一种灵芝孢子油或灵芝孢子粉或其制剂的质量检测方法

摘要

本发明公开了一种灵芝孢子油或灵芝孢子粉或其制剂的质量检测方法。用高效液相色谱法测定其产品中含1,2-二油酸-3-亚油酸-甘油三酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸-甘油三酯，1,2-二亚油酸-3-油酸-甘油三酯的含量,1,3-二棕榈酸-2-油酸-甘油三酯，每1g灵芝孢子粉、灵芝孢子油或相当于1g灵芝孢子粉、灵芝孢子油的制剂中含1,2-二油酸-3-亚油酸-甘油三酯的量分别是15.0mg～60.0mg、50.0mg～200.0mg，或含1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸-甘油三酯12.0mg～50.0mg、40.0mg～150.0mg，或含1,2-二亚油酸-3-油酸-甘油三酯10.0mg～50.0mg、30.0mg～140.0mg，或含1,3-二棕榈酸-2-油酸-甘油三酯5.0mg～30.0mg、15.0mg～80.0mg，该方法可有效检测产品的质量，可操作性强，重现性高，特异性强。

说明书

技术领域

本发明涉及药品或保健食品质量分析方法，具体地说，涉及一种灵芝孢子油 或灵芝孢子粉或其制剂的质量检测方法。

背景技术

灵芝是担 子菌纲多孔菌科（Polyproraceae）灵芝属（Ganoderma）真菌赤芝 【Ganoderma  lucidium(Leyss.ex Fr.)Karst.】和紫芝Ganoderma  japonicum(Fr.)Lloyd]的总称，具有扶正固本等功效，被《本经》称为上品。灵芝 孢子（Ganoderma lucidiumspore）是赤芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的 孢子，为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质，其药用价值也正日益 受到重视。灵芝孢子的药理作用主要有抗肿瘤、免疫调节、调节血脂以及对神经、 心血管和呼吸系统有调节改善作用。关于灵芝孢子的产品也很多，如灵芝孢子油 软胶囊，灵芝孢子粉胶囊，但真假难分，质量优劣难分，目前还未有一种较全面 的检测质量的方法。

灵芝孢子的化学成分复杂，文献报道有以下几类：甾醇类、三萜类、生物碱 类、脂肪酸类、内酯、蛋白质和氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素和无机 离子类等。文献报道控制灵芝孢子粉质量主要集中在水溶性成分灵芝多糖的含量 测定，而对脂溶性成分的含量测定主要是用紫外光谱法测定灵芝孢子油中的总三 萜含量，但灵芝孢子油中的三萜的含量很少，测定时专属性不强，在其它植物油 用同样的方法中也能测定该类成分。

灵芝孢子中含有较高含量的脂肪油，约20～30%，可通过提取方法得到灵芝 孢子油。灵芝孢子油主要含有脂肪酸酯及甾醇类，已有专利及文献报道过灵芝孢 子油中1，2-二油酸-3-棕榈酸-甘油三酯、甘油三油酸酯及麦角甾醇的含量测定方 法。如专利号CN 100473389C中报道一种测定灵芝孢子粉或灵芝孢子油及其制 剂中1，2-二油酸-3-棕榈酸-甘油三酯或甘油三油酸酯含量的方法，CN 100515434C报道一种测定灵芝孢子粉或灵芝孢子油及其制剂中麦角甾醇含量的 方法。CN 101518551A报道一种测定灵芝孢子油乳剂中1，2-二油酸-3-棕榈酸- 甘油三酯，甘油三油酸酯含量及麦角甾醇含量的方法。但1，2-二油酸-3-棕榈酸 -甘油三酯或甘油三油酸酯只是灵芝孢子油中的其中二种甘油三酯类，这两种甘 油三酯类约占灵芝孢子油中的比例为30～45%，而1,2-二油酸-3-亚油酸-甘油三 酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸-甘油三酯，1,2-二亚油酸-3-油酸-甘油三酯，1,3- 二棕榈酸-2-油酸-甘油三酯也是灵芝孢子油中的甘油三酯类成分，因此建立灵芝 孢子粉、灵芝孢子油及其制剂中1,2-二油酸-3-亚油酸-甘油三酯，1-棕榈酸-2- 油酸-3-亚油酸-甘油三酯，1,2-二亚油酸-3-油酸-甘油三酯，1,3-二棕榈酸-2-油酸- 甘油三酯的含量测定方法是进一步检测其质量的一种有效方法。到目前为止，还 没有文献报道用1,2-二油酸-3-亚油酸-甘油三酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸-甘 油三酯，1,2-二亚油酸-3-油酸-甘油三酯，1,3-二棕榈酸-2-油酸-甘油三酯的含量 来评价灵芝孢子粉或灵芝孢子油及其制剂的质量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能有效检测灵芝孢子粉， 灵芝孢子油及其制剂的质量的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种灵芝孢子油或灵芝孢子粉或其制剂的质量检测方法，用高效液相色谱法 测定其产品中含1,2-二油酸-3-亚油酸-甘油三酯(简称OOL），1-棕榈酸-2-油酸-3- 亚油酸-甘油三酯(简称POL），1,3-二棕榈酸-2-油酸-甘油三酯(简称POP），1,2- 二亚油酸-3-油酸-甘油三酯（简称LLO）,每1g灵芝孢子粉、灵芝孢子油或相当 于1g灵芝孢子粉、灵芝孢子油的制剂中含1,2-二油酸-3-亚油酸-甘油三酯的量分 别是15.0mg～60.0mg、50.0mg～200.0mg，或含1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸-甘油 三酯12.0mg～50.0mg、40.0mg～150.0mg，或含1,2-二亚油酸-3-油酸-甘油三酯 10.0mg～50.0mg、30.0mg～150.0mg，或含1,3-二棕榈酸-2-油酸-甘油三酯5.0mg～ 30.0mg、15.0mg～80.0mg。

