一种线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段

摘要

本发明提供了一种线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段，本发明的线性化表达载体构建方法包括下列步骤：设计并构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段；将前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段采用连接酶连接获得线性双链DNA表达载体。本发明还进一步提供了用于线性化表达载体构建的类载体片段。本发明通过高效准确的连接反应制备类似线性化载体片段，避开了通过繁琐耗时的环状质粒载体的构建而获得线性化载体片段的过程，同时目的基因末端的产生不受其序列的限制可以极大简化操作、降低成本并缩短实验周期，在酵母等表达系统中具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因重组表达技术，具体涉及一种通过高效准确的连接反应直接构建线 性化载体片段实现线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段。

背景技术

基因重组表达技术在当今的生物科学研究及产业化中有着越来越广泛的应用。目前，基 因重组表达的宿主生物有很多种，比如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母和哺乳动物细胞等。 很多情况下，在利用这些宿主生物表达目的基因时需要先在大肠杆菌中构建一个正确插入 目的基因的环状质粒载体，将该载体提纯、线性化后再转化宿主生物，目的基因通过同源 重组整合到宿主生物的基因组中，根据筛选基因可获得稳定表达的克隆子。比如常用毕式 酵母(Pichia pastoris)的pPIC9K载体(Invitrogen)和中国仓鼠卵巢细胞CHO的 pOptiVEC^TM-TOPO载体(Invitrogen)都属此类。图2以毕式酵母(Pichia pastoris)的菌 株GS115和载体pPIC9K表达绿色荧光蛋白GFP为例说明该重组表达过程的基本步骤。从图 中可知该重组表达过程基本上由17步操作完成，其中有15步操作是在构建一个线性化载 体片段，期间需要多次细菌培养、质粒抽提、酶切、纯化等操作，成本较高且繁琐，一般 需要一周以上的时间。如果能够将可规模制备的、通用的类似载体的并含有基因表达所需 元件的DNA片段与目的基因片段通过连接反应直接制备图2中第15步所需的线性化载体片 段或者有相同功能的DNA片段，则可以避开质粒载体构建过程，相关工作一天内可以完成 而且非常简单，这必将大大加快重组表达的速度，技术路线见图3。

上述直接构建线性化载体的过程对连接反应效率要求很高。当前基因的克隆表达中广泛 应用的连接反应的类型有以下三种：一、在极大多数的环状的克隆表达质粒载体中均含有 多克隆位点，目的基因和载体经多克隆位点中的限制性内切酶酶切后产生末端，末端间可 以通过连接酶催化连接反应；二、在T载体和TOPO系列载体(Invitrogen)中，载体和目 的基因通过末端的碱基T和A产生连接反应，其中在T载体中反应由连接酶催化，而在TOPO 系列载体中反应由拓扑异构酶I(Topoisomerase I)介导连接反应；三、其它非连接酶催 化的连接反应，如GatewayTM系统(Gibco/Life Technologies)和EchoTM系统(Invitrogen) 采用Cre酶介导的LoxP位点同源重组构建载体。实践中发现上述三大类连接反应连接效率 均非常低而且极易产生错误连接，需要在大肠杆菌中筛选正确连入目的基因的阳性克隆子， 显然不适合直接用于构建线性化载体。

中国专利申请案(中国专利申请号02116936.5、02117763.5和02123460.4)报道了三 种无需克隆的线性化载体构建方法并且注重参与连接反应的末端的产生。每个发明中分别 给出一种末端产生的方法，分别是以非对称性切割的限制性内切酶酶切产生末端、DNA和 RNA杂交体的RNA突出末端作为末端、切口酶及核酸外切酶作用产生末端。带有相应末端的 相当于载体的片段和目的基因由T4DNA连接酶催化产生连接反应从而构建无需克隆的线性 化载体。实际应用中这些方法受到一定的限制，未能进一步得到推广应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种通过高效准确的连接反应直接构建线 性化载体片段实现快速转基因的方法。

本发明主要是通过如图1所示的三段DNA片段的高效准确的连接反应直接构建转化表达 目的基因的宿主生物所需的线性化载体片段或者有相同功能的片段，避开了通过构建环状 质粒载体得到线性化载体片段的繁琐方法，从而实现快速转基因的操作。

为方便表述，在本发明中对图1中三段依次连接的DNA片段称为前类载体片段、目的基 因片段和后类载体片段。目的基因片段中，编码链5’端对应的DNA序列的一端称为目的基 因片段的前端，编码链3’端对应的DNA序列的一端称为目的基因片段的后端。目的基因 片段的前端与前类载体片段后端连接，目的基因片段的后端与后类载体片段前端连接。

本发明一方面提供了一种线性化表达载体构建方法，包括下列步骤：

1)设计前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段，

所述前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段满足下列要求；

所述目的基因片段含有目的基因且两个末端均为5’冗余粘性末端；

所述目的基因片段的5’冗余粘性末端同时满足下列要求：

a)单个5’冗余粘性末端的冗余碱基个数为1-10个，较佳的为2-6个，最佳的为2-4 个；

b)两个5’冗余粘性末端的冗余碱基选自A、T、C和G中的至多三种，且任一冗余 碱基均与目的基因片段中任一单链DNA的3’端首个碱基的互补碱基不同，冗余末端由 T4 DNA聚合酶降解产生；

