一种快速鉴定辣椒疫霉对丁吡吗啉抗药性的方法及专用引物

摘要

本发明涉及辣椒疫霉纤维素合酶相关基因CesA3核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂丁吡吗啉抗性监测中的应用，具体公开了一种鉴定辣椒疫霉CesA3基因3365位核苷酸突变对丁吡吗啉产生抗药性的分子检测方法及专用引物。该特异性引物对，由SEQ ID N0：2和SEQ ID NO：3所示的DNA分子组成。本发明提供的检测辣椒疫霉对杀菌剂丁吡吗啉抗药性的分子诊断方法，灵敏度高、稳定性好、检测周期短，可以用于高通量地监测田间辣椒疫霉对杀菌剂丁吡吗啉的抗性发生、发展情况，实现抗性病害的早期预警，对及时有效地控制抗药性病害的发展具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及辣椒疫霉纤维素合酶相关基因CesA3核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌 剂丁吡吗啉抗性监测中的应用，具体公开一种快速鉴定辣椒疫霉CesA3基因的核苷酸点 突变及其对丁吡吗啉抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。

背景技术

辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)是一种重要的植物病原卵菌，由辣椒疫霉 侵染辣椒引起的辣椒疫病，是一种世界性分布的毁灭性病害，在我国普遍发生，且有逐 年加重趋势。在气候适宜的的条件下，短期内就可爆发，蔓延速度极快，一般发病可引 起30％产量损失，严重情况下可导致辣椒绝收。辣椒疫霉还可以侵染茄科、豆科、葫芦 科等多种作物，引起产量损失。

目前，在农业措施、抗病育种、生物防治、植物检疫和化学防治等诸多防治措施中， 化学防治仍是控制植物病原卵菌病害的主要手段，在卵菌的病害防治中发挥着不可替代 的作用。以甲霜灵为代表的苯酰胺类杀菌剂，成为卵菌病害化学防治的里程碑，然而， 目前病原卵菌对该类杀菌剂已普遍产生抗药性，因此在生产实践中苯酰胺类杀菌剂的使 用受到限制。丁吡吗啉(pyrimorph)是2003年由中国农业大学创制的新型杀菌剂，在 中国已获批临时登记，用于辣椒疫病和番茄晚疫病等卵菌病害的防治。丁吡吗啉的作用 机制目前还不明确，但研究显示该药剂与CAA类杀菌剂具有交互抗药性，因此，推测 丁吡吗啉与CAA类杀菌剂具有相似的作用机制。已有研究表明，与纤维素合成相关的 蛋白酶cesA3是CAA类杀菌剂的作用靶标(朱书生等，2007；Blum etal.，2010)。

迄今，尚未发现辣椒疫霉对丁吡吗啉敏感性下降的报道。然而，每年近20,000kg 丁吡吗啉用于田间生产，且逐年增多。而且在室内条件下通过自然筛选和药剂驯化的方 式获得了对丁吡吗啉产生高抗性水平的辣椒疫霉菌株，并且抗性菌株的生存适合度较 高，表明具有较高的抗性风险。因此，在使用丁吡吗啉防治卵菌病害的过程中需要注意 避免抗药性的产生，加强检测和早期预警病原菌对丁吡吗啉的抗性发生发展情况，这有 助于指导丁吡吗啉的科学使用，延缓其抗药性的发生和发展，延长药剂的使用寿命。

可以用于病原菌抗药性检测的常规方法包括：菌丝生长测定法、菌丝干重测定法， 孢子萌发测定法、琼脂展布法和抑菌圈测定法等。但是这些方法都需要通过离体条件下 分离培养获得病原菌的纯培养物，测定药剂对病原菌的EC₅₀，借助已建立的敏感基线， 比较敏感和抗性菌株的差异，试验需要多个处理，多次重复，因此检测周期长、工作量 大、消耗的人力资源和材料较多。而且上述常规方法检测灵敏度低，抗药性菌株的突变 频率在1％以上才能被检测到。由于病原菌的繁殖、传播速度一般都很快，在自然界存 在的数量有很大，因此经过几次药剂选择后，抗药性病原菌亚群体可能会成为致病病原 群体的主体，造成病害大流行。

