利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法

摘要

本发明公开了一种利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，包括步骤：一、在取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA并反转录合成cDNA；二、对任一四角蛤蜊样品的DMRT基因和GAPDH基因进行扩增并绘制溶解曲线；三、检测SYBRGreen在PCR反应过程中荧光信号的变化得到每个PCR反应的Ct值，以GAPDH基因为内参，采用2

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测多溴联苯醚（PBDEs）的方法，具体涉及一种利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，属于海洋PBDEs生物检测技术领域。

背景技术

多溴联苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是一系列含溴原子的芳香族化合物。作为全球使用最广泛的溴代阻燃剂，PBDEs在电子电器、纺织、橡胶、塑料、化工等领域得到了大量应用。PBDEs 能够通过生产、使用和产品的废弃而进入到环境中，通过大气沉降、地表径流等形式汇聚于海洋，累积于海洋沉积物和生物体中。PBDEs 污染遍布我国沿海，在渤海湾、辽东湾、莱州湾、胶州湾、厦门海域和珠江口海域，均检测到了PBDEs污染，在溴代阻燃剂生产工厂分布密集的莱州湾，4-6cm 海洋沉积物中PBDEs 浓度高达1800ng·g^{-1>干重，贝类PBDEs 富集量为230-720ng/g脂肪，高于日本（6.2-49ng/g脂肪）、韩国（8.5-440ng/g脂肪）和菲律宾（69-140ng/g脂肪），是目前报道的全球海域中贝类富集量的最高水平。毒理学实验表明，PBDEs对生物体具有内分泌干扰、免疫、发育、神经等多种毒性。}

目前，PBDEs的检测需借助大型仪器，例如：气相色谱-质谱联用。为了获得较为准确的结果，还需要配备专业的操作人员、选用C同位素内标，检测步骤繁琐、成本高。在前处理过程中会使用大量有机试剂，测定过程中还要使用标准品，造成了环境的二次污染。另外，方法和仪器都具有检测限，低于检测限的浓度检测不出来。关键的是，检测出的数值不能反映PBDEs对生物体的影响。

众所周知，污染物对生物体的影响是从分子水平开始的，然后逐步在细胞、组织、器官、个体、种群、群落等水平上显现。生物标志物是环境变化的生物学指标，可在生物体受到严重损伤之前提供早期预警，是监测环境生物效应的有效手段。尤其是分子水平的生物标志物，较细胞、组织、器官、个体和群落水平可以提供更为早期的预警，以便进行环境调控，避免大规模损失。生物标志物监测在国际上应用广泛，是发达国家海洋环境管理策略（如欧盟海洋战略框架指令）的强制性指标。我国海洋生态环境的生物监测，主要是利用海洋生物群落多样性评估生态环境质量，而群落多样性对于生态环境的响应较分子水平的生物标志物滞后。

贝类由于具有特殊的生活习性，并且分布广泛，是海洋环境污染的良好指示生物，也是毒理学研究的有力工具。贝类监测计划在世界范围内广泛开展。《中国海洋生态环境状况公报》通过检测贝类体内污染物的富集量来反映生态环境状况。目前，暂时还没有从环境导致的生物效应角度评估环境状况。

贝类的生物监测多集中于附着型贝类——贻贝和牡蛎。然而在缺乏附着基的滩涂区域，贻贝和牡蛎的分布量非常小，并且贻贝和牡蛎不能对海洋沉积物的污染做出有效指示。滩涂是海洋环境中受人类活动影响最为严重的区域，我国滩涂面积广阔，随着滩涂生态与环境状况恶化，开发滩涂贝类用于环境检测和毒理学研究是十分必要的。四角蛤蜊（Mactraveneriformis）是一种典型的滩涂贝类，广泛分布在我国、韩国和日本沿海，是我国主要的经济贝类之一。四角蛤蜊能够大量富集污染物，具有作为污染物指示物种的潜力，其埋栖生活的特性，对海洋沉积物和水质污染有较好的指示作用。

DMRT（double-sex and mab-3 relatated transcription factor）基因是一类转录调控因子，在性别决定、性腺分化、组织和器官的发育形成和功能维持等发面发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs的方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：在待测海水或海洋沉积物的取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA，以该性腺RNA为模板反转录合成cDNA；

步骤二：对于任意一个四角蛤蜊样品，对其DMRT基因和GAPDH基因进行扩增，并绘制溶解曲线，DMRT基因和GAPDH基因分别扩增时，加入等量的cDNA模板；

步骤三：通过检测SYBRGreen在PCR 反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR 反应的Ct 值，然后以GAPDH基因为内参，采用2^{−△△CT>法对结果进行分析，计算出DMRT 基因的相对表达量，DMRT基因的相对表达量与PBDEs的浓度呈现显著负相关，测定DMRT基因的相对表达量就可以反映海水或海洋沉积物被PBDEs污染的状况。}

前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，按照如下反应体系进行扩增：

cDNA 1μL、实时定量PCR反应混合液 10μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、水 8.2μL；