进一步优选的，所述目的基因片段的5’冗余粘性末端还满足下列要求中至少一项：

c)两个5’冗余粘性末端中至多只有一个5’冗余粘性末端含有回文对称序列；较佳 的是两个5’冗余粘性末端均没有回文对称序列。

d)两个5’冗余粘性末端之间碱基的匹配率要低。较佳的，两个5’冗余粘性末端之 间最多的连续配对的碱基个数不大于任一个5’冗余粘性末端的冗余碱基个数的一半， 且当出现多个间隔的连续配对时，匹配的碱基总个数小于不匹配的碱基总个数。连续配 对是指一个冗余末端中2个或者2个以上紧邻的碱基同时与另一冗余末端中相应的碱基 配对。

所述前类载体片段的一个末端为5’冗余粘性末端，且与所述目的基因片段中，编 码链5’端对应的5’冗余粘性末端(目的基因片段的前端)相互补，该末端即为前类 载体片段的后端，另一个末端为平端或者经去磷酸化酶处理的末端，该末端即为前类载 体片段的前端；

所述后类载体片段的一个末端为5’冗余粘性末端，且与所述目的基因片段中，编 码链3’端对应的5’冗余粘性末端(目的基因片段的后端)相互补，该末端即为后类 载体片段的前端，另一个末端为平端或者经去磷酸化酶处理的末端，该末端即为后类载 体片段的后端；

2)按照步骤1)的设计构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段；

3)将步骤2)构建的前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段直接采用连接酶连 接获得前类载体片段、目的基因片段及后类载体片段依次相连的线性双链DNA表达 载体。

步骤1)中，所述5’冗余粘性末端是指带5’突出的粘性末端；所述冗余碱基是指5’ 冗余粘性末端中5’突出部分的单链碱基。

所述目的基因两个5’冗余粘性末端的冗余碱基选自A、T、C和G中的至多三种，且任 一冗余碱基均与目的基因片段中任一单链DNA 3’端首个碱基的互补碱基不同。举例来说， 如下列片段即符合上述规定：

上述片段中，下划线部分为冗余碱基，带方框的碱基即为单链DNA 3’端首个碱基的互 补碱基。在片段(1)中，冗余碱基种类为A、T和G，两条单链DNA 3’端首个碱基的互补 碱基均为C，任一冗余碱基均与两条单链DNA 3’端首个碱基的互补碱基不同；在片段(2) 中，冗余碱基种类为T和G，两条单链DNA 3’端首个碱基的互补碱基分别为C和A，任一 冗余碱基均与两条单链DNA 3’端首个碱基的互补碱基不同。

设计出符合步骤1)要求的前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段后，可将前类 载体片段和后类载体片段构建于质粒载体以制备含有所需末端的类载体片段，可将目的基 因的PCR扩增产物用T4 DNA聚合酶酶处理以制备含有所需末端的目的基因片段。

所述步骤3)中，连接酶可选自T4 DNA连接酶或大肠杆菌连接酶。

本发明中，三段DNA依次经连接酶连接产生“前类载体-目的基因-后类载体”的线性化 载体片段(即前类载体片段、目的基因片段及后类载体片段依次相连的线性双链DNA表达 载体)的连接反应中，只有前类载体片段的后端与目的基因片段的前端的连接反应，以及 后类载体片段的前端与目的基因片段的后端的连接反应是预期的，而其他末端之间的连接 反应均是非预期的。

为确保前类载体片段的前端或后类载体片段的后端尽可能地不参与任何连接反应，最优 化的方式是前类载体片段的前端或后类载体片段的后端均为平末端，选用大肠杆菌连接酶。 平末端的产生可采用酶切后为平末端的限制性内切酶，也可对酶切后的粘性末端经单链核 酸外切酶削平处理获得平末端或者经DNA聚合酶补平处理获得平末端。

较佳的，目的基因片段的构建包括下列步骤：

A.设计引物扩增目的基因得到目的基因的PCR扩增产物；

B.将目的基因的PCR扩增产物纯化后，利用T4DNA聚合酶产生5’冗余粘性末端。

步骤A中所述引物包括一上游引物与下游向引物，所述上游引物与下游引物的5’端均 加入1-10个碱基的多核苷酸接头序列以与所设计的5’冗余粘性末端的冗余碱基段相对应。

上述步骤B中，利用T4DNA聚合酶产生5’冗余粘性末端的方法为：将纯化的目的基 因的PCR扩增产物在有碱基底物存在的反应体系中，用T4 DNA聚合酶处理，最终获得带有 5’冗余粘性末端的目的基因片段，所述碱基底物选自dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并且必 须含有待构建目的基因的两条单链DNA 3’端的首个碱基相对应的碱基底物，而不得含有待 构建的目的基因片段中任一冗余碱基的互补碱基相对应的碱基底物。

