一种基于点击化学仿生分子印迹电化学传感器的制备及对食品过敏原的检测

摘要

本发明公开了一种基于点击化学仿生分子印迹电化学传感器的制备及对食品过敏原的检测方法。选择与电极表面固定的叠氮烷基硫醇，制备叠氮端基的自组装单层膜；通过点击化学反应，对叠氮端基的自组装单层膜进行端基烯基功能化；选择能与过敏原反应合成过敏原人工抗体的MIPs的功能单体；利用现有方法制备出石墨烯材料，掺入到人工抗体的制备；按一定物质的量比将食品过敏原的模板分子、功能单体、石墨烯、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂混合均匀制备掺有石墨烯的仿生分子印迹聚合物(MIPs)；将制得的分子印迹聚合物修饰工作电极连接到电化学工作站，对食品提取液中的食品过敏原进行检测。

说明书

技术领域

本发明涉及食品过敏原检测技术领域，更具体地说是一种能够检测食品过敏原的电化学传感器制备，本发明还涉及采用所述的仿生分子印迹技术测定样品中痕量食品过敏原的方法。

背景技术

食品过敏原现已成为一个新兴的公众性食品安全问题，特别是在发达国家，调查显示全世界范围内有超过1%的成年人对食品过敏，而婴幼儿和儿童发生率达到了5%-10%。一般来说，食品过敏原为分别属于不同家族的蛋白或糖蛋白，微量的食品过敏原蛋白即可引起严重的过敏反应。近年来，国际食品法典委员会、各发达国家纷纷出台了各种食品过敏原标识的法规、标准和相应的实施措施，其中以美国和欧盟的尤为严格，已经进入了强制性实施阶段，这对我国农产品、食品进出口贸易带来了不容忽视的影响。我国也于2008年奥运会期间正式开展了食品过敏原检测和相关标准制定工作。目前系统全面精确可靠的食品中过敏原检测和分析技术体系形成迫在眉睫。

过敏原反应是由过敏原入侵人体内而致，引起过敏反应的反应原一般为具有酸性等电点的蛋白或糖蛋白。过敏原在食品的加工处理中表现出极大的稳定性，通过一般加工手段如加热、超高压、烘烤、干燥后其酶活性仍然存在，尚具备一定程度的致敏性，这是食品安全上的一个难题。世界粮油组织1995年报告，90%以上的食物过敏反应是由牛奶、鸡蛋、鱼、贝壳海产品、花生、大豆、果仁和小麦8类食物引起，10%的过敏原是由170多种其他食物引起。

检测过敏原的方法主要有l）体内检查，如皮肤试验(划痕试验，点刺试验，皮内注射试验)和激发试验(气道粘膜、结膜激发反应)；2)体外检查，如嗜碱性粒细胞脱颗粒试验、放射免疫吸附试验(RIST)、放射变应原吸附试验(RAST)和酶联免疫吸附试验（ELISA)。其中应用最为广泛的方法是皮肤试验，它为过敏症诊断可提供快速但却是非定量的结果，而无论对医生还是病人来讲，体外诊断无疑是方便和可靠的，但由于ELISA检测试剂盒和试条，存在复杂的抗体制备过程，价格较为昂贵；PCR技术虽具有开发前景，但是食品处理过程中DNA的变性作用和该方法的最大检测限度限制了其在当前的应用和发展。迫切需要开发各种特异性强、灵敏度高、速度快、成本低、检测面广的分析检测方法和技术来适应形势的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于点击化学仿生分子印迹食品过敏原快速检测传感器的制备及应用，本发明以仿生分子印迹膜为基础，建立了食品过敏原的电化学仿生免疫传感快速检测方法，成功建立了快速、特异、灵敏的检测食品过敏原的传感器。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种基于点击化学仿生分子印迹电化学传感器的制备及对食品过敏原的检测，其特征是包括以下步骤：

（1）    选择与电极表面固定的叠氮烷基硫醇，制备叠氮端基的自组装单层膜；

（2）    通过与丙烯酸丙炔酯点击化学反应，对叠氮端基的自组装单层膜进行端基烯基功能化；

（3）    选择能与过敏原反应合成过敏原仿生分子印迹聚合物（MIPs）的功能单体；

（4）    利用现有方法制备出石墨烯材料，掺入到仿生分子印迹聚合物；

（5）    按一定物质的量比将食品过敏原的模板分子、功能单体、石墨烯、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂混合均匀，制备分子印迹聚合物溶液；

