一种兼抗根结线虫和烟草疫霉的烟草内生菌及其应用

摘要

本发明涉及兼抗根结线虫和烟草疫霉的烟草内生菌及其应用，其特征在于：所用的生防微生物为芽孢杆菌

说明书

  

技术领域

本发明涉及一种兼抗根结线虫和烟草疫霉的烟草内生菌及其应用，属微生物农药技术领域。 

背景技术

植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌。植物内生细菌易于定殖在植物体内，相对于植物外生生防微生物，在定殖方面更具优势。 

栖居于同一生态位的根结线虫与土传病原菌协同侵染同一寄主引起的复合病害往往比单一病原病害造成的损失更大，也较难防治（Back MA, Haydock PPJ, Jenkinson P. 2002. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology, 51, 683–697）。根结线虫相关复合病害的首例报道来自根结线虫与尖孢镰刀菌复合侵染棉花（Atkinson GF, 1892. Some diseases of cotton. Alabama Polytechnical Institute of Agriculture – Experimental Station Bulletin, 41, 61–65）。迄今，根结线虫与植物病原真菌和病原细菌引起的复合病害在烟草、苜蓿、棉花、香蕉、咖啡，以及豆类、番茄等蔬菜作物已被广泛报道（孙翠平, 吴慧平, 杨传广. 2007. 合肥地区南方根结线虫入侵对番茄青枯病发生的影响. 安徽农业科学, 35(23),7196-7197）。由根结线虫和烟草疫霉分别引起烟草根结线虫病和烟草黑胫病是烤烟种植中的两大主要土传病害。而由根结线虫和烟草疫霉协同侵染引起的复合病害在云南、贵州、河南等主要烟区危害严重，损失巨大，防治难度较大（喻盛甫, 胡先奇, 王扬. 1999. 包含病原线虫的植物复合侵染病害. 植物病理学报，29(1), 1-7）。 

根结线虫与土传病原菌复合病害的防治难度体现在两个方面：一是采取的措施只有对病原线虫和病原菌均有效方能取得良好的防治效果，因为低密度的线虫或病原菌均可导致复合病害的发生和流行（Saeed IAM, MacGuidwin AE, Rouse DI. 1998. Effect of initial nematode population density on the interaction of Pratylenchus penetrans and Verticillium dahliae on ‘Russet Burbank’ potato. Journal of Nematology,30,100–107)；二是所需的化学农药剂量增加，如防治由棉花根黑腐病菌（T. basicola）和南方根结线虫（M. incognita）在棉花上引起的复合病害需要施用的化学农药剂量比控制单一的根结线虫病所需的剂量要高出30－50％（Wheeler TA, Hake KD, Dever JK, 2000. Survey of Meloidogyne incognita and Thielaviopsis basicola: their impact on cotton fruiting and producers management choices in infested fields. Journal of Nematology, 32, 576–83）。目前，从植物中筛选具有双抗功能的抗性基因并通过分子育种获得双抗品种是有效策略之一（Prabhu RR, Njiti VN, Bell-Johnson B. 1999. Selecting soybean cultivars for dual resistance to soybean cyst nematode and sudden death syndrome using two DNA markers. Crop Science, 39, 982-987）；采用轮作、土壤暴晒等栽培措施对复合病害亦有一定的控制效果。而具有环境友好、人畜安全特点的生物防治被认为是最有前景的防治措施之一。 