随着分子生物学技术的飞速发展及其应用范围的不断扩展，限制性酶切PCR、等 位特异PCR分子技术开始在病原菌抗药性检测中应用。与传统的检测方法比较，不但 节省了检测时间(一般不超过4h)、提高了工作效率，而且提高了检测的灵敏度，检测 频率在10^-5～10^-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊 断的理想方法。可以预测，分子检测技术将在病害的可持续管理系统中发挥愈来愈重要 的作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突 变位点的方法及其专用引物对。

本发明所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法， 包括如下步骤：

以待测辣椒疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示引物 对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为168 bp的片段，则所述待测辣椒疫霉中CesA3基 因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点指辣椒疫霉中CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3365位核苷 酸为A。

所述CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ ID NO：5 中自5’末端起第3365位核苷酸。

上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为58℃。

本发明所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的引物 对，由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示DNA分子组成。

本发明的另一个目的是提供辣椒疫霉中CesA3基因或蛋白的突变位点。

本发明所提供的辣椒疫霉中CesA3基因的一个突变位点，为辣椒疫霉中CesA3基因 的基因组序列自5’末端起第3365位核苷酸为A。所述CesA3基因的基因组序列自5’ 末端起第3365位核苷酸也就是SEQ ID NO：5中自5’末端起第3365位核苷酸。

本发明所提供的辣椒疫霉中CesA3蛋白的一个突变位点，为辣椒疫霉中CesA3蛋白 的自N端起第1077位氨基酸为赖氨酸。所述CesA3蛋白的自N端起第1077位氨基酸也 就是SEQ ID NO：4中自N端起第1077位氨基酸。

上述任一所述突变位点在鉴定辣椒疫霉抗药性中的应用也属于本发明的保护范围； 所述抗药性为抗丁吡吗啉。

上述应用中，存在所述突变位点的辣椒疫霉具有或候选具有抗药性。

SEQ ID NO：4所示蛋白或SEQ ID NO：5所示基因也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的检测辣椒疫霉对丁吡吗啉产生抗药性的点突变的方法，有助于快 速、灵敏地检测田间辣椒疫霉对丁吡吗啉的抗药性发生发展动态，为抗药性的治理提供 技术支持，便于及时调整病害防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。

附图说明

图1为抗丁吡吗啉的辣椒疫霉菌株及敏感菌株的cesA3基因DNA序列比较发现与抗 性相关的一个突变位点。Hd3和Hd11为敏感亲本菌株，R3-2，R3-3，R11-1为抗性菌株。

图2为采用特异性引物对扩增对丁吡吗啉敏感和抗性的辣椒疫霉菌株。引物对 CF1077(SEQ ID NO：1)+R1077(SEQ ID NO：3)用于检测对丁吡吗啉的敏感和抗 性的辣椒疫霉菌株，引物对R1077B(SEQ ID NO：2)+R1077(SEQ ID NO：3)用 于检测辣椒疫霉对丁吡吗啉的抗性菌株。其中Hd3，Hd11为辣椒疫霉敏感亲本菌株； R3-2，R3-3，R11-1为抗性菌株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

文中“抗性菌株”均指对杀菌剂丁吡吗啉抗性的辣椒疫霉菌；“敏感菌株”均指对 杀菌剂丁吡吗啉敏感的辣椒疫霉菌。

下述实施例中使用的辣椒疫霉菌株为：抗性菌株R3-2，R3-3，和R11-1；敏感菌株 Hd3和Hd11。

上述各个菌株均经过菌落生长测定法进行抗药性验证。

上述菌株Hd3、Hd11、R3-2、R3-3和R11-1采自中国河北地区。经过现有的形态 学和分子生物学方法鉴定为辣椒疫霉。上述各个菌株均经过菌丝生长测定法进行抗药性 验证。

实施例1、辣椒疫霉对丁吡吗啉的敏感性测定

三株辣椒疫霉抗性突变体，菌株编号分别为R3-2，R3-3，和R11-1；两株辣椒疫 霉敏感亲本菌株，菌株编号分别为Hd3和Hd11。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200g，琼脂粉13g，葡萄糖18g，蒸 馏水定容至1L，121℃湿热灭菌20分钟。