所述碱基底物并且必须含有待构建目的基因的两条单链DNA 3’端的首个碱基相对应的 碱基底物，而不得含有待构建的目的基因片段中任一冗余碱基的互补碱基相对应的碱基底 物。举例来说，如果拟构建的目的基因片段如下：

对于片段(1)，该片段冗余碱基种类为A、T和G，他们的互补碱基就为T、A和C，分 别对应的碱基底物就是dTTP、dATP和dCTP，两条单链DNA 3’端首个碱基均为G，对应的 碱基底物就是dGTP，那么步骤B所用的碱基底物必须含有dGTP，而不得含有dTTP、dATP和 dCTP。

对于片段(2)，该片段冗余碱基种类为T和G，他们的互补碱基就为A和C，分别对应 的碱基底物就是dATP和dCTP，两条单链DNA 3’端首个碱基均为G和T，对应的碱基底物 就是dGTP和dTTP，那么步骤B所用的碱基底物必须含有dGTP和dTTP，而不得含有dATP和 dCTP。

采用上述方法构建目的基因片段的原理是利用了T4 DNA聚合酶3’→5’端的降解活性 来获得5’冗余粘性末端。这种末端构建方法不仅克服了各种质粒载体中多克隆位点的限制 性内切酶的选用受目的基因序列的限制和限制性内切酶位点时常在表达产物的氨基端留下 若干个氨基酸的缺点，而且使前类载体片段和后类载体片段有很强的通用性，即相同的前 类载体片段和后类载体片段可用于不同序列的目的基因的表达，易于较高通量和商业化。

前类载体片段后端和后类载体片段前端是分别与目的基因片段的两个5’冗余粘性末端 互补的粘性末端，亦为5’冗余末端，碱基种类、数目和序列均由目的基因的冗余末端决定。 考虑到前类载体片段后端和后类载体片段前端的冗余末端须易产生且有5’磷酸化的要求， 且前类载体片段及后类载体片段(之后均简称为类载体片段)必须易制备，在设计好类载 体片段后，分别在其4个末端加上多核苷酸接头，制备带有多核苷酸接头的类载体片段后， 将其克隆在环状质粒载体(如pUC18、pBR322等常用载体)中或者改造现有的一些质粒载 体(如pPIC9K、pPIC3.5K等常用载体)，其能在大肠杆菌中复制，提取质粒，通过限制性 内切酶、核酸酶和聚合酶等一系列工具酶处理载体中的多核苷酸接头即可获得符合步骤1) 所述的末端，具体且较佳的，所述用工具酶处理类载体片段末端的多核苷酸接头选用以下 方法之一产生：

方法一：利用限制性内切酶酶切类载体片段末端的多核苷酸接头，直接获得末端恰好符 合步骤1)末端设计要求的前类载体片段和后类载体片段。如用限制性内切酶Acc I酶切多 核苷酸接头(5’GTCTAC 3’)、限制性内切酶Not I酶切多核苷酸接头(5’GCGGCCGC 3’) 和限制性内切酶Cpo I酶切多核苷酸接头(5’CGGACCG 3’)产生的5’冗余末端可作为前 类载体的后端和后类载体的前端；用限制性内切酶SnaB I和EcoR V分别酶切多核苷酸接 头(5’TACGTA 3’和5’GATATC 3’)产生的平末端可作为前类载体的前端和后类载体的 后端。

方法二：利用限制性内切酶酶切类载体片段末端的多核苷酸接头后未能获得末端恰好符 合步骤1)末端设计要求的前类载体片段和后类载体片段时，还需再用各种核酸酶、DNA聚 合酶包括T4DNA聚合酶处理限制性内切酶产生的末端才能产生符合步骤1)末端设计要求 的冗余末端，该方法可产生冗余碱基个数为0-10个不等的5’冗余末端。如限制性内切 酶Kpn I酶切多核苷酸接头(5’CXGGTACC 3’，其中CX比Kpn I更靠近类载体末端的内 侧，X可以是0-9个甚至更多个碱基，可以是碱基A、T、G中的任何碱基)后，再用T4 DNA聚合酶在碱基底物dCTP存在条件下依次降解碱基5’XGGTAC 3’即可产生步骤1)所 要求的前类载体的后端和后类载体的前端，根据X碱基的不同可以产生5’冗余末端举例如 下：3’AC 5’；3’ACC 5’；3’ATCC 5’；3’ACTATC 5’；3’CACTCAAC 5’； 3’CACTCAACAC 5’。如限制性内切酶Pst I酶切多核苷酸接头(5’CTGCAG 3’)后，再 用T4DNA聚合酶在碱基底物dCTP存在条件下依次降解碱基5’TGCA 3’即可产生平末端， 可作为前类载体的前端和后类载体的后端。

为确保目的基因能在宿主生物中稳定表达，本发明所构建的“前类载体-目的基因-后类 载体”的线性表达载体(即前类载体片段、目的基因片段及后类载体片段依次相连的线性 双链DNA表达载体)中含有必要的元件，包括同源重组序列、筛选基因、启动子和终止子， 也可选择性地包含增强子、信号肽和与目的基因产物融合的蛋白。

