针对源自人 HMGB1的第150号残基至C端的KLH缀合合成肽。

-来自编码哺乳动物序列(在人和小鼠中完全相同)的表达质粒的 制备于大肠杆菌中的来自HMGB1的重组BOXB(HMGBiotech HM-051)。

-对照兔血清(Sigma;Ref：R9133)

-与碱性磷酸酶(PAL)缀合的抗兔IgG或IgM，底物磷酸对硝基苯 基酯片剂(pNPP)，

-校准物：来自血清的人IgG(Sigma;ref I2511)和来自血清的人 IgM(Sigma;ref I8260)

-在山羊中制备的抗人IgG(Fc特异性)碱性磷酸酶抗体、在山羊 中制备的抗人IgM(μ链特异性)碱性磷酸酶抗体。

对总的抗HMGB1特异性抗体进行定量的Elisa测试如下进行：

用0.5μg/ml的BOXB的DPBS溶液在4°C对96孔板进行过夜涂 布。同时，采用对应同种型的系列DPBS稀释液进行校准物涂布(仅对 于用人类样品进行的ELISA测试)。使用微孔板洗涤器(Atlantis;Oasys) 用DPBS/0.05%(体积/体积比)20洗涤板4次。在每个ELISA 测试步骤后进行类似洗涤。用PBS/2%(重量/体积比)BSA将未结合的 位点在4°C封闭2小时。将稀释于DPBS/0.05%(体积/体积比) /1%(重量/体积比)BSA中的100μl等分试样添加至经涂布的和未经涂 布的孔内，并在37°C温育1小时。所有受测样品用1.5M甘氨酸(体积 /体积比，pH 1.85)在水浴中于25°C处理30分钟，并随后保持在冰上 并用pH 9.0的1.5M Tris(体积/体积比)稀释。随后立即将样品稀释 (1/10~1/1000)并分配至经涂布的板上。在37°C于1小时中添加稀释于 DPBS/0.05%(体积/体积比)/1%(重量/体积比)BSA中的抗兔 IgG碱性磷酸酶缀合抗体(比例1/10000)、山羊抗人IgG(比例1/2000) 或IgM(比例1/2000)。在37°C与100μl pNPP底物温育30分钟后进 行抗原特异性抗体的检测，并通过添加100μl的3M NaOH使反应中止。 如本发明人此前在志贺菌LPS特异性Elisa中所报道(Launay等， Vaccine 2009,27:1184-1191)，通过Ascent软件(ThermoElectrocor)根据 获自标准免疫球蛋白溶液吸光度的标准曲线来计算BOXB特异性抗体 的浓度。数据以ng/ml的受检测抗体来表达。

II.HMGB1和特异性抗HMGB1抗体的分析以及来自HIV感染患者的CSF中的趋化因子特征标志(signature)

HIV感染的患者

针对HMGB1和抗HMGB1抗体的CSF含量分析的患者组是105 名慢性HIV感染患者同期组的一部分，其根据AIDS相关神经病症进 行划分(如上文所释)。组1包括未患神经病症的HIV-1感染患者，而组 2、3、4包括具有逐渐增长的神经病症的患者。

IIa.HMGB1和特异性抗HMGB1抗体与病毒载量、疾病进展和趋化因子特征标志的相关性

来自HIV感染(HIV⁺)患者的CSF样品中HMGB1和抗HMGB1 Abs水平与健康捐献者相比升高

使用用于HMGB 1检测(检出限0.25ng/ml)的Shinotest Elisa(IBL) 测试和本发明人自制的用于抗HMGB1抗体检测(检出限90ng/ml)的 Elisa测试，在来自HIV感染患者(P)的CSF中发现了与健康捐献者(HD) 相比升高的HMGB1水平(图1A)和抗HMGB1抗体水平(图1B)。患者 CSF中HMGB1水平的增加与HD相比虽不具有统计性差异(图1A)， 但抗HMGB1抗体水平与HD相比显著增加(图1B)。根据患者的神经 病症阶段的分组显示，对3期和4期患者观察到了CSF中HMGB1和 抗HMGB1抗体水平的增加。仅抗HMGB1抗体水平与HD相比具有 统计性差异(图1)。

