一种新型促进骨生长发育、靶向骨发育异常的双功能酶

摘要

人类肌醇需酶IRE1α是一种同时具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和核糖核酸内切酶活性的双功能酶。细胞处于内质网应激时，可诱导IRE1α内质网腔的结构域发生二聚化，进而激活胞质的蛋白激酶域（Kinasedomain）和羧基末端具有核糖核酸内切酶活性的RNase结构域，这一过程可以缓解内质网应激压力，同时

说明书

依据专利法第二十六条第三款及专利法实施细则第十八条的规定，说明书应对发明作出清楚、完整的说明，使所属技术领域的技术人员，不需要创造性的劳动就能够再现发明的技术方案，解决其技术问题，并产生预期的技术效果。说明书应按以下五个部分顺序撰写：所属技术领域；背景技术；发明内容； 附图说明；具体实施方式；并在每一部分前面写明标题。 

技术领域

本发明发明涉及一种新型的促进骨生长发育、靶向骨发育异常的双功能酶 IRE1α（inositol requiring enzyme 1α），此发明属于医药卫生领域，可以直接应用于骨外科或创伤修复等临床和基础医学领域。 

  

人类肌醇需酶IRE1α由ERN1基因编码、位于内质网（ER）上的跨膜蛋白，是一种同时具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和核糖核酸内切酶活性的双功能酶。细胞处于内质网应激（Endoplasmic reticulum stress , ERS）时，可诱导IRE1α的内质网腔的结构域发生二聚化，激活胞质的蛋白激酶域（Kinase domain）， 进而发生自身磷酸化作用，进一步激活特定位点羧基末端具有核糖核酸内切酶活性的RNase 结构域，从而剪切一种重要的转录因子XBP1。这种非经典的mRNA 剪接方式会引起未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）的转录过程，该过程可以缓解内质网应激压力。ERS 介导的未折叠蛋白反应直接指导和参与ERS 状态下内质网中异常蛋白质的降解和再折叠，维持内质网内环境的稳定，实现对细胞的保护。其中IRE1α-XBP1 是决定细胞最终命运的关键通路，也是促进细胞分化的关键途径。

我们首先在软骨细胞分化的不同时相检测了IRE1α的转录与表达，同时运用免疫组织化学技术在不同胎龄小鼠骨生长板软骨细胞内检测了IRE1α的表达，我们发现IRE1α在软骨细胞分化各个时期均有表达。同时，我们构建IRE1α的腺病毒载体Ad-IRE1α，分别处理微团培养的ATDC5和C3H10T1/2细胞，利用realtime PCR 和免疫印迹等研究方法检测发现IRE1α在软骨细胞中可以明显上调软骨细胞分化各标志基因ColII、ColX及COMP的表达；而运用RNAi 技术抑制IRE1α的表达可以显著抑制BMP2 诱导的软骨细胞分化，因此，IRE1α是一种可以促进软骨细胞分化的双功能酶。这一发明可以直接应用于骨外科或创伤修复等临床和基础医学领域，有助于探索与解析软骨发育新的调控机制、为开发参与软骨生成与修复的生物制剂和药品提供靶分子。 

背景技术

 目前，临床使用的大多数药物治疗不能有效促进关节软骨缺损的愈合；自体软骨来源又非常有限,软骨移植手术也相应受到限制。因此，研发促进软骨修复的生物制剂是非常有意义的。我们在前期研究中发现IRE1α可以诱导软骨细胞的分化，促进软骨生长和发育。 

 相关背景技术如下： 

首先，进入互联网美国国家图书馆网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov，根据GenBank 提供的IRE1α基因序列 IRE1α(NM_001433.3)，用引物设计软件NTI vector 设计引物，上游引物加入XholⅠ酶切位点，下游引物加入HindⅢ酶切位点，目的基因扩增长度2934bp，构建IRE1α腺病毒载体Ad-IRE1α。同样的方法设计内参GAPDH 引物，扩增长度542bp。酶切电泳与测序结果显示构建正确，免疫印迹检测所构建病毒可以正确表达。

其次，我们运用不同类型干细胞（C3H10T1/2，ATDC5）的体外微团培养，在软骨细胞分化的不同时期，采用real-time PCR及免疫应迹等方法检测了IRE1α的转录与表达；同时运用免疫组织化学技术在不同胎龄小鼠骨生长板软骨细胞内检测了IRE1α的表达，我们发现IRE1α在软骨细胞分化的各个时期均有表达，尤其是增殖期和肥大期，并且随着软骨发育的不断成熟，IRE1α表达逐渐增加，在新生小鼠软骨发育的肥大期IRE1α表达达到峰值。 

第三，构建si-IRE1α腺病毒载体，与前面构建好的IRE1α腺病毒载体Ad-IRE1α分别转染干细胞C3H10T1/2和ATDC5，结合干细胞微团培养、小鼠趾骨体外诱导培养等方法，检测IRE1α与软骨细胞分化的关系，结果显示，IRE1α参与诱导软骨细胞的分化，通过上调软骨细胞肥大期标志基因X 型胶原(Collagen type X, ColX, Alp)的表达，促进软骨细胞的分化。 

总之，真核细胞中IRE1α具有调控细胞的生长、增殖、分化或者凋亡的能力，是决定细胞最终命运的调节器。我们进一步通过动物实验证实，IRE1α可以促进和诱导软骨细胞的分化，促进骨质增长，修复受损的关节，增加骨关节腔中软骨的密度，从而促进形成关节软骨组织，达到预防和治疗关节炎的作用。 

发明内容

  

IRE1α（inositol-requiring enzyme 1α）可以促进软骨细胞的分化与软骨生长发育，促进骨质增长，靶向修复受损的软骨、增加骨关节腔中软骨的密度。

我们申请对IRE1α上述特定的功能进行专利保护。根据中华人民共和国国家知识产权局发布的“专利审查指南(2010)” 第三部分“进入国家阶段的国际申请的审查”部分的规定(P302): 如果在申请的发明中，某蛋白质已知而其氨基酸序列是未知的，那么只要本领域技术人员在该申请提交时可以容易地确定其氨基酸序列，编码该蛋白质的基因发明就不具有创造性。但是，如果该基因具有特定的碱基序列，而且与其他编码所述蛋白质的、具有不同碱基序列的基因相比，具有本领域技术人员预料不到的效果，则该基因的发明具有创造性。 

因此，我们认定: 我们申请的关于“一种新型促进骨生长发育、靶向骨发育异常的双功能酶”发明专利是完全符合中华人民共和国国家知识产权局各项规定的，恳请国家知识产权局给予批准与支持。