近年来，围绕根结线虫病的生物防治在生防资源、生防机制及应用方面均取得了实质性进展。巴氏杆菌属(Pasteuria)细菌中的P. penetrans、 P. ramose、 P. thornei、P. nishizawae、P. usage 等种类可专性寄生116属323种病原线虫；P. penetrans 在美国、日本等国家已被开发成商品化生物杀线虫剂并被广泛应用(Chen ZX, Dickson DW. 1998. Review of Pasteuria penetrans: biology, ecology, and biological control potential. Journal of Nematology, l30, 313–340)。形成毒性伴胞晶体的苏云金杆菌、球形芽孢杆菌是另一类重要的线虫生防资源，特别是以线虫为靶标的B. thuringiensis 晶体蛋白（crystal protein）被确定后（Wei JZ, Hale K, Carta L, Platzer E, et al. 2003. Bacillus thuringiensis crystal proteins that target nematodes. Proc Natl Acad Sci USA, 100(5), 2761-2765），Bt制剂已广泛用于线虫病的防治。其它生防细菌，如Brevibacillus laterosporus、Bacillus spp.可分泌蛋白酶等多种侵入酶破坏线虫体壁并侵入线虫体内（Huang XW, Tian BY, Zhang KQ.  2005. An extracellular protease from Brevibacillus laterosporus G4 without parasporal crystal can serve as a pathogenic factor in infection of nematodes. Research in Microbiology, 156, 719–727）。Bacillus、Pseudomonas 等29个属的根际细菌（rhizobacteria），Methylobacterium esteraomaticum、Klebsiella varians等植物内生细菌（endophytic bacteria），以及Xenorhabdus spp.、 Photorhabdus spp.等昆虫病原线虫内生细菌作为线虫的天敌微生物，可通过干扰线虫与寄主植物的识别、营养竞争、促进植物生长、诱导植物抗性、分泌侵入酶、抗生素和其它毒性物质等方式控制线虫（Tian By, Yang JK, Zhang KQ. 2007. Bacteria used in the biological control of plant-parasitic nematodes: populations, mechanisms of action, and future prospects. FEMS Microbiology Ecology, 61, 197–213）。生防细菌可分泌2-庚酮等挥发物诱惑线虫靠近并侵染线虫，进而分泌蛋白酶毒杀线虫（Niu QH, Huang XW, Zhang KQ. 2010. A Trojan horse mechanism of bacterial pathogenesis against nematodes. Proc Natl Acad Sci USA, 107(38), 16411-16412）。 

针对烟草黑胫病的生物防治也有诸多报道。Bacillus、Pseudomonas、Agrobacterium 等属的多种细菌可通过产生抗生素消解烟草疫霉菌的菌丝、孢子囊及游动孢子（Broadbent P, Baker KF, Waterworth Y. 1971. Bacteria and actinomyctes antagonistic to fungal root pathogens in Australian soil. Aust J Biol Sci, 24, 925-944）。在烟草根际建立生防菌种群有助于降低烟草疫霉的侵染，进而减少烟草黑胫病的发生（English JT, Mitchell DJ. 1988. Relationship between the development of root systems of tobacco and infection by Phytophthora parasitica var. nicotianae. Phytopathology, 78, 1478- 1483）。硅酸盐细菌能有效预防烟草黑胫病，减缓该病的蔓延（赵秀香, 陈华民, 吴元华. 2007. 硅酸盐细菌B925对烟草黑胫病菌的抑制作用及其16S rDNA 序列分析.烟草科技,3,56-60）。利用烟草内生菌B. subtilis Itb57菌株对烟草黑胫病的田间防效在61.25-72.49%之间，与化学农药甲霜锰锌相当（马冠华, 周常勇, 肖崇刚.2010. 烟草内生细菌Itb57的鉴定及其对烟草黑胫病的防治效果. 植物保护学报,37(2),148-152）。本项目组在烟草内生生防菌的研究中，从烟草品种NC297不同生长时期的烟叶中筛选出165株烟草疫霉拮抗菌，这些生防细菌分别归于6个属：Bacillus，Brevibacillus，Streptomyces，Stenotrophomonas，Enhydrobacte， Erwinia （冯云利，奚家勤，马莉，莫明和，方敦煌，夏振远，雷丽萍，杨发祥，周峰. 烤烟品种NC297内生细菌中拮抗烟草黑胫病的生防菌筛选及种群组成分析. 云南大学学报，33(4),488-496）。生防菌对烟草疫霉的拮抗机制主要通过产生抗生素、抗菌肽、诱导抗性、营养竞争、空间竞争等方式。 

