荧光猝灭体系存在内滤效应时荧光猝灭率的精确校正方法

摘要

本发明公开了一种荧光猝灭体系存在内滤效应时荧光猝灭率的精确校正方法，其特征是首先校正竞争吸收对光谱的影响，然后校正再吸收对光谱的影响；再校正吸收分布对光谱的影响。本发明方法对荧光内滤效应和吸收分布的影响同时进行联合校正，确保了能够对猝灭体系的光谱实现精确校正，获得真实反映猝灭过程的荧光猝灭率。

说明书

技术领域

本发明涉及荧光光谱分析，特别是在存在荧光内滤效应的情况下，荧光猝灭测试中的光 谱分析方法。

背景技术

荧光分析法是根据物质的荧光谱（包含强度、形状等参数）进行物质鉴定及含量测定的 方法，其中荧光猝灭法可用于分析某些自身荧光较难检测但具有猝灭特性的物质的含量，也 可以用来分析荧光猝灭过程中两种物质之间（即荧光物质与猝灭剂之间）的能量转移或电子 转移。

对于荧光猝灭体系，当荧光物质和猝灭剂的吸收谱及相应的荧光谱之间存在较为严重地 交迭时，荧光检测就会不可避免地受到荧光内滤效应（IFE）的干扰。内滤效应按其作用机制 可分为竞争吸收（primary IFE）和再吸收（secondary IFE）两个过程，会直接影响荧光谱的 强度和谱形，而光谱的强度、形状等参数是荧光分析的根本依据，因此，如果不对内滤效应 的影响加以校正，就无法得到正确的荧光分析结果。

测量过程中，加入猝灭剂后混合样品中的荧光试剂对激发光的吸收分布较之加入猝灭剂 前纯荧光试剂对激发光的吸收分布会发生变化，这种吸收分布上的差异，同样会对荧光强度 产生影响、干扰光谱分析结果，在定量检测时，也必须予以校正。

由吸收分布形成的影响与荧光内滤效应的影响相伴而生、同时出现，共同造成荧光猝灭 率虚高的赝象。目前已有的校正技术仅针对荧光内滤效应进行单独校正，而忽略了与之同时 出现的吸收分布所带来的影响，因而从根本上无法对所得荧光猝灭率数据进行精确校正、得 到真实的猝灭率，制约了荧光猝灭法的应用。

发明内容

本发明为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种荧光猝灭体系存在内滤效应时 荧光猝灭率的精确校正方法，所述荧光猝灭体系是指：存在荧光内滤效应、且荧光试剂与猝 灭剂混合后不生成基态复合物的荧光测试样品。利用本发明所给出的校正方法，可以对荧光 内滤效应及吸收分布所产生的影响同时进行精确校正，从而得到能够真实反映荧光猝灭过程 的实际猝灭率。

本发明解决技术问题采用如下技术方案：

本发明荧光猝灭体系存在内滤效应时荧光猝灭率的精确校正方法的特点是按如下步骤进 行：

a、校正竞争吸收对光谱的影响：

以函数I₁(λ)表示未加入猝灭剂之前荧光物质受激发后所产生的荧光测量谱，以函数 I₁'(λ)表示加入猝灭剂后荧光物质实际发出的荧光谱，则有：

${I_1}^{\prime }\left(\lambda \right)=\frac{{10}^{-\Delta E_1}(1-{10}^{-\Delta E_2})[1-{10}^{-n\left(\Delta E_1+\Delta E_2\right)}]}{(1-{10}^{-n·\Delta E_2})[1-{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}]}\times I_1\left(\lambda \right)---\left(1\right)$

式（1）中，ΔE₁=ε₁c₁Δl为猝灭剂对应激发波长的元消光度；ΔE₂=ε₂c₂Δl为荧光物质对 应激发波长的元消光度；Δl为样品细分单元层的厚度；n为样品细分单元层的层数；ε₁为猝 灭剂对应激发波长的摩尔吸收系数；ε₂为荧光物质对应激发波长的摩尔吸收系数；c₁为猝灭 剂的摩尔浓度；c₂为荧光物质的摩尔浓度。

令：测量荧光谱时所用样品池的宽度和厚度均为L，设想将样品池中的样品细分为一系 列与激发光垂直的等厚单元层，则Δl、n、L三者间的关系为：n×Δl=L；

b、校正再吸收对光谱的影响：

以函数I₂(λ)表示加入猝灭剂后混合样品的荧光测量谱，以函数I₂'(λ)表示经猝灭过程后 实际发生的荧光谱，则有：

${I_2}^{\prime }\left(\lambda \right)={10}^{\frac{n}{2}\Delta E_1\left(\lambda \right)}\times I_2\left(\lambda \right)---\left(2\right)$

式（2）中，ΔE₁(λ)=ε₁(λ)c₁Δl为猝灭剂与波长相关的元消光度函数；ε₁(λ)为猝灭剂与 波长相关的摩尔吸收系数函数；c₁为猝灭剂的摩尔浓度；Δl为样品细分单元层的厚度；n为 样品细分单元层的层数。

c、校正吸收分布对光谱的影响：

①任选一种荧光试剂配制成溶液，然后逐次稀释降低溶液的浓度，记录浓度值、并测量 相应的荧光谱；对于不同浓度值所对应的荧光谱，分别利用比尔定律计算样品对激发光的吸 收量以及样品池前十分之一光程对激发光的吸收与总吸收的百分比D_i，并计算相应的荧 光积分强度S_i；