其中，用于检测四角蛤蜊DMRT基因的引物的序列信息如下：

正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT

反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG

用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的引物的序列信息如下：

正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG

反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT。

前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，按照如下PCR条件进行扩增：

95℃预变性5min，1 个循环；95℃变性15s，60℃退火30s，40 个循环。

前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，PCR扩增使用的试剂盒是SYBR GreenQRT-PCR 试剂盒。

前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，扩增结束后，对部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、测序以验证扩增的特异性和准确性。

本发明的有益之处在于：

（1）利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs，相比于目前的仪器化学方法，检出限更低，方法更加灵敏；

（2）采用的监测生物——四角蛤蜊在我国沿海分布广泛，采样便利；

（3）整个检测过程不使用有机试剂和污染物标准品，减少了对环境的污染，更为环保；

（4）检测成本更低，检测时间更短，重复性好，可信度高；

（5）对操作人员的专业性要求低，安全保障高；

（6）测定的数据不仅能够反映海水和海洋沉积物被PBDEs污染的状况，还能体现污染的生物学效应；

（7）利用早期的分子水平的生物标志物，能够实现海洋环境PBDEs污染的更早期预警，克服了传统的从群落水平进行海洋环境生物监测的滞后性。

附图说明

图1是实施例1中的四角蛤蜊DMRT基因表达量的计算结果；

图2是实施例2中的四角蛤蜊DMRT基因表达量的计算结果；

图3是实施例3中的四角蛤蜊DMRT基因表达量的计算结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

实施例1

1、驯养实验生物

采用二龄雄性四角蛤蜊作为实验生物，在实验室玻璃大缸驯养14d，水温16±1℃，溶解氧7.7-8.3，pH7.9-8.1，盐度33。每天换水，换水前投喂新月菱形藻。

2、进行胁迫实验

将四角蛤蜊转移到15个玻璃小缸里开始试验，每个小缸盛装50L海水，放养100只四角蛤蜊。

共设置5个实验组：

（1）无污染天然海水对照组；

（2）二甲基亚砜对照组；

（3）0.1μg/L 四溴联苯醚（BDE-47）组；

（4）1.0μg/L 四溴联苯醚（BDE-47）组；

（5）10μg/L 四溴联苯醚（BDE-47）组。

其中：

第（1）组是空白对照组，只有无污染天然海水；

第（2）组是溶剂对照组，二甲基亚砜用无污染天然海水稀释，二甲基亚砜终浓度为50μL/L；

第（3）组、第（4）组和第（5）组是BDE-47胁迫组，先将BDE-47粉末溶于助溶剂二甲基亚砜中，然后再一起加入无污染天然海水中，最终将BDE-47配制成0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L三个浓度，二甲基亚砜的终浓度均为50μL/L。

每组设置3个平行。

试验持续7d，每天均全部换水，并补加相应的污染物。在第1d、第3d、第5d和第7d剖取四角蛤蜊性腺。每个取样点每个实验组取3只四角蛤蜊为1个平行，共3个平行。

3、测定DMRT基因相对表达量

（1）提取各组性腺RNA

提取性腺RNA的方法具体如下：

1）剖取雄性四角蛤蜊性腺，放入液氮研磨，取研磨后的性腺40mg加入到1mL RNA提取液Trizol中；

2）加入0.2mL 氯仿，用力震荡15s，并于室温放置5min；

3）12000g、4℃离心15min，离心后，混合物从上到下依次为无色的水相、中间相和淡红色的酚仿相，RNA 就存在于水相中；

4）将水相移至离心管中，加入等体积异丙醇，-20℃放置15 min；

5）12000g、4℃离心15 min，沉淀RNA；

6）加1ml 75％的乙醇洗涤RNA 沉淀，12000g、4℃离心10 min，弃上清，重复洗涤一次；

7）RNA 沉淀干燥5-10min，加入30μL RNase-free 水，4℃放置30min，充分溶解RNA；

8）将RNA 样品稀释100 倍，在紫外分光光度计下测OD260 及OD280，RNA 的A260/A280应介于1.8-2.2 之间。

RNA浓度（μg/ml）=OD260×稀释倍数×40μg/ml。

用琼脂糖电泳检查RNA 的完整性，真核细胞核糖体RNA 的28S组分与18S 组分的比率应为2:1。

（2）反转录合成cDNA

1）DNA酶消化

RNA5μLDNA酶1μLRNA酶抑制剂0.5μL反转录缓冲液2μL无RNA酶水调整总体积至11.5μL

37℃温浴20min，然后向上述体系中加入反应终止液 1.0μL，65℃灭活DNA酶10min，之后再向体系中加入反转录引物2.0μL，70℃热变性5min，迅速冰浴2min。

2）反转录

在已完成变性反应的以上体系中加入：

反转录缓冲液3.0μL无RNA酶脱氧核糖核苷三磷酸1.25μL反转录酶1.0μLRNA酶抑制剂0.5μL无RNA酶水调整总体积至25μL

稍离心，然后42℃反转录1h，之后95℃灭活反转录酶10min。

（3）进行实时定量PCR

实时定量PCR（Quantitative real time PCR，QRT-PCR）是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR 进程。