如上所述，分别针对根结线虫和烟草疫霉的生物防治均有深入研究；然而，针对这两种病原复合病害的生物防治报道很少。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足提供一种同时抗烟草黑胫病菌和根结线虫病及其应用方法。 

芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensZY-9-13菌株系本专利申请人从烤烟新鲜叶片中分离、鉴定的一种烟草内生细菌。该微生物通过抑制烟草黑胫病菌菌丝生长及孢子萌发，在烟草根际有很好的定殖能力，微生物对烟草根结线虫的生防特性和效果未公开报道。本发明从烟草内生菌中筛选具有工业化生产前景的菌株，为烟草农业生产中根结线虫-烟草疫霉复合侵染的防治提供一种具有较好防治效果的生防微生物。 

本发明所用的兼抗根结线虫和烟草疫霉的烟草内生菌为芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensZY-9-13菌株，该菌株2012年05月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 

保藏号：CGMCC No.6162。分类命名：解淀粉芽孢杆菌，拉丁文名称：Bacillus amyloliquefaciens。

    所述的ZY-9-13菌株的16S rRNA基因的序列共1435 bp（见后附序列表），序列号为 HQ662602。结合形态特征，生理生化特征及系统发育分析，将ZY-9-13菌株鉴定为Bacillus amyloliquefaciens。菌株的16S rRNA基因序列（此序列在GeneBank数据库中的序列号为HQ662602）是鉴别该菌株的主要特征依据。    ZY-9-13菌株的最适宜的培养条件为：KMB培养基（葡萄糖30.0 g，蛋白胨20.0 g， MgSO₄·7H₂O 1.5 g， KH₂PO₄ 1.5g，蒸馏水1000 ml），pH 7.0，接种量3%，培养温度36℃，培养时间42 h。在此条件下摇瓶培养时其生物量可达1.48×10⁹ cfu/ml。 

利用本发明的ZY-9-13菌株可用于制备可兼抗根结线虫和烟草疫霉的菌剂，该菌剂为可湿性粉剂，制备ZY-9-13可湿性粉剂时，适宜的载体、分散剂、润湿剂、紫外保护剂和粘附剂分别为硅藻土、木钠、十二烷基硫酸钠、海藻酸钠、蔗糖。 

ZY-9-13可湿性粉剂的具体配方如下：ZY-9-13原粉：ZY-9-13原粉：9~11%，木钠：5~7%，十二烷基硫酸钠：0.3~0.6%，海藻酸钠：0.7~1.4%，蔗糖：0.8~1.2%，硅藻土：80~84%。 

此菌剂的活菌数6.41×10⁹ cfu/g、含水量6.3%、悬浮率71.1%、细度99.6%过400目筛、湿润时间18 s，符合微生物农药国家标准（GB 20287-2006）。 ZY-9-13原粉在4℃、室温、30℃下存放6个月，活菌数由6.62×10¹⁰ cfu/g降至5.42×10¹⁰ cfu/g、5.21×10¹⁰ cfu/g 、4.96×10¹⁰ cfu/g；ZY-9-13可湿性粉剂在4℃、室温、30℃下存放6个月，活菌数由6.41×10⁹ cfu/g降至5.1×10⁹ cfu/g、4.71×10⁹ cfu/g、4.26×10⁹ cfu/g。4℃为原粉及其可湿性粉剂的最佳存储温度。 

本发明的突出优点在于：利用ZY-9-13菌株制备的可湿性粉剂对防治烟草根结线虫及黑胫病菌病有很好的防治效果。能用于漂浮育苗基质处理，移栽期和成熟期。施用时可将ZY-9-13菌剂与烟草育苗基质混合使用，也可在移栽时施入烟草根际周围，或在成熟期兑水灌根。对病害发生严重田块，移栽期和成熟期分别施用一次效果最好。 