②计算荧光积分强度S_i与样品对激发光的吸收量的比值，并进行归一化处理，得到的 数据C_i；

③根据样品池前十分之一光程对激发光的吸收与总吸收的百分比D_i和数据C_i，做出二者 的关系曲线C(d)；

④针对步骤a中函数I₁(λ)所代表的荧光测量谱，利用比尔定律计算荧光物质在前十分之 一光程内对激发光的吸收与总吸收的百分比D_j1,并根据关系曲线C(d)确定与D_j1对应的参 数值C_j1；

⑤针对步骤b中函数I₂(λ)所代表的荧光测量谱，利用（3）式计算荧光物质在前十分之 一光程内对激发光的吸收与总吸收的百分比D_j2,并根据关系曲线C(d)确定与D_j2对应的参 数值C_j2；

$I_X=I_0·{10}^{-\Delta E_1}·(1-{10}^{-\Delta E_2})·[1-{10}^{-n(\Delta E_1+\Delta E_2)}]/[1-{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}]---\left(3\right)$

式（3）中，I₀为入射激发光强度，I_X为加入猝灭剂后荧光物质对激发光的吸收；

d、计算荧光猝灭率：

分别计算函数I₁'(λ)和I₂'(λ)的荧光积分强度，记为I_1s'和I_2s'，然后按（4）式计算猝灭 率Q：

$Q=\frac{{I_{\mathrm{ls}}}^{\prime }}{C_{j1}}·\frac{C_{j2}}{{I_{2s}}^{\prime }}---\left(4\right)$

荧光猝灭率的原本定义为：荧光猝灭率=（荧光物质原有的荧光-加入猝灭剂之后的荧光） /荧光物质原有的荧光，当考虑使用Stern-Volmer方程时，更多地会直接计算荧光物质原有的 荧光与加入猝灭剂之后的荧光的比值，式（4）即由后一种形式导出，计算结果消除了荧光内 滤效应及吸收分布的影响，与实际猝灭过程相对应。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

1、当荧光物质和猝灭剂的吸收谱及相应的荧光谱之间存在较为严重地交迭时，使用常规 设备进行荧光检测时就会不可避免地受到荧光内滤效应的干扰，形成猝灭率虚高的赝象。已 有的校正技术仅针对荧光内滤效应进行单独校正，却忽略了与之同时存在的、荧光物质对激 发光的吸收深度的差异所造成的影响，因而无法真正实现光谱的精确校正。本发明所述校正 方法对荧光内滤效应和吸收分布的影响同时进行联合校正，确保能够对所述猝灭体系的光谱 实现精确校正，获得真实反映猝灭过程的荧光猝灭率。

2、本发明所述校正方法在实际操作中简便易行，无需增加新的投入，利用Origin或其 他软件进行简单的数学运算即可彻底去除内滤效应和吸收分布的影响。这使得利用常规设备 进行荧光猝灭分析时，不会再受到荧光内滤效应的制约，不仅扩大了荧光猝灭法的应用范围， 同时有利于降低研究成本。

附图说明

图1为对应低吸光度的激发光理想吸收分布示意图；

图2为对应高吸光度的激发光非理想吸收分布示意图；

图3为利用本发明对五聚噻吩（5T）与富勒烯（C₇₀）的猝灭光谱数据进行校正的结果， 横坐标为激发波长，纵坐标为加入猝灭剂前的荧光与加入猝灭剂后的荧光的比值；

图中标号：1样品池；2激发光；3样品发出的均匀的荧光；4样品池；5激发光；6样品 发出的非均匀荧光。

具体实施方式

本发明方法按如下过程进行：

1、按照本发明技术方案中步骤c中①、②、③执行，测定D_i和C_i的关系曲线C(d)。

理论上，荧光强度是与样品对激发光的吸收成正比的，但实验中发现，当样品浓度高于 某一数值后，反而会出现荧光强度大幅下降的现象，这是由样品对激发光吸收分布的变化引 起的。理想状态下，如图1所示，样品池1中样品对激发光2的吸收分布及其发出的荧光都 是均匀的，此时样品发出的均匀的荧光3能够最大限度地被光电探测器收集，仪器响应度最 高。当浓度增加时，如图2所示，样品池4内激发光5的衰减过程加快，靠近入射端的部分 吸收作用变强，远离入射端的部分吸收则明显减弱，对于样品发出的非均匀荧光6，由于光 谱仪中光电探测器对准样品池4的部位是相对固定的，这种吸收分布的变化（荧光的发光位 置变化）将导致进入光电探测器的荧光信号相应地减少，仪器响应度随之降低，使得荧光强 度检测值不升反降，此时荧光强度与样品对激发光的吸收不再保持正比关系。C(d)反映了不 同吸收分布条件下仪器对相同吸收量的响应，如果能够计算出吸收分布参数D_i，就可以根据 C(d)得到相应的校正系数C_i，进而对吸收分布的影响加以校正。吸收分布的影响是由仪器自 身的光路布置引起和决定的，因此对于同一台光谱仪，其关系曲线C(d)也是固定不变的，且 与测定时所使用的样品无关。只需通过一次测量获得关系曲线C(d)，就得到了该仪器关于吸 收分布的校正参数，在以后的其他校正过程中不再需要重复这一步骤。