同源重组序列是一段与宿主生物基因组同源的序列，可使“前类载体-目的基因-后类载 体”的片段整合到宿主的染色体中，从而使目的基因稳定的传代。筛选基因是用于阳性克 隆子的筛选，有回补营养缺陷型的基因和抗生素抗性基因两种。如果选择宿主生物的表达 菌株是一个氨基酸或核苷酸等合成基因缺失的营养缺陷型菌株，筛选基因可以是该合成基 因，营养缺陷型菌株在未添加该基因产物产生的化合物的培养基中不能生长，而转化目的 基因的阳性克隆子由于携带该基因，可以自身产生相应的化合物，可在未添加该基因产物 产生的化合物的培养基中生长，达到筛选的目的。对抗生素抗性基因在酵母和哺乳动物细 胞转化中使用十分广泛，比如博来霉素(Zeocin)等，使用上不像上述营养缺陷型一类受 限于有无相应的菌株，仅转化目的基因的阳性克隆子能在添加该种抗生素的培养基中生长， 从而达到筛选的目的。增强子一般在哺乳动物细胞表达载体中使用，主要是增强目的基因 的表达。对于一个基因的表达，选择一种宿主生物后，其可选择的启动子、终止子、增强 子、信号肽、同源重组序列和筛选基因一般可以从该种宿主的商业化表达载体或者常用的 表达载体中找到，使用上与已有的商业化载体或者常用的表达载体中相应元件的功能相同。

在“前类载体-目的基因-后类载体”的片段中，目的基因紧邻启动子和终止子并与之形 成正确的阅读框的表达盒，能够正确转录翻译，同源重组序列位于片段的两侧利于重组， 若需信号肽协助表达或需融合蛋白，则其位于启动子和目的基因之间，且连入同样要保证 正确阅读框的形成，其它元件如增强子和筛选基因一般位于两类载体片段(前类载体片段 和后类载体片段)的中部。

本发明的关键在于通过对于前类载体片段、目的基因片段及后类载体片段的末端设计从 而使得高效准确的连接得以实现。采用本发明的方法可不必构建环状质粒载体而直接构建 线性化载体。本发明中目的基因5’冗余末端的产生方法克服了各种质粒载体中多克隆位点 的限制性内切酶的选用受目的基因序列的限制和所选用的限制性内切酶位点常在表达产物 的氨基端留下若干个氨基酸的缺点，从而使类载体片段有很强的通用性，即相同的类载体 片段可用于不同序列的目的基因的表达。本发明中通过直接构建“前类载体-目的基因-后 类载体”的线性表达载体获得克隆子的方法极大简化工作、加快速度，同时易于较高通量 实施，比如在酵母双杂交实验中有非常好的应用前景。

根据上述方法的设计原理，本发明还提供了一种用于构建线性化表达载体的类载体片 段，包括前类载体片段和后类载体片段，所述前类载体片段和后类载体片段满足下列要求：

前类载体片段的后端为5’冗余粘性末端，前端为平端；后类载体片段的前端为5’冗 余粘性末端，后端为平端；所述前类载体片段和后类载体片段的5’冗余粘性末端同时满足 下列要求：

A.前类载体片段的后端的5’冗余粘性末端的冗余碱基个数为2个，后类载体片段的 前端的5’冗余粘性末端的冗余碱基个数为3个；

B.所述两个5’冗余粘性末端无回文对称序列；

C.所述两个5’冗余粘性末端自身及之间连续配对的碱基个数小于2个。

进一步的，所述前类载体片段和后类载体片段含有常规表达载体的必要的元件，包括同 源重组序列、筛选基因、启动子和终止子。

进一步的，前类载体片段和后类载体片段上均设有同源重组序列，所述同源重组序列位 于前类载体片段的前端或前端附近和后类载体片段的后端或后端附近，为AOX1基因。

进一步的，所述启动子位于前类载体片段的后端或后端附近，为AOX1启动子，所述终 止子位于后类载体的前端，为AOX1终止子。

进一步的，所述筛选基因位于前类载体片段和后类载体片段的中部，为HIS4和Kan。

上述类载体片段的使用可以通过设计PCR引物中添加多核苷酸接头并用T4DNA聚合酶 处理获得两端与前类载体片段后端及后类载体片段前端互补的目的基因片段后，采用连接 酶连接获得线性表达载体。

根据上述设计原则，本发明实施例具体公开了一种用于构建线性化表达载体的类载体 片段，所制备的前类载体片段的5’冗余粘性末端的冗余碱基序列为“3’-GA 5’”，另一 末端为平端，后类载体片段的5’冗余粘性末端的冗余碱基序列为“5’GAC-3’”，另 一末端为平端。前类载体片段包含在序列SEQ ID NO：1中，两端含有限制性酶切位点SnaB I 和Acc I且经两个酶酶切产生的末端即是所述的末端，后类载体片段包含在序列SEQ ID NO：2 中，两端含有限制性酶切位点SnaB I和Cpo I且经两个酶酶切产生的末端即是所述的末端。 所述类载体证实其可用于构建线性化表达载体。