来自CSF样品的HMGB1和抗HMGB1抗体与病毒载量相关

HIV-1可能驱动着CSF中的HMGB1和抗HMGB1抗体制备。这 由以下所表明：与具有无法检测的VL(<40cp/ml CSF)的患者相比，具 有未经控制的病毒载量(VL)的患者中的两种分子的水平均更高(图 2A)。另外，据发现HMGB1和抗HMGB1抗体水平与CSF中的HIV-1 VL正相关(图2B)。作为推论(考虑到CSF VL与血浆VL强相关，图 2C)，CSF HMGB1水平与血浆VL正相关(图2C)。

CSF抗HMGB1水平与疾病进展相关

HIV感染的检验标志是血液中CD4T细胞的逐渐消失，且周围 CD4T细胞数是HIV疾病进展的标记物。图3A(右图)显示，当CD4T 细胞数下降时，CSF中的抗HMGB 1水平升高，且相对于具有高CD4T 细胞数(>600)的患者，其在具有低CD4T细胞数(<300)的患者中的水平 显著更高。而且，CSF中的抗HMGB1抗体水平似乎与疾病进展相关， 因为抗HMGB1抗体与CD4T细胞数负相关(图3B右图)。至于CSF 中的HMGB1水平，其不随CD4T细胞数变化(图3A、3B左图)。值 得注意的是，用于HMGB1定量的测试(Shinotest,IBL)仅检测出残留游 离HMGB1(即不是与抗体复合的HMGB1)，而本发明人实验室中开发 的用于抗HMGB1抗体定量的测试检测出总抗体、包括与HMGB1复 合的抗体。因此，抗HMGB1抗体的水平(比HMGB1高1000倍)代表 着比残留HMGB1更为准确的疾病进展量度。

CSF HMGB1和抗HMGB1抗体水平与持续性免疫活化相关

许多研究已证实，慢性HIV感染诱导了作为疾病进展的强标记物 的免疫活化状态(Giorgi JV等，Shorter survival in advanced HIV-1 infection is more closely associated with T lymphocyte activation than with plasma virus burden or virus chemokine coreceptor usage.J Infect Dis 1999)。可以通过活化标记物在血液CD8T细胞、特别是CD38和 HLA-DR(其组合与朝AIDS进展的风险相关)上的表达来分析免疫活化 (Liu Z等，Elevated CD38 antigen expression on CD8⁺T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AID S and death in the MACS Study than CD4⁺cell count,soluble immune activation markers,or combinations of HLA-DR and CD38expression.J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 1997;16:83-92)。图4A显示， CD8+CD38⁺T细胞的百分比在具有低CD4T细胞数的患者(CD4 <300/uL)中比具有高CD4T细胞数的患者(>600/uL)中显著增加，且T 细胞的活化状态(即CD8⁺CD38⁺T细胞和CD8⁺HLA-DR⁺T细胞的百分 比)与CSF和血浆病毒载量两者正相关(图4B)。在该背景下值得注意的 是，HMGB1和抗HMGB1抗体的表达与T细胞的活化状态正相关(图 4C)。

因此，在患神经病症的患者的CSF中对HMGB1和抗HMGB1的 检测是由HIV驱动的持续性免疫活化的结果。

CSF样品中的HMGB1和抗HMGB1抗体水平的增加与炎性趋化 因子IP-10和MCP-1的水平的增加相关。

对来自HD和患有3期或4期神经病症的HIV⁺患者的CSF用MAP (MultiAnalyte Profiling)技术进行测试，同时检测24种细胞因子/趋化因 子。图5显示了对来自HD和HIV⁺患者的CSF中的趋化因子概况的比 较。在来自HD的CSF中，细胞因子/趋化因子特征标志由对两种趋化 因子IP-10和MCP-1的检测所表征。在来自HIV⁺患者的CSF中，这 两种趋化因子也得到检测，且水平更高。患者的CSF中IP-10浓度的 增加与CSF VL相关(这与此前报道相符((Paola Cinquea等， Cerebrospinal fluid interferon-γ-inducible protein 10(IP-10,CXCL 10)in HIV-1infection.J Neuroimmunology 2005)))，且与CD8T细胞的活化状 态相关(图6A)。相似地，MCP-1浓度的增加与T细胞的活化状态相关， 且MCP-1水平似乎与疾病进程相关，如CSF MCP1浓度与CD4T细胞 数的反相关所示(图6B)。图6C显示了IP-10和MCP-1水平在患者CSF 中正相关。