（6）    将分子印迹聚合物溶液滴于经过（2）处理过的电极表面，紫外光引发制备掺有石墨烯的仿生分子印迹聚合物；

本发明所述食品过敏原仿生分子印迹聚合物的模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂的物质的量比为0.1～1∶1∶0.5～5∶20～55∶0.05～0.2∶1.5～30,每毫升中掺入10mg石墨烯。

 本发明所述掺有石墨烯材料的仿生分子印迹聚合物制备的传感器检测痕量食品过敏原的方法，将按上述任意一种方法制得的分子印迹聚合物通过点击化学修饰于工作电极制备电化学传感器，对食品提取液中的食品过敏原进行检测，其特征是包括如下步骤：

（1）    含过敏原食品经正己烷4℃浸提过夜，冷冻离心，收集上清液，用30%-50%饱和度硫酸铵沉淀的蛋白质组分溶解在PBS中，分别加硫酸至pH 5.2或pH4.5等电点，离心后沉淀物溶解在PBS中，得到食品过敏原；

（2）    将所用金电极（Ф=4mm）用0.05μm的铝粉进行抛光，用piranha溶液（H₂SO₄/H₂O₂=3:1）浸泡5min，二次蒸馏水洗涤，氮气气氛干燥，将清洗过的电极在0.5mol/L的H₂SO₄溶液中于-0.8~1.5V范围内进行循环伏安扫描至稳定，再用二次蒸馏水清洗干净，氮气气氛下干燥4℃保存使用；

（3）    将（2）处理过的金电极，在1mmol/L硫代癸烷和2mmol/L叠氮十一烷基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸馏水洗涤干净，氮气吹干；

（4）    将步骤（3）处理过的电极浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有抗坏血酸和硫酸铜，避光放置20h，先用甲醇洗涤，然后二次蒸馏水洗涤，晾干；

（5）    将步骤（4）处理过的工作电极晾干后滴加MIPs溶液20μL，紫外光（365nm）下诱导聚合反应1h，然后将工作电极用洗脱剂洗脱10-15分钟，在室温下干燥5-10分钟，成功制备过敏原仿生分子印迹膜电化学传感器，保存在4℃的冰箱中备用；

（6）    将制得的过敏原分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对样品提取液中的过敏原进行检测。

 所述的叠氮烷基硫醇为叠氮十一烷基硫醇，丙烯酸丙炔酯对叠氮端基的自组装单层膜进行端基烯基功能化。

所述的仿生分子印迹电化学传感器的工作电极为金电极（Ф=4mm）；

所述的模板食品过敏原可以是水溶性并与功能单体、交联单体相容；

所述的功能单体为丙烯酰胺（AM）、甲基丙烯酰胺（MAM）、丙烯酸（AA）、甲基丙烯酸（MAA）或4-乙烯基吡啶（4-VP）；

所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）、N、N-亚甲基二丙烯酰胺、3，5-二（丙烯酰胺）苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）；

所述的引发剂是可以引起聚合反应但不使模板蛋白发生变性的所有引发剂包括热引发剂和光引发剂，包括偶氮二异丁腈、过硫酸钾、过硫酸铵、二乙基二硫代氨基甲酸钠等；

所述致孔剂采用二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇；

所述有机溶剂为二氯甲烷或四氯化碳；

所述洗脱液为可以将模板蛋白从印迹膜上洗脱的缓冲溶液、盐溶液、碱溶液和变性剂等，包括各种浓度的磷酸盐缓冲溶液或NaCl盐溶液和NaOH碱溶液或变性剂十二烷基硫酸钠等。

 

具体实施方式

实施例1：花生过敏原的检测

（1）称取花生30g，使用组织破碎机破碎得粉末，按重量体积比g/mL为1:10 浸入正己烷中脱脂，4℃浸提过夜，冷冻离心，收集上层蛋白浸液，10mL蛋白浸液缓慢加至质量浓度30%的饱和硫酸铵，4℃下静置过夜，离心沉淀，对上层清液再缓慢加至质量浓度50%饱和硫酸铵，静置30min，离心，将30%-50%饱和度沉淀的蛋白质组分溶解在PBS中，加硫酸至pH5.2等电点，离心后沉淀物溶解在PBS中，装入透析袋对蒸馏水透析4h，期间换透析液一次，然后转至PBS中继续透析，即得花生过敏原待测液，取待测液1mL加入传感反应池中进行检测；

（2）选择能与花生过敏原合成仿生分子印迹聚合物的功能单体丙烯酰胺（AM）；

（3）石墨烯材料溶液的制备：在超声搅拌的条件下，取2mg石墨烯加入到水中，从而获得黑色溶液；

（4）模板分子花生过敏原，功能单体丙烯酰胺（AM），交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA），致孔剂氯仿，引发剂过硫酸钾，有机溶剂二氯甲烷按物质的量比为0.5∶1∶1∶40∶0.1∶2.0，掺入石墨烯，混合均匀，得到花生过敏原MIPs溶液；