利用ZY-9-13菌株制备的生防菌剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是烟草农业种植中防治烟草根结线虫-黑胫病复合侵染的高效生物农药。 

具体实施方式：

1. 本发明中ZY-9-13菌株的培养及菌剂制备

ZY-9-13菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，15-40℃下培养1-5天后获得斜面种子，适宜的培养条件是37℃下培养2天。

ZY-9-13菌株液体种子的培养：从划线培养的平板上取一环ZY-9-13菌体接到YSP培养液中，36℃，150 rpm培养24 h后作为种子。 

 ZY-9-13菌株可湿性粉剂的制备：在50 L发酵罐中培养红霉素抗性标记的ZY-9-13菌株（ZY-9-13红霉素抗性标记菌株由本实验室提供），发酵条件为30℃、转速200 rpm、通气率为0.8、时间为42 h。发酵结束后用超滤系统将发酵液浓缩至原有体积的1/5。然后将浓缩液于保鲜薄膜上摊开并在室内凉干，将ZY-9-13菌剂原粉与木钠、十二烷基硫酸钠、海藻酸钠、蔗糖和硅藻土按照20︰11︰1︰2︰2︰164混匀，最后得到ZY-9-13菌株可湿性粉剂。 

再用搅碎机粉碎成原粉。用常规的稀释平板涂布法计算单位重量原粉中的活性数（cfu/g）。将5 g原粉于120℃下烘烤1 min后取称重，计算原粉含水量。 

含水量(%)=（初始重量-烘干重量）÷初始重量×100%。 

 2. ZY-9-13菌株可湿性粉剂防治烟草根结线虫及黑胫病菌复合侵染的温室试验

供试菌剂：活菌数为1×10⁹个/g的ZY-9-13可湿性粉剂。

烟草品种：K326。 

供试病原材料：烟草根结线虫、烟草黑胫病菌。 

试验方法： 

烤烟常规漂浮育苗时，50 g ZY-9-13可湿性菌剂用300 ml水稀释后与1 kg育基质混匀；阳性对照处理为58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂，58%甲霜灵锰锌1 g用300 ml水稀释后与1 kg育基质混匀；空白对照为300 ml水与1 kg育基质混匀。待烟苗长至5-6片叶子时，在直径为15 cm的、装有500 g土壤（沙土:腐殖土=1:1）的每一花钵移栽一株烟苗，在烟根接种烟草根结线虫和烟草黑胫病病原菌各5 ml，每处理三个重复，每重复5盆。肥水管理按常规方法进行，在室温温室内生长90天后统计各处理的烟草黑胫病发病率及根结线虫的发病率和根结指数，按以下公式计算发病率和防效：

发病率=发病株数/调查株数×100%

防效（%）=空白对照的发病率-药剂处理的发病率

根结指数=[∑（各级植株数×级值）]÷（调查总株数×4）×100 （方仲达. 2007. 植病研究方法，第三版.中国农业出版社，pp.324-325）

试验结果：空白对照的发病率为87.5%；甲霜灵锰锌可湿性菌剂处理的发病率为10.8%，防效为76.7%；ZY-9-13可湿性菌剂处理的发病率为11.3%，防效为76.2%，与化学农药58%甲霜灵锰锌可湿性菌剂的防治效果相当。空白对照根结线虫的发病率为100%,根结指数为91.67。ZY-9-13可湿性粉剂处理的发病率为47.5%，根结指数为41.35，与对照比较，发病率下降52.5%，根结指数下降50.12，显示出ZY-71-1对烟草根结线虫病良好的防治效果。

  

序列表

 

<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120>一种兼抗根结线虫和烟草疫霉的烟草内生菌及其应用

 

<210>1

<211>1435

<212>DNA

<213>人工序列<222>（1）..(1435)

<400>1

GCCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGGG                                   1435