为了表征从来自患有神经病症的患者的CSF中检测到的介导物的 性质，在HD与3期和4期患者之间比较IP-10和MCP-1的水平。图 7A显示，3期与IP-10和MCP-1的显著增加相关。令人感兴趣的是， CSF IP-10和MCP-1浓度与抗HMGB1抗体水平正相关(图7B)。

IIb.来自患有神经病症的HIV⁺患者的血清中的HMGB1、抗HMGB1抗体和趋化因子特征标志

血清抗HMGB1抗体水平从2期起增加且为HIV病毒载量所驱动

图8A显示，从2期开始，患者显示出抗HMGB1抗体水平的显著 增加，而HMGB1水平则区分性较低。不同组间的VL不存在显著差 异(未示出)。基于血清病毒载量对患者的分组(无法检测为<40cp/ml相 比阳性为>40cp/ml)揭示，抗HMGB1抗体在具有可检测的病毒载量的 患者中显著增加(图8B)。如同预期，可检测的VL与CD4T细胞数的 减少相关(图8B)。对血清VL更精细的分组显示，抗HMGB1抗体从 VL>1000cp/ml起显著升高，且HMGB1Abs水平与VL正相关(图8C)。 如在CSF中所观测，HMGB1水平的区分性较低。

血清抗HMGB1Abs水平与IP-10浓度相关

如在患者CSF中所观测，在抗HMGB1抗体和IP-10水平之间发 现了正相关(图9A)。据发现IP-10由于其随CD4的减少而增加因而与 疾病进程相关，且其生产与免疫系统的持续性活化相关，如T细胞上 的活化标记物的表达所评估(图9B)。有趣的是，HMGB1和抗HMGB1 抗体的水平反相关(图9A)，从而表明抗HMGB1抗体的生产为HMGB1 的生产所驱动，且抗HMGB1抗体具有中和活性。

IIc.具有受抑制的病毒载量的患者的神经病症与CSF和血清中趋化因子IP-10和MCP-1的持续性相关

HAART对病毒载量(VL)的抑制与CSF抗HMGB1、HMGB1、 IP-10、MCP-1和免疫活化的减少相关。

成功的抗逆转录病毒疗法与大多数患有神经病症的患者中的CSF 病毒载量的受抑制相关(图10A)。同时，CSF HMGB1、抗HMGB1(图 10A)、IP-10和MCP-1(图10C)以及CD38和HLA-DR在CD8T细胞上 的表达(图10B)的水平下降。

来自具有受抑制病毒载量的患者与健康捐献者相比其CSF中 HMGB1、抗HMGB1、IP-10和MCP-1的持续性

对来自具有VL<40cp/ml的HIV+患者的CSF中与来自健康捐献者 的CSF中的细胞因子/趋化因子水平的比较揭示了HMGB1、抗 HMGB1、IP-10和MCP-1的持续性(图11)。因此这些数据显示，不论 VL抑制如何而持续存在的神经病症与CSF中抗HMGB1、IP-10和 MCP1水平的升高相关。

血清抗HMGB1 Abs不论病毒复制的抑制如何仍可将2至4期患 者与1期患者区分开。

据发现抗HMGB1 Abs在2至4期的HIV+患者中与1期HIV+患 者(不存在神经问题)相比仍显著增加，但所有这些患者均显示出无法检 测的VL水平(<40cp/ml)(图12A)。图12B和12C显示，2、3、4期患 者与1期患者相比，均未发现HMGB1、IP-10或MCP-1水平的不同， 也未发现nCD4T细胞、nCD8T细胞、最低点CD4、或活化的CD4 和CD8T细胞百分比的不同。因此，抗HMGB1水平代表了唯一的将 2、3、4期患者与1期患者区分开的因素。