使用本发明类载体片段的方法，可包括下列步骤：

1)目的基因片段的构建：

A.设计带有多核苷酸接头的PCR引物扩增目的基因得到目的基因的PCR扩增产物； 设计的多核苷酸接头应满足使得PCR扩增产物经T4DNA聚合酶处理后两端均产生 5’冗余粘性末端，且编码链5’端对应的5’冗余粘性末端与所述类载体片段的前 类载体片段的后端5’冗余粘性末端互补，编码链3’端对应的5’冗余粘性末端与 所述类载体片段的后类载体片段的前端5’冗余粘性末端互补；

PCR引物的其他设计满足一般引物设计的要求。

B.将目的基因的PCR扩增产物纯化后，利用T4DNA聚合酶处理或工具酶酶切产生5’ 冗余粘性末端；

2)将目的基因片段与所述类载体片段连接。连接产物即线性双链DNA片段可用于转化 表达宿主。

如实施例列举的，步骤1)设计的PCR扩增目的基因的引物满足下列条件；引物的5’ 端添加多核苷酸接头，目的基因前端引物即上游引物的5’端前3个碱基为CTA的接头，目 的基因后端引物即下游引物的5’端前4个碱基为GTCA的接头；带有这2个多核苷酸接头 的PCR扩增产物经T4 DNA聚合酶在碱基底物dTTP存在时处理后产生5’冗余粘性末端，且 编码链5’端对应的5’冗余粘性末端与所述类载体片段的前类载体片段的后端5’冗余粘 性末端互补，编码链3’端对应的5’冗余粘性末端与所述类载体片段的后类载体片段的前 端5’冗余粘性末端互补；

根据本发明的设计原理，本技术领域的技术人员还可以设计出很多符合上述末端要求的 前类载体片段和后类载体片段，特别是对于所述前后类载体末端和表达元件的调换或/和更 换，这些改变可产生无数个类载体片段，应用于多种酵母等生物的线性载体构建，且并不 局限于重组表达步骤，比如将元件替换成酵母双杂交载体元件后，可快速高通量进行相关 实验，非常方便。

经研究发现，不参与预期连接反应的前类载体片段的前端和后类载体片段的后端最经济 有效的应该是平末端，参与预期连接反应的前类载体片段的后端和后类载体片段的前端为 5’冗余末端。冗余末端的回文对称序列会导致末端的自连接，产生假阳性并降低片段使用 效率，因此本发明设计的两个冗余末端不出现回文对称序列。此外，目的基因片段末端可 以很方便地通过增加引物连接接头并用T4DNA连接酶降解的方式来制备，不像多数常规表 达载体需要采用限制性内切酶来制备目的基因粘性末端，从而使同一对类载体片段可与不 同目的基因连接制备线性化载体片段。本发明通过高效准确的连接反应制备类似线性化载 体片段，避开了通过繁琐耗时的环状质粒载体的构建而获得线性化载体片段的过程，同时 目的基因末端的产生不受其序列的限制可以极大简化操作、降低成本并缩短实验周期，在 酵母表达系统中具有很好的应用前景。

附图说明

图1：本发明线性化表达载体构建方法技术路线示意图

图2：毕式酵母GS115和载体pPIC9K表达绿色荧光蛋白GFP的重组表达技术路线图

图3：毕式酵母GS115和类载体表达绿色荧光蛋白GFP的重组表达的技术路线图

图4：本发明类载体片段示意图

图5：连接反应液琼脂糖凝胶电泳结果

图6：菌体PCR验证图

图7：荧光显微镜检测GFP表达情况

具体实施方式

本发明所使用的术语均为一般分子生物学和生物化学术语。

本发明以毕式酵母(Pichia pastoris)的菌株GS115和自制的类载体片段表达绿色荧 光蛋白GFP为例具体阐述该发明的实施。应理解实例并非用于限制本发明的保护范围。

实施例1

制备前后类载体片段

为方便制备前后类载体片段，本发明实施例中先将其构建于质粒载体，通过提纯质粒、 酶切和回收等步骤即可获得备用的前后类载体片段。

将含有前类载体片段的序列SEQ ID NO：1构建在质粒pUC18中，方法如下：1)以引物 (5’ATGCGGATCCTACGTAAACATCCAAAGACGAAAGG 3’(SEQ ID NO：3)，5’ ATGCCTGCAGGTAGACTCGATCCTTCGAATAATTAG 3’(SEQ ID NO：4))扩增质粒pPIC9K的约 7bp-944bp的序列，胶回收扩增产物并用限制性内切酶BamH I和Pst I双酶切，酶切产物 胶回收备用；2)将质粒pUC18用限制性内切酶BamH I和Pst I双酶切并胶回收备用；3) 将上述两步中制备的酶切载体和片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过筛选获 得质粒pUC18-seq1，经核苷酸序列测定质粒pUC18-seq1含有序列SEQ ID NO：1。将质粒 pUC18-seq1以限制性内切酶SnaB I和Acc I酶切并胶回收约0.95kb片段即是前类载体片 段，即相当于序列为SEQ ID NO：1的片段经限制性内切酶SnaB I和Acc I酶切产生两个末 端，末端序列为：