所说的高效液相色谱法是按下述步骤进行：

一、供试品溶液的制备：

（1）灵芝孢子油及其制剂的制备：取5mg～100mg灵芝孢子油及其含灵芝孢子 油5mg～100mg的制剂，以每1mg加0.2～1ml的流动相，溶解并定溶，摇匀， 即得，所用流动相与色谱条件中的流动相相同；（2）灵芝孢子粉及其制剂供试品 的制备：取灵芝孢子粉0.1～10g或含灵芝孢子粉0.1～10g的制剂，采用乙醚提 取，回收溶剂得灵芝孢子粉提取物，以每1mg加0.2～1ml的流动相，溶解并定 溶，摇匀，即得，所用流动相与色谱条件中的流动相相同；

二、对照品溶液的制备：取1,2-二油酸-3-亚油酸-甘油三酯，1-棕榈酸-2- 油酸-3-亚油酸-甘油三酯，1,2-二亚油酸-3-油酸-甘油三酯，1,3-二棕榈酸-2-油酸- 甘油三酯对照品，加同供试品溶液的流动相溶解并定溶，摇匀，配成每1ml含 1,2-二油酸-3-亚油酸-甘油三酯0.35～0.55mg，或1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸-甘 油三酯0.15～0.35mg，或1,2-二亚油酸-3-油酸-甘油三酯0.15～0.35mg,或1,3-二 棕榈酸-2-油酸-甘油三酯0.15～0.35mg。

三、色谱条件：用十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈、异丙醇、二氯甲烷 以任意比例的二元或三元组成混合液为流动相，流动相的流速为0.5～2.0ml/min； 用蒸发光散射检测器或差示折光率检测器检测；理论板数按1,2-二油酸-3-亚油酸 -甘油三酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸-甘油三酯，1,2-二亚油酸-3-油酸-甘油三 酯，1,3-二棕榈酸-2-油酸-甘油三酯计算，均应不低于2000；色谱柱温为10～50℃；

四、测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20ul，注入高效 液相色谱仪，测定，取对数计算，即得。

高效液相色谱法的具体操作方法可按中国药典附录规定的常规技术进行。

为了有效而正确地取得测定数据，高效液相色谱法测定法步骤三的色谱条件 中采用蒸发光散射检测器检测为佳。

所述步骤三的色谱条件中是采用乙腈：异丙醇的体积比为40～60：60～40 或乙腈：二氯甲烷的体积比为40～60：60～40作为流动相为较佳流动相，以乙 腈：异丙醇的体积比为53：47或乙腈：二氯甲烷的体积比为59：41作流动相为 最佳流动相。所说的步骤三的色谱条件中色谱柱最佳柱温：30℃；最佳流动相的 流速1.0ml/min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：该检测方法能准确的测定灵芝 孢子粉、灵芝孢子油及制剂中的OOL、POL、LLO及POP的含量或四者之一， 可作为该产品质量检测的方法和依据，方法简便，可操作性强，重现性高，是检 测灵芝孢子粉和灵芝孢子油及其制剂质量的有效方法。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1高效液相色谱法测定灵芝孢子油中含量的方法的研究