1、实验步骤如下：

1)将丁吡吗啉用二甲基亚砜(DMSO)配成10⁴μg/ml的母液。对于辣椒疫霉敏感 菌株的敏感性测定，将丁吡吗啉逐级稀释成187.5μg/mL，375μg/mL，750μg/mL， 1.5×10³μg/mL，3×10³μg/mL，4×10³μg/mL的浓度梯度；对于辣椒疫霉疫霉抗性菌株的敏 感性测定，将供试药剂丁吡吗啉逐级稀释成312.5μg/mL，625μg/mL，1.25×10³μg/mL， 2.5×10³μg/mL，5×10³μg/mL，1×10⁴μg/mL的浓度梯度。

2)对于辣椒疫霉敏感菌株的测定，用移液枪吸取药液60μl加入已灭菌的冷却至45 ℃的60ml PDA培养基中，使溶剂含量为1‰，混匀，将带药的培养基倒入直径为9cm的 培养皿中，设只加60μl DMSO的处理为空白对照，每个比例药剂设3次重复；对于辣椒 疫霉抗性菌株的测定，用移液枪吸取药液600μl加入已灭菌的冷却至45℃的60ml PDA 培养基中，使溶剂含量为1％，混匀，将带药的培养基倒入直径为9cm的培养皿中，设只 加600μ1DMSO的处理为空白对照，每个比例药剂设3次重复。

3)辣椒疫霉在PDA平板上培养5天后，沿菌落边缘用打孔器打取直径为0.5cm的菌 饼，菌丝面向下接种于步骤2)中的带药和对照培养基中，置于28℃培养箱中黑暗培养， 4d后测量菌落直径。

4)十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各复配比例对供试菌株 的菌丝生长的抑制率。然后将抑制率转化成机率值(Y)，药剂浓度转换成以10为底的 对数值(X)，在Microsoft Excel中作回归直线，分别求出供试辣椒疫霉菌株的毒力回归 曲线方程Y＝a+bX，以及相关系数r和有效抑制中浓度EC₅₀值，并计算抗性倍数。

抗性倍数＝抗性菌株的平均EC₅₀/敏感亲本菌株的平均EC₅₀

2、结果

表15株辣椒疫霉菌株对丁吡吗啉的敏感性

通过辣椒疫霉菌对丁吡吗啉敏感性检测，结果发现辣椒疫霉敏感菌株Hd3和Hd11 的平均EC₅₀为1.254μg/mL，而抗性菌株R3-2，R3-3，R11-1的平均EC₅₀为67.166μg/mL， 显著高于敏感菌株的EC₅₀，如表1。

实施例2、辣椒疫霉中CesA3基因和CesA3蛋白突变位点的发现

1、菌株：抗性菌株为R3-2，R3-3，R11-1；敏感菌株为Hd3和Hd11。

2、方法：

1)菌株培养：使用PDA培养基(马铃薯去皮200g，葡萄糖18g，琼脂粉13g， 蒸馏水定容至1L。121℃，20min，湿热灭菌后备用)于28℃培养辣椒疫霉病菌。将预 培养的辣椒疫霉敏感菌株接种在铺有玻璃纸的PDA培养基上，28℃黑暗培养5d后收集 菌丝，液氮冰冻后于-80℃保存，用于提取基因组DNA。

2)分别提取辣椒疫霉敏感菌株和抗性菌株的基因组DNA：

取适量经液氮冰冻的菌丝，研钵研磨至粉末状，置于1.5mL离心管中；

加入150mL抽提缓冲液(0.35M山梨醇，0.1M Tris，0.005M EDTA[pH7.5]， 0.02M亚硫酸氢钠)，在振荡器上振荡1min；

加入150mL核裂解缓冲液(0.2M Tris，0.05M EDTA[pH7.5]，2.0M NaCl和2％ CTAB[pH7.5])和60mL20％SDS，在振荡器上振荡后于65°C水浴15-30min；

加入等体积的氯仿∶异戊醇(v/v，24∶1)轻轻混匀，4℃，12000rpm离心20min；

取上清液于新管中，加入氯仿进行再次抽提；

离心后取上清液加入等体积的4℃异丙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(pH8.0)，-20 ℃下静置过夜沉淀基因组；

4℃，12000rpm离心20min，沉淀用300μL70％冷乙醇洗涤两遍；

真空干燥后，溶于50μL的TE缓冲液中(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA)于-20℃保存备用。

3)辣椒疫霉敏感菌株纤维素合酶CesA3基因的PCR扩增

采用引物PcCesA3F(5’-TTACTTACCGTACTCCGATCGCACG-3’)和PcCesA3R(5’- GCATGAACTCCAAACACAACAACAGC-3’)扩增辣椒疫霉纤维素合酶CesA3基因的全 长。