将含有后类载体片段的序列SEQ ID NO：2构建在质粒pPIC9K中，质粒pPIC9K的约 1234bp-6879bp为所需序列，在其两端加入限制性内切酶Cpo I和SnaB I位点后即是序列 SEQ ID NO：2所示序列，改造质粒pPIC9K的方法如下：1)以引物(5’ GTACGGATCCGGATCCAAACGATGAGATT 3’(SEQ ID NO：5)，5’ GTACGCGGCCGCCGGTCCGCCTAGGGAATTCTACGTAAGC 3’(SEQ ID NO：6))扩增质粒pPIC9K的约 938bp-1233bp的序列，胶回收扩增产物并用限制性内切酶BamH I和Not I双酶切，酶切产 物胶回收备用；2)将质粒pPIC9K用限制性内切酶BamH I和Not I双酶切并胶回收备用； 3)将上述两步中制备的酶切载体和片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过筛选 获得质粒pPIC9K-seq2-1，此为加入Cpo I位点过程；4)以引物(5’ ATGCAGATCTTACGTACTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGAC 3’(SEQ ID NO：7)，5’ AGTCAGATCTCGAATAATAACTGTTATTTTTCAG 3’(SEQ ID NO：8))扩增质粒pPIC9K的约 6880bp-9276bp的序列，胶回收扩增产物并用限制性内切酶Bgl II酶切，酶切产物胶回收 备用；2)将质粒pPIC9K-seq2-1用Bgl II酶切并胶回收备用；3)将上述两步中制备的酶 切载体和片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过筛选获得质粒pPIC9K-seq2， 此为加入SnaB I位点过程，经核苷酸序列测定质粒pPIC9K-seq2含有序列SEQ ID NO：2。将 质粒pPIC9K-seq2用限制性内切酶SnaB I和Cpo I酶切并胶回收约5.65kb片段即是后类 载体片段，即相当于序列为SEQ ID NO：2的片段经限制性内切酶SnaB I和Cpo I酶切产生 两个末端，末端序列为：

上述PCR扩增的条件体系为：10×Pyrobest DNA Polymorase Buffer，5μL；dNTP(10 mM)，4μL；引物(20μM)，各1μL；质粒模板，1ng；Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa Code DR005A)，0.5-1U；补蒸馏水至总体积50μL。PCR循环条件为：94℃ 5min；94℃ 1min， 50-55℃1min，72℃1.5-3min，30个循环；72℃10min。所述质粒提取按照试剂盒(QIAGEN Plasmid Mini Kit Cat.No.12123)说明书要求并以无菌蒸馏水代替TE缓冲液溶解质粒。 所述质粒和载体的酶切所用限制性内切酶为Acc I(TaKaRa Code D1001A)、SnaB I(TaKaRa Code D1179A)、Cpo I(TaKaRa Code D1035A)、BamH I(TaKaRa Code D1010A)、Pst I(TaKaRa Code D1073A)、Not I(TaKaRa Code D1166A)和Bgl II(TaKaRa Code D1021A)等均按照 说明书使用。PCR产物及酶切产物经胶回收试剂盒(QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit  Cat.No.28604)回收后备用，操作按试剂盒说明书进行。所述连接反应与实施例3。所述连 接产物转化、克隆子筛选和细菌培养等为基本分子生物学操作，所用质粒构建、复制和保 存的菌株为大肠杆菌DH5α。含有前后类载体片段的质粒经测序证明所含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列正确。

SEQ ID NO：1

TACGTAAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAA GTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAAC ACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGG CTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCA ACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCC AAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAACT AAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTTCCAAAAGTCGCCATACCGTTTGTCTTGTT TGGTATTGATTGACGAATGCTCAAAAATAATCTCATTAATGCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTG CACCTGTGCCGAAACGCAAATGGGGAAACACCCGCTTTTTGGATGATTATGCATTGTCTCCACATTGTATGCTTCCAA GATTCTGGTGGGAATACTGCTGATAGCCTAACGTTCATGATCAAAATTTAACTGTTCTAACCCCTACTTGACAGCAAT ATATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACT GGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGA AGGATCGAGTCTAC