（1）仪器与试药

仪器：Waters2695高效液相色谱仪，色谱柱：KromasilC₁₈柱（4.6mm×250mm, 5μm）,Sedex75蒸发光散射检测器。

试药：对照品OOL、POL、LLO及POP对照品由Sigma-Aldrich公司提供； 灵芝孢子油由广州某公司提供，乙腈和异丙醇为色谱纯；其它试剂均为分析纯。 （2）供试品溶液的制备：称取灵芝孢子油100.34mg，精密称定（去掉），用流 动相定容到25ml，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，采用乙腈：异丙醇的体积 比为53：47的溶液作流动相；

对照品溶液的制备：a、称取OOL对照品10.31mg，加流动相定容到25ml， 即得OOL浓度为0.4124mg/ml的对照品溶液；

b、取POL对照品7.06mg，加流动相定容到25ml，即得POL浓度为0.2824 mg/ml的对照品溶液；

c、取LLO对照品6.48mg，加流动相定容到25ml，即得LLO浓度为 0.2592mg/ml的对照品溶液；

d、取POP对照品4.95mg，加流动相定容到25ml，即得POP浓度为0.198 mg/ml的对照品溶液。

（3）色谱条件

色谱柱：KromasilC₁₈柱（4.6mm×250mm,5μm）；柱温：30℃；流动相用乙 腈—异丙醇的体积比为53：47的溶液；流速为1.0ml/min；用Sedex75蒸发光散 射检测器。

（4）线性关系考察

精密量取对照品溶液（mg/ml)OOL、POL、LLO，POP以5，10，15，20， 25，30μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。以进样量(μg)为横坐标，以峰 面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1：

表1线性关系实验数据（n=6）

OOL：lg A＝1.41lgm+5.44，R²=0.9997

POL：lg A＝1.56lgm+5.47，R²=0.9991

LLO：lg A＝1.71lgm+4.59，R²=0.9991

POP:lg A＝1.81lgm+4.83，R²=0.9997

以上结果表明：OOL在2.061～12.372ug范围内、POL在1.412～8.472ug范 围内、LLO在1.296～7.776ug范围内、POP在0.990～5.940ug范围内，呈良好 的线性关系。

(5)精密度试验：取对照品溶液各10μL，重复进样6次，OOL、POP、LLO及 POP峰面积的RSD<2%，结果见表2。

表2精密度试验数据（n=6）

试验证明，精密度良好。

（6）稳定性试验：取样品供试液分别于0,2,4,6,9,12小时，分别进样10μL，测 得样品中OOL、POL、LLO、POP峰面积的RSD<2%，结果见表3。

表3稳定性试验数据（n=6）

试验结果表明，样品供试液在12小时内稳定性良好。

（7）重现性试验

照含量测定方法项下操作，对同一批样品6份进行测定，OOL、POL、LLO、 POP含量的RSD<2%，结果见表4。

表4重现性试验数据

（8）加样回收试验

取同批灵芝孢子油样品6份，各约50mg，精密称定后，加入一定量的OOL、 POL、LLO、POP对照品，照含量测定项下操作，结果见表5。

表5加样回收试验结果

试验结果表明：OOL回收率在98.23～102.36%之间、POL回收率在97.39～ 102.34%之间、LLO回收率在98.28～101.31%之间、POP回收率在98.46～102.69% 之间，加样回收良好。

（9）含量测定

灵芝孢子油中OOL、POL、LLO、POP含量测定，照上述含量测定的方法 操作，测定了3个样品灵芝孢子油中OOL、POL、LLO、POP的含量，结果见 表6。

表6样品中OOL、POL、LLO、POP的含量测定结果

  样品   1   2   3   OOL含量（mg/g)   110.15   135.84   105.63   POL含量（mg/g)   75.64   87.67   73.61   LLO含量（mg/g)   60.19   74.29   58.87   POP含量（mg/g)   34.82   41.67   27.64

测得三批灵芝孢子油中每1g含OOL、POL、LLO、POP的含量分别在105.63～ 135.84mg、73.61～87.67mg、58.87～74.29mg、27.64～41.67mg之间。

实施例2灵芝孢子油乳剂中OOL、POL、LLO、POP的含量测定

色谱条件用十八烷基健合硅胶为填充剂；色谱柱：KromasilC₁₈柱 （4.6mm×250mm,5μm）；柱温：30℃；流动相用乙腈：异丙醇的体积比为40： 60的溶液；蒸发光散射检测器检测；流速为0.5ml/min;理论板数按OOL或POL 或LLO或POP峰计算，均大于2000。