具有受抑制的病毒载量的2、3、4期患者中的抗HMGB1、MCP1、 IP-10和免疫活化之间的相关性

为了理解抗HMGB1水平不论受控病毒载量如何而持续存在的原 因，分析了与临床(疾病)进程相关的不同参数之间的Spearman相关性。 图13显示，抗HMGB1水平与IP-10和MCP-1水平正相关(其自身与 免疫活化状态相关)，如通过HLA-DR和CD38在CD4和CD8T细胞 上的表达所测定(图13B)。如已在整个同期组中所观测(如上文所述)， 免疫活化的状态与通过CD4T细胞数测定的疾病进展相关(图13C)。 综上，这些数据表明，在具有受抑制的病毒载量的患者中检测到持续 的免疫活化，从而驱动抗HMGB1 Abs的产生。在整个患者同期组(1 至4期，具有不同病毒载量)(图9A)以及在具有受抑制的病毒载量的2、 3、4期患者中均发现了血清抗HMGB1和HMGB1 Abs之间的负相关， 这表明所述抗体的体内中和活性。

对表征患者同期组的免疫学参数的研究主要以两个目的进行：

(1)将分析延伸至整个同期组(n=106名患者)的血清，以便确定在 具有3和4期的分期以及具有HAND/无HAND分期的CSF中报道的 分子特征标志是否也见于患者血清中；和

(2)评估对基底神经节的体积变化和与CNS改变有关的代谢变化 进行鉴定的磁共振成像(MRI)是否与该分子特征标志相关。

III.循环HMGB1蛋白水平和总抗HMGB1抗体水平是区分HAND患者与非HAND患者的唯一参数

为了限定HAND，使用Antinori等(Neurology.2007年10月30日; 69(18):1789-99)提出的标准。考虑了与1期至4期分期的以下对应性： 非HAND(1期和2期)；HAND(3期和4期)。

图14显示了表征所研究的患者同期组的临床和免疫学参数。这些 患者的大部分(81%)接受了强力抗逆转录病毒疗法，且67%具有受抑制 的病毒载量。由CD4计数所测定的免疫缺陷为中等，而最低点CD4 计数(即从感染开始起所达到的最低CD4值)不低。考虑到在处于AIDS 阶段的未受治疗患者中，60%至100%的CD8⁺T细胞共表达活化标记 物CD38和HLA-DR，免疫活化程度为中等。

这些患者中的三分之一患有HAND(详细信息见下文)，且与非 HAND组的比较没有显示出与病毒载量、CD4和最低点CD4计数、病 毒血症患者比例以及免疫活化水平有关的差异。

令人惊奇的是，这两组之间的唯一显著差异在于所检测的HMGB1 和抗HMGB1抗体(分别为p=0.006和p=0.05，非参数Mann-Witney测 试)。IP-10和MCP-1血清水平在HAND和非HAND患者之间无法进 行区分(图14)。HAND和非HAND患者中的免疫学和病毒学参数的相 似性如图15中的直方图所示。

如上所述，HMGB1和抗HMGB1是区分这两组患者的仅有两个参 数(图16)。该区分不依赖于RNA病毒载量，因为其在无病毒血症患者 (VL<40份拷贝/ml)中也观测到。

虽然IP-10和MCP-1趋化因子水平在HAND和非HAND患者之 间不具有统计性差异(图14)，但据发现其在感染期间的生产与持续性 免疫活化、抗HMGB1和MCP-1水平以及疾病进程正相关，从而表明 慢性炎症是造成趋化因子释放的原因(图17和18)。这些观测证实了此 前对于HIV感染患者的CSF所报道的结论(实施例IIa和图5、6、7)。

IV.与患HAND的HIV感染患者的基底神经节中的体积和代谢变化相关的免疫学特征标志

每名患者进行了探索广大范围的认知域的神经学测试。根据NP 测试结果，将患者分为两组，患HAND和未患HAND的患者(参见上 文Antinori等)。对某些患者进行MRI分析。创建平均三维图像，并进 而与数字脑图谱(来自Montreal Neurological Institute)融合，其中已鉴定 出左和右基底神经节(BG)。这使得对于每个图像可以计算扩张或收缩 的体积和量(通过Jacobian值测定)。小于1的值表明对象图像相对于模 板扩张，而大于1的值表明体积减少。计算了BG的代谢变化。胆碱/N- 乙酰天冬氨酸(Cho/NAA)是神经元炎症的标记物，且如此前文献中所述 进行确定(Ratai EM等，PLoS One.2010年5月7日;5(5):e10523; Yiannoutsos CT等，Neuroimage.2008年3月1日;40(1):248-55；Paul RH 等，J Neuropsychiatry Clin Neurosci.2007年夏;19(3):283-92Greco JB 等，Magn Reson Med.2004年6月;51(6):1108-14.Meyerhoff DJ等， AJNR Am J Neuroradiol.1996年5月;17(5):973-8)。在认知受损的HIV 感染患者的BG中，Cho/NAA比值通常增加。