SEQ ID NO：2

CGGACCGGCGGCCGCGAATTAATTCGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGG TCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTT ATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATC TCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTC CTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACC CTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATC GCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCC GACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACA CCCGTCCTGTGGATCTATCGAATCTAAATGTAAGTTAAAATCTCTAAATAATTAAATAAGTCCCAGTTTCTCCATACG AACCTTAACAGCATTGCGGTGAGCATCTAGACCTTCAACAGCAGCCAGATCCATCACTGCTTGGCCAATATGTTTCAG TCCCTCAGGAGTTACGTCTTGTGAAGTGATGAACTTCTGGAAGGTTGCAGTGTTAACTCCGCTGTATTGACGGGCATA TCCGTACGTTGGCAAAGTGTGGTTGGTACCGGAGGAGTAATCTCCACAACTCTCTGGAGAGTAGGCACCAACAAACAC AGATCCAGCGTGTTGTACTTGATCAACATAAGAAGAAGCATTCTCGATTTGCAGGATCAAGTGTTCAGGAGCGTACTG ATTGGACATTTCCAAAGCCTGCTCGTAGGTTGCAACCGATAGGGTTGTAGAGTGTGCAATACACTTGCGTACAATTTC AACCCTTGGCAACTGCACAGCTTGGTTGTGAACAGCATCTTCAATTCTGGCAAGCTCCTTGTCTGTCATATCGACAGC CAACAGAATCACCTGGGAATCAATACCATGTTCAGCTTGAGACAGAAGGTCTGAGGCAACGAAATCTGGATCAGCGTA TTTATCAGCAATAACTAGAACTTCAGAAGGCCCAGCAGGCATGTCAATACTACACAGGGCTGATGTGTCATTTTGAAC CATCATCTTGGCAGCAGTAACGAACTGGTTTCCTGGACCAAATATTTTGTCACACTTAGGAACAGTTTCTGTTCCGTA AGCCATAGCAGCTACTGCCTGGGCGCCTCCTGCTAGCACGATACACTTAGCACCAACCTTGTGGGCAACGTAGATGAC TTCTGGGGTAAGGGTACCATCCTTCTTAGGTGGAGATGCAAAAACAATTTCTTTGCAACCAGCAACTTTGGCAGGAAC ACCCAGCATCAGGGAAGTGGAAGGCAGAATTGCGGTTCCACCAGGAATATAGAGGCCAACTTTCTCAATAGGTCTTGC AAAACGAGAGCAGACTACACCAGGGCAAGTCTCAACTTGCAACGTCTCCGTTAGTTGAGCTTCATGGAATTTCCTGAC GTTATCTATAGAGAGATCAATGGCTCTCTTAACGTTATCTGGCAATTGCATAAGTTCCTCTGGGAAAGGAGCTTCTAA CACAGGTGTCTTCAAAGCGACTCCATCAAACTTGGCAGTTAGTTCTAAAAGGGCTTTGTCACCATTTTGACGAACATT GTCGACAATTGGTTTGACTAATTCCATAATCTGTTCCGTTTTCTGGATAGGACGACGAAGGGCATCTTCAATTTCTTG TGAGGAGGCCTTAGAAACGTCAATTTTGCACAATTCAATACGACCTTCAGAAGGGACTTCTTTAGGTTTGGATTCTTC TTTAGGTTGTTCCTTGGTGTATCCTGGCTTGGCATCTCCTTTCCTTCTAGTGACCTTTAGGGACTTCATATCCAGGTT TCTCTCCACCTCGTCCAACGTCACACCGTACTTGGCACATCTAACTAATGCAAAATAAAATAAGTCAGCACATTCCCA GGCTATATCTTCCTTGGATTTAGCTTCTGCAAGTTCATCAGCTTCCTCCCTAATTTTAGCGTTCAACAAAACTTCGTC GTCAAATAACCGTTTGGTATAAGAACCTTCTGGAGCATTGCTCTTACGATCCCACAAGGTGGCTTCCATGGCTCTAAG ACCCTTTGATTGGCCAAAACAGGAAGTGCGTTCCAAGTGACAGAAACCAACACCTGTTTGTTCAACCACAAATTTCAA GCAGTCTCCATCACAATCCAATTCGATACCCAGCAACTTTTGAGTTGCTCCAGATGTAGCACCTTTATACCACAAACC GTGACGACGAGATTGGTAGACTCCAGTTTGTGTCCTTATAGCCTCCGGAATAGACTTTTTGGACGAGTACACCAGGCC CAACGAGTAATTAGAAGAGTCAGCCACCAAAGTAGTGAATAGACCATCGGGGCGGTCAGTAGTCAAAGACGCCAACAA AATTTCACTGACAGGGAACTTTTTGACATCTTCAGAAAGTTCGTATTCAGTAGTCAATTGCCGAGCATCAATAATGGG GATTATACCAGAAGCAACAGTGGAAGTCACATCTACCAACTTTGCGGTCTCAGAAAAAGCATAAACAGTTCTACTACC GCCATTAGTGAAACTTTTCAAATCGCCCAGTGGAGAAGAAAAAGGCACAGCGATACTAGCATTAGCGGGCAAGGATGC AACTTTATCAACCAGGGTCCTATAGATAACCCTAGCGCCTGGGATCATCCTTTGGACAACTCTTTCTGCCAAATCTAG GTCCAAAATCACTTCATTGATACCATTATTGTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGT AACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGC AGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAA GGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGT CAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCG TGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGAT GAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAG ATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATG CTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTC ATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCAT AGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCA AAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCT TTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGT GATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGC AGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCG GGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCC GTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCT GGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCA TATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCC CTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAG AGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGC GCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGT ATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTC AACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGAGTATCTATGATTGGA AGTATGGGAATGGTGATACCCGCATTCTTCAGTGTCTTGAGGTCTCCTATCAGATTATGCCCAACTAAAGCAACCGGA GGAGGAGATTTCATGGTAAATTTCTCTGACTTTTGGTCATCAGTAGACTCGAACTGTGAGACTATCTCGGTTATGACA GCAGAAATGTCCTTCTTGGAGACAGTAAATGAAGTCCCACCAATAAAGAAATCCTTGTTATCAGGAACAAACTTCTTG TTTCGAACTTTTTCGGTGCCTTGAACTATAAAATGTAGAGTGGATATGTCGGGTAGGAATGGAGCGGGCAAATGCTTA CCTTCTGGACCTTCAAGAGGTATGTAGGGTTTGTAGATACTGATGCCAACTTCAGTGACAACGTTGCTATTTCGTTCA AACCATTCCGAATCCAGAGAAATCAAAGTTGTTTGTCTACTATTGATCCAAGCCAGTGCGGTCTTGAAACTGACAATA GTGTGCTCGTGTTTTGAGGTCATCTTTGTATGAATAAATCTAGTCTTTGATCTAAATAATCTTGACGAGCCAAGGCGA TAAATACCCAAATCTAAAACTCTTTTAAAACGTTAAAAGGACAAGTATGTCTGCCTGTATTAAACCCCAAATCAGCTC GTAGTCTGATCCTCATCAACTTGAGGGGCACTATCTTGTTTTAGAGAAATTTGCGGAGATGCGATATCGAGAAAAAGG TACGCTGATTTTAAACGTGAAATTTATCTCAAGATCTTACGTA