（5）工作电极选用金电极为工作电极，将所用金电极（Ф=4mm）用0.05μm的铝粉进行抛光，用piranha溶液（H₂SO₄/H₂O₂=3:1）浸泡5min，二次蒸馏水洗涤，氮气气氛干燥，将清洗过的电极在0.5mol/L的H₂SO₄溶液中于-0.8~1.5V范围内进行循环伏安扫描至稳定，再用二次蒸馏水清洗干净，保证电极表面无杂质；

（6）将（5）处理好的金电极，在1mmol/L硫代癸烷和2mmol/L叠氮十一烷基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸馏水洗涤干净，氮气吹干；

（7）将步骤（6）制备好的电极浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有0.1mol/L抗坏血酸和0.05mol/L硫酸铜，避光放置20h，先用甲醇洗涤2次，然后二次蒸馏水洗涤3次，晾干；

（8）将步骤（7）处理过的工作电极晾干后滴加MIPs溶液20μL，紫外光（365nm）下诱导聚合反应1h，将电极在1%SDS-10%HAc混合液洗脱中浸泡10 min，直至把这一层中的模版分子花生过敏原完全洗掉，在室温下干燥10 min，成功制备花生过敏原仿生分子印迹电化学传感器，保存在4℃的冰箱中备用； 

（9）将制得的花生过敏原分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对花生样品提取液中的花生过敏原进行检测,花生过敏原蛋白的最低检测限为10ng/mL。

 

实施例2：鸡蛋过敏原检测

（1）将鸡蛋中蛋清与蛋黄分开，称取蛋清30g，按重量体积比g/mL为1:10 浸入正己烷中脱脂，将蛋清搅拌均匀，4℃浸提过夜，冷冻离心，收集上层蛋白浸液，10mL蛋白浸液缓慢加至质量浓度30%的饱和硫酸铵，4℃下静置过夜，离心沉淀，对上层清液再缓慢加至质量浓度50%饱和硫酸铵，静置30min，离心，将30%-50%饱和度沉淀的蛋白质组分溶解在PBS中，加硫酸至pH5.2等电点，离心后沉淀物溶解在PBS中，装入透析袋对蒸馏水透析4h，期间换透析液一次，然后转至PBS中继续透析，即得鸡蛋过敏原待测液，取待测液1mL加入传感反应池中进行检测；

（2）选择能与鸡蛋过敏原合成仿生分子印迹聚合物的功能单体甲基丙烯酰胺（MAM）；

（3）石墨烯材料溶液的制备：在超声搅拌的条件下，取2mg石墨烯加入到水中，从而获得黑色溶液；

（4）模板分子鸡蛋过敏原，功能单体甲基丙烯酰胺（MAM），交联剂3，5-二（丙烯酰胺）苯甲酸，致孔剂四氯化碳，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂四氯化碳按物质的量比为0.2∶1∶0.5∶50∶0.15∶5.0，掺入适量石墨烯，混合均匀，得到鸡蛋过敏原MIPs溶液；

（5）工作电极选用金电极为工作电极，将所用金电极（Ф=4mm）用0.05μm的铝粉进行抛光，用piranha溶液（H₂SO₄/H₂O₂=3:1）浸泡5min，二次蒸馏水洗涤，氮气氛干燥，将清洗过的电极在0.5mol/L的H₂SO₄溶液中于-0.8~1.5V范围内进行循环伏安扫描至稳定，再用二次蒸馏水清洗干净，保证电极表面无杂质；

（6）将处理好的金电极，在1mmol/L硫代癸烷和2mmol/L叠氮十一烷基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸馏水洗涤干净，氮气吹干；

（7）将步骤（6）制备好的电极浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有0.1mol/L抗坏血酸和0.05mol/L硫酸铜，避光放置20h，先用甲醇洗涤2次，然后二次蒸馏水洗涤3次，晾干；

（8）将步骤（7）中晾干的工作电极上滴加步骤（4）制备的MIPs溶液20μL，紫外光（365nm）下诱导聚合反应1h，将电极在1%SDS-10%HAc混合液洗脱中浸泡10min，直至把这一层中的模版分子鸡蛋过敏原完全洗掉，在室温下干燥10 min，成功制备鸡蛋过敏原仿生分子印迹电化学传感器，保存在4℃的冰箱中备用；

（9）将制得鸡蛋过敏原分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对鸡蛋样品提取液中的鸡蛋过敏原进行检测, 鸡蛋过敏原蛋白的最低检测限为2.0ng/mL。