图19A显示了患HAND的患者具有更大的壳核(Jacobian值小于1； p=0.008)。患HAND的患者在BG的MRI谱上具有更高的Cho/NAA 比值(图19B)。体积参数和代谢参数之间的关系如图19C所示：更大的 壳核体积与高于0.575的Cho/NAA比值相关(p=0.02)。

为了研究神经学和免疫学参数之间的可能关系，根据Cho/NAA比 值对患者分组，并比较了免疫标记物。图20显示，免疫活化的增加 (CD8⁺CD38⁺HLA-DR⁺T细胞%)以及高水平的抗HMGB1和IP-10与 Cho/NAA比值的增加相关。

结论

对于在来自HIV感染患者(某些罹患AIDS相关神经病症)的血清和 CSF中检测的可溶性介导物的上述详细分析显示，在CSF中，由抗 HMGB1抗体(对释放的HMGB1反应)的重要水平表征的炎症状况与趋 化因子IP-10的高表达相关。趋化因子已涉及如多发性硬化(MS)等神 经病症的免疫发病机理，特别是据报道IP-10在炎症显著时在来自MS 患者的CSF中增加(Scarpini E等，J Neurological Sciences 195:41,2002)。 在HIV感染患者中，有研究报道IP-10水平在具有原发性无症状HIV 感染和AIDS痴呆综合症的受试对象中增加，且与CSF病毒载量正相 关(Paola Cinquea等，Cerebrospinal fluid interferon-γ-inducible protein 10 (IP-10,CXCL10)in HIV-1 infection.J Neuroimmunology 2005)。IP-10是 强力化学吸引剂，且据表明其增强逆转录病毒感染并介导神经元损害。 MCP1的促炎性性质及其上调HIV-1复制的能力也据表明会促进向较 高痴呆风险的发展。MCP-1可促进受感染和/或活化的单核细胞迁移至 大脑内，在此成为HIV-1复制的宿主细胞并通过活化巨噬细胞、小神 经胶质细胞和星形胶质细胞而导致释放大量强力神经毒素(Dhillon等， Roles of MCP-1in development of HIV-dementia.Front Biosci.2008,13: 3913–3918)。本发明人的观察提出了新发现，证明了报警蛋白(alarmin) HMGB1且最重要的是针对该报警蛋白的特异性抗体在来自2至4期的 HIV感染患者的CSF中被检测到，且其代表着与病毒复制和疾病进程 的相关性。而且，具有受抑制病毒复制的患者中的抗HMGB1抗体的 持续性是2至4期的决定因素。

对于非HAND/HAND同期组的结果显示，HAND与炎性模式相关， 后者可用MRI(更大的壳核、增加的Cho/NAA)和/或通过免疫标记物(包 括周围T细胞上的活化标记物(CD38和HLA-DR表达))和/或炎性介导 物来揭示。该研究首次显示，总的血清抗HMGB1抗体与IP-10水平与 患HAND患者的BG变化相关，从而证实了在发展出HAND的患者的 血液中测定这两种分子的重要性。重要的是，这些观察首次将MRI和 与HAND相关的波谱参数(如更大的壳核和增加的Cho/NAA水平)与免 疫学参数(抗HMGB1抗体和IP-10)和免疫活化/炎症标记物联系起来。 这些结果表明，HMGB1/抗HMGB1抗体、IP-10、MCP-1的组合是对 CNS中的局部感染的响应和贡献性决定因素。本申请表明，分子特征 标志抗HMGB1抗体和IP-10和/或MCP-1可用于对如AIDS等其中据 显示涉及HMGB1的疾病(不管是否具有神经病症)的诊断和预后。

变化方式和其它实施方式

在不脱离本发明的范围和主旨的情况下，所公开的产品、组合物 和方法以及本发明的概念的各种改动和变化对于本领域技术人员都是 显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方式对本发明进行了描述， 应该理解的是，所要求保护的发明并非意在受限于这些具体实施方式。 对于医学、免疫学、生物学、化学或药物学领域技术人员显而易见的 那些对本发明所述的具体实施方式的各种变化应该包含在所述权利要 求的范围之内。

参考文献的并入

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