对照品溶液的制备：取OOL、POL、LLO、POP对照品4.53mg，2.85mg, 2.39mg,2.16mg置于10ml量瓶中，加流动相溶液溶解并稀释至刻度，制成每1ml 分别含OOL、POL、LLO及POP分别是0.453mg/ml,0.285mg/ml、0.239mg/ml、 0.216mg/ml的溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取含灵芝孢子油乳剂（广州某公司提供）1.15g,加流 动相溶液溶解并定容至25ml，即得供试品溶液。

测定结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入高效液相色 谱仪，测定，取对数计算，即得。每1g乳剂含OOL、POL、LLO、POP的含量 分别在11.15mg、7.432mg、5.949mg、3.505mg。

实施例3灵芝孢子油中OOL含量测定

色谱条件用十八烷基健合硅胶为填充剂；色谱柱：KromasilC₁₈柱 （4.6mm×250mm,5μm）；柱温：30℃；流动相用乙腈：异丙醇的体积比为60： 40的溶液；蒸发光散射检测器检测；流速为0.8ml/min;理论板数按OOL计算， 大于2000。

对照品溶液的制备：取OOL对照品4.87mg，置于10ml量瓶中，加流动相溶液 溶解并稀释至刻度，制成每1ml含0.487mg的溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取灵芝孢子油102.31mg,加流动相溶液溶解并定容至 25ml，即得供试品溶液。

测定结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入高效液相色 谱仪，测定，取对数计算，即得。每1g灵芝孢子油中含OOL为112.63mg。

实施例4灵芝孢子油中POL含量测定

色谱条件用十八烷基健合硅胶为填充剂；色谱柱：KromasilC₁₈柱 （4.6mm×250mm,5μm）；柱温：30℃；流动相用乙腈：二氯甲烷的体积比为59： 41的溶液；蒸发光散射检测器检测；流速为0.8ml/min;理论板数按OOL计算， 大于2000。

对照品溶液的制备：取POL对照品2.54mg，置于10ml量瓶中，加流动相 溶液溶解并稀释至刻度，制成每1ml含POL的0.254mg溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取灵芝孢子油102.32mg,加入流动相溶液溶解并定容 至25ml，即得供试品溶液。

测定结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入高效液相色 谱仪，测定，取对数计算，即得。每1g灵芝孢子油中含POL为75.54mg。

实施例5灵芝孢子油中LLO含量测定

色谱条件用十八烷基健合硅胶为填充剂；色谱柱：KromasilC₁₈柱 （4.6mm×250mm,5μm）；柱温：30℃；流动相用乙腈：异丙醇：二氯甲烷的体 积比为50：35：15的溶液；蒸发光散射检测器检测；流速为1.0ml/min;理论板 数按OOL计算，大于2000。

对照品溶液的制备：取LLO对照品2.65mg，置于10ml量瓶中，加流动相溶 液溶解并稀释至刻度，制成每1ml含LLO为0.265mg溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取灵芝孢子油101.24mg,加流动相溶液溶解并定容至 25ml，即得供试品溶液。

测定结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入高效液相色 谱仪，测定，取对数计算，即得。每1g灵芝孢子油中LLO含为68.42mg。

实施例6灵芝孢子粉中OOL、POL、LLO、POP含量测定

色谱条件用十八烷基健合硅胶为填充剂；色谱柱：KromasilC18柱 （4.6mm×250mm,5μm）；柱温：30℃；流动相用乙腈：二氯甲烷的体积比为40： 60的溶液；蒸发光散射检测器检测；流速为1.0ml/min；理论板数按OOL、或 POL、或LLO、或POP计算，均大于2000。

对照品溶液的制备：取OOL、POL、LLO、POP对照品5.42mg，2.38mg, 2.93mg,2.75mg置于10ml量瓶中，加流动相溶液溶解并稀释至刻度，制成每1ml 分别含OOL、POL、LLO、POP分别是0.542mg/ml,0.238mg/ml、0.293mg/ml、 0.275mg/ml的溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取灵芝孢子粉650.32mg,置索氏提取器中，加入乙醚 50ml，于水浴加热提取8小时，提取液回收乙醚至干，残渣以流动相溶解，定容 至50ml，即得供试品溶液。

测定结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入高效液相色 谱仪，测定，取对数计算，即得。每1g灵芝孢子粉中OOL、POL、LLO、POP 分别为36.15mg、22.85mg、19.52mg、10.84mg。