PCR反应体系如下：

50-μl的PCR体系：

PCR反应条件如下：

4)测序

将PCR产物进行测序。以基因组DNA为模版时，辣椒疫霉抗性菌株菌株的纤维素合 酶CesA3基因全长共3559bp，序列如SEQ ID NO：5所示，其中包含136bp的内含子序 列，cDNA编码1140个氨基酸。序列如SEQID NO：4所示。

5)序列比对

分别将抗性菌株R3-2、R3-3、R11-1和敏感菌株Hd3和Hd11的纤维素合酶CesA3 基因全长进行测序。通过DANMAN软件分析序列结果，发现存在如下突变位点：与敏感 菌株相比，抗性菌株中基因组基因CesA3自5’末端起在DNA序列的3365位核苷酸由C 突变为A，对应基因CesA3的cDNA序列的3229位。该位点碱基突变导致氨基酸序列在 1077位发生突变，由谷氨酰胺(Gln，Q)突变为赖氨酸(Lys，K)(图1)。

PCR产物测序结果表明，抗性菌株在3365位都发生突变并由C突变为A，分析测序 的峰线图，可发现该位点峰线图清晰单一明确，表明该位点的突变为纯合突变。因此， 该位点的突变与辣椒疫霉对杀菌剂丁吡吗啉产生抗性相关。

实施例3、检测瓜类疫霉中突变位点的方法

一、引物设计

菌株为实施例1中所用菌株。

引物如表2，根据突变体cesA3基因的序列设计allele specific-PCR引物，正向 引物RF1077的3’-端最后一个碱基与突变后的碱基一致，为了增加引物的特异性，在 反向引物3’-端第二个碱基引入错配碱基T(序列2)；反向引物为R1077(序列3)。

表2.PCR检测辣椒疫霉对杀菌剂丁吡吗啉的抗性菌株中使用的引物

  引物   序列(5’-3’)  CF1077(forward)  GTTCTTCGGGTTCTTCGTAATGAG(序列1)  R1077B(forward)  TCTTCGGGTTATTCGTGATGAGTA(序列2)   R1077(reverse)   CGAACACCACGATGTACACCTG(序列3)

反应体系如下：

50-μl PCR反应体系如下：

梯度PCR确定最适的退火温度。具体PCR反应条件如下：

结果表明，58℃是引物对(R1077B和R1077)的最适退火温度。在退火温度为58 ℃，只能从抗性菌株中扩增出168bp的目的条带。表明在引物3’-端第二个碱基引入 错配碱基T可以增加引物的特异性，进而区分等位基因。因此选用R1077B和R1077这 对引物用于Q1077K抗性等位基因的检测。

将引物对R1077B和R1077对抗性菌株的扩增产物进行测序，结果PCR产物序列为 SEQID NO：5中自5’末端起第3342至3509位核苷酸序列。

二、检测突变位点

以待测辣椒疫霉的基因组DNA为模板，用引物对R1077B和R1077进行PCR扩增。 然后进行凝胶电泳检测。

若能够从菌株基因组DNA中扩增获得168bp的片段，则判定所检测的辣椒疫霉中 基因CesA3自5’末端起第3365位核苷酸为A(即SEQ ID NO：5中自5’末端起第3365 位核苷酸为A，也即cDNA自5’末端起第3229位核苷酸为A)，进一步判定所述菌株为 抗性菌株；若不能扩增获得168bp的片段，则判定所检测的辣椒疫霉中基因CesA3自 5’末端起第3365位核苷酸为C(即SEQ ID NO：5中自5’末端起第3365位核苷酸为 C)，进一步判定所述菌株为敏感菌株。

PCR扩增体系及反应条件与实施例3的实验一中一致，退火温度为58℃。

待测菌株为：

抗性菌株R3-2，R3-3和R11-1，敏感菌株Hd3和Hd11。

结果如图2所示。结果表明，仅能从抗性菌株R3-2，R3-3和D11-1中扩增出特异 性片段，而不能从敏感菌株Hd3和Hd11中扩增出任何条带。因此采用引物R1077B和 R1077，在退火温度为58℃时进行PCR扩增，可以用于特异性检测辣椒疫霉是否对杀菌 剂丁吡吗啉产生了抗药性。