实施例2

制备目的基因片段

设计两条引物用于扩增绿色荧光蛋白GFP基因，在上游引物的5’端加入碱基CTA(注 意：因第一个氨基酸是ATG编码，为保证阅读框正确，GFP基因第一个碱基A被CTA碱基中 的A代替)，下游引物的5’端加入碱基GTCA和终止密码子，引物的序列如下：

上游引物5’CTATGGTGAGCAAGG 3’(SEQ ID NO：9)

下游引物5’GTCATTATACTTGTACAGC 3’(SEQ ID NO：10)

PCR扩增的条件体系为：10×Pyrobest DNA Polymorase Buffer，5μL；dNTP(10mM)， 4μL；上游引物(20μM)，1μL；下游引物(20μM)，1μL；含有GFP基因的质粒pEGFP-C1 (GenBank Accession #：U55763)，1ng；Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa Code DR005A)， 0.5-1U；补蒸馏水至总体积50μL。PCR循环条件为：94℃5min；94℃1min，55℃1min， 72℃1.5min，30个循环；72℃10min。产物经PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN MinElute PCR Purification Kit Cat.No.28004)纯化后经琼脂糖凝胶电泳测定浓度后备用，纯化操作按 试剂盒说明书进行。

将纯化得到的PCR产物用T4 DNA Polymerase(TaKaRa Code D2040)处理，反应体系 为：10×T4 DNA Polymorase Buffer，5μL；dTTP(2.5mM)，4μL；PCR扩增GFP产物， 10nmol；T4 DNA Polymerase，4U；补蒸馏水至总体积50μL，37℃反应0.5h。涡旋终 止反应，备用。

上述所制备的目的基因片段长约0.73kb，末端序列分别于上述的类载体片段末端序列 匹配，其末端序列为：

实施例3

将上述制备的类载体片段和目的基因片段用大肠杆菌连接酶连接(E.coli DNA Ligase， TaKaRa Code D2160A)，反应体系为：类载体片段，各10pmol；目的基因片段，10pmol； 10×E.coli DNA Ligase Buffer，10μL；10×BSA(0.05％)10μL；E.coli DNA Ligase， 3U；补蒸馏水至总体积100μL，16℃反应3h，反应以0.8-1％琼脂糖凝胶电泳监控(结果 如图5：泳道3为连接3h检测结果，泳道2为未添加连接酶的对照组)，并胶回收7.3kb 的DNA片段备用，该片段即为“前类载体-GFP-后类载体”的线性化质粒载体片段。从电泳 结果可以看出连接效率非常高效准确，基本看不多错误连接的条带，对5.65kb片段通过光 密度扫描发现有高于80％片段发生连接反应。如有未连接片段存在，显然回收连接片段用于 转化优于直接转化连接产物。

实施例4

转化宿主生物并筛选阳性克隆子

将上述构建好的线性化载体片段转化毕式酵母(Pichia pastoris)菌株GS115，操作 完全按照Invitrogen公司的毕式酵母表达手册中电击转化的方法并在固体MD平板中筛选 获得阳性克隆子。通过菌落菌体PCR确认两个菌落含有GFP基因，菌体PCR方法与上述实 施例2中PCR方法一致，仅将模板换成酵母菌体并用Taq DNA聚合酶(TaKaRa Code DR001A) 代替Pyrobest DNA聚合酶，结果见图6。

挑取菌体PCR验证含有GFP基因的阳性克隆，按照Invitrogen公司的毕式酵母表达手 册诱导GFP蛋白的表达，并以倒置荧光显微镜Axiovert 200观察GFP蛋白的表达情况，见 图7，图7A为诱导后白光通道观察结果，菌体清晰可见，图7B为诱导后菌落GFP通道观察 结果，背景为黑色，菌体轮廓清晰可见(未转GFP基因的菌落在该通道不可见)。