2、用吸收谱仪分别测量荧光试剂和猝灭剂的吸收谱，获取它们的吸收谱函数，以供校正 计算时使用。若荧光试剂和猝灭剂的吸收谱函数已知，可省去这一步骤。

3、用荧光光谱仪测量纯荧光试剂的荧光谱I₁(λ)，然后利用式（1）对其进行校正处理， 获得光谱曲线I₁'(λ)，并根据I₁'(λ)计算出相应的荧光积分强度I_1s'；根据比尔定律计算出荧 光物质在前十分之一光程内对激发光的吸收与总吸收的百分比D_j1，由关系曲线C(d)确定与 D_j1对应的参数值C_j1；。

4、用荧光光谱仪测量荧光试剂与猝灭剂混合样品的荧光谱I₂(λ)；利用式（2）对其进行 校正处理，获得光谱曲线I₂'(λ)，并根据I₂'(λ)计算出相应的荧光积分强度I_2s'；对于混合液 体，无法简单地用比尔定律来计算出每个组分的吸收分布，可利用式（3）计算出荧光物质在 前十分之一光程内对激发光的吸收与总吸收的百分比D_j2,并根据关系曲线C(d)确定与D_j2对应的参数值C_j2；

关于式（1）、式（2）和式（3）的含义及推导，参见本申请发明人的授权专利：发明名 称为荧光猝灭分析中去除猝灭剂吸收影响的校正方法、专利号为ZL200810099357.4；物质的 吸光度决定其吸收分布，本实施例中选择前十分之一光程内对激发光的吸收与总吸收的百分 比作为吸收分布参数D_i，实际运用中也可直接以样品的吸光度做为吸收分布参数。

5、按照式（4）进行计算，得到精确校正后的荧光猝灭率Q。

不存在内滤效应时，荧光猝灭率可由加入猝灭剂前纯荧光试剂的荧光谱I₁(λ)和加入猝灭 剂后混合样品的荧光谱I₂(λ)直接获得。当存在内滤效应时，若仍直接用I₁(λ)和I₂(λ)计算， 会得到虚高的猝灭率。式（4）中，分别用I_1s'和I_2s'替代I₁(λ)和I₂(λ)，实现了对内滤效应 的校正，而C_j1和C_j2的引入，则是为了对吸收分布所产生的影响进行校正。

实施例：五聚噻吩（5T）与富勒烯（C₇₀）的荧光猝灭光谱的精确校正处理

5T的吸收谱及荧光谱与C₇₀的吸收谱之间都存在较大程度的交迭，其混合液不生成基态 复合物，受激发后5T的部分光致电子将向C₇₀转移，形成荧光的猝灭。溶剂采用邻二氯苯， 其在紫外/可见光范围内透明、无吸收。

吸收谱测量采用岛津公司的UV-2550紫外-可见光吸收光谱仪；荧光谱的检测则使用日立 公司的F-4500荧光光谱仪，配备恒温水浴；实验在25℃条件下完成。

关于吸收分布校正曲线C(d)的测定，选用三聚噻吩3T作为荧光试剂，用邻二氯苯作为 溶剂配制成初始浓度为2×10^-4mol/l的溶液，随后成倍稀释，并对每一浓度的样品进行荧光 检测，激发波长取355nm。对所得数据进行相关计算及归一化处理后，即可得到吸收分布的 校正曲线C(d)。理论上，每台光谱仪拥有自己独有的吸收分布校正曲线。

试验中分别使用不同的激发波长测量了加入C₇₀前、后5T的荧光谱，然后利用Origin 软件对实验数据进行相关校正处理，最终结果参见图3，图中虚线为C₇₀吸收谱的相对值。

图3中，圆点符号为未经任何校正直接计算得出的猝灭率，非常明显，它们在不同激发 波长条件下的大小不同，其轮廓与C₇₀的吸收谱之间呈现强烈的正相关性，这主要是由内滤 效应的影响所引起的；三角符号代表经内滤效应单独校正后所得的猝灭率，可以看出它们的 大小也不相同，仍然与C₇₀的吸收谱具有相关性，此时内滤效应的影响已被校正去除，吸收 分布成为主要的影响因素；方形符号则是对内滤效应和吸收分布的影响进行联合校正后所得 的猝灭率，它们的大小基本一致（残存的细小差异来自计算误差及实验误差），与激发波长及 C₇₀的吸收谱均已无关。

按照Stern-Volmer方程的描述，与光致电子转移对应的荧光猝灭率的大小与激发波长无 关。以上实施例表明，只有经过联合校正后，所得结果才与理论相符，这证明了本实施例中 校正方法是正确的，且具有良好的校正精度。