对于任意一个样品，加入等量的cDNA模板，对其DMRT基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH，内参基因）进行分别扩增。按照如下反应体系和反应条件，采用SYBRGreenQRT-PCR 试剂盒，在ABI PRISM 7500 实时定量PCR 仪上进行扩增，并绘制溶解曲线，对部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、测序以验证扩增的特异性和准确性。

反应体系：

cDNA1μL实时定量PCR反应混合液10μL正向引物0.4μL反向引物0.4μL水8.2μL

其中，我们设计的用于检测四角蛤蜊DMRT基因的实时定量PCR 引物的序列信息如下：

正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT

反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG

我们设计的用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的实时定量PCR引物的序列信息如下：

正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG

反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT

PCR 条件：95℃预变性5min，1 个循环；95℃变性15s，60℃退火30s，40 个循环。

（4）计算DMRT 基因的相对表达量

通过检测SYBRGreen在PCR 反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR 反应的Ct 值，然后以GAPDH基因为内参，采用2^{−△△CT>法对结果进行分析，即可计算出DMRT 基因的相对表达量。用单因素方差分析同一取样点不同浓度组之间的差异。}

在本实施例中，四角蛤蜊DMRT基因的相对表达量的计算结果见图1。

由图1可知：BDE-47能够降低雄性四角蛤蜊性腺DMRT基因表达量，在胁迫的第1d，与对照组（包括空白对照组和溶剂对照组）相比，各胁迫组DMRT基因表达量均显著下降，随着BDE-47浓度的增加，DMRT基因表达量下降幅度增大，呈现剂量效应；随着BDE-47胁迫时间延长，DMRT基因表达量逐渐减小，呈现时间效应。

这说明：四角蛤蜊DMRT基因表达量可用于监控、检测海水PBDEs污染程度。

实施例2

1、驯养实验生物

以二龄雄性四角蛤蜊作为实验生物，采用与实施例1完全相同的方法驯养二龄雄性四角蛤蜊。

2、制备海洋沉积物

在烟台潮间带采集洁净的没有PBDEs污染的表层50mm沉积物，采集后30min内转移至实验室。搅拌沉积物，过0.5mm尼龙筛，收集粒径小于0.5mm的沉积物，然后再搅拌均匀实现均一化。

3、沉积物加标PBDEs

用二甲基亚砜配制BDE-47母液（100mg/0.1mL），加标沉积物，设置5个实验组：

（1）空白对照（只有无污染的天然海水）；

（2）溶剂对照组（二甲基亚砜和沉积物按照体积重量比1:10000混合）；

（3）1mg/Kg干重四溴联苯醚（BDE-47）组；

（4）10mg/Kg干重四溴联苯醚（BDE-47）组；

（5）100mg/Kg干重四溴联苯醚（BDE-47）组。

根据加标量计算每个处理组需要的BDE-47母液量。按照BDE-47溶液和沉积物体积重量比1:1进行混合，放置在玻璃缸内，在每个处理组需要的BDE-47母液体积的基础上补加无污染天然海水到所需BDE-47溶液体积。第（2）组至第（5）组，二甲基亚砜和沉积物体积重量比为1:10000。搅拌2h以达到均一，在16℃下储存30d，每隔3d搅拌1次，使BDE-47在沉积物中分布均匀。

4、用沉积物胁迫四角蛤蜊

收集处理好的加标沉积物，分别加到测试玻璃缸（4L）内。按照上覆水与沉积物体积重量比1:4的比例，加入干净的海水至满。每个组设置3个重复，静置24h。将10只四角蛤蜊放入1个测试玻璃缸，上覆水以10mL/min的速率连续更新，每天投喂1次新月菱形藻，胁迫7d。在第1d、第3d、第5d、第7d取雄性四角蛤蜊性腺。

5、测定DMRT基因的相对表达量

采用与实施例1相同的方法测定DMRT基因的相对表达量。

在本实施例中，四角蛤蜊DMRT基因的相对表达量的计算结果见图2。

由图2可知：用被BDE-47污染的沉积物胁迫四角蛤蜊时，BDE-47能够抑制DMRT基因表达，DMRT基因表达量对BDE-47响应敏感，在胁迫第1d，胁迫组DMRT基因表达量相比对照组即显著下降，随胁迫浓度的增加，DMRT基因表达量逐渐下降，DMRT基因表达量对BDE-47表现出剂量效应；随胁迫时间的延长，DMRT基因表达量逐渐减小，DMRT基因表达量对BDE-47表现出时间效应。

这说明：四角蛤蜊的DMRT基因表达量可用于海洋沉积物PBDEs污染的检测。

通过上面的两个研究我们发现，四角蛤蜊DMRT基因对PBDEs响应敏感，DMRT基因的表达量与PBDEs的浓度呈现显著负相关，所以测定DMRT基因的表达量可以反映海水和海洋沉积物被PBDEs污染的状况。

基于此，我们发明了一种利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs的方法，该方法具体包括以下步骤：

一、获取四角蛤蜊的cDNA

在待测海水或海洋沉积物的取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA，以该性腺RNA为模板反转录合成cDNA。

1、提取性腺RNA

提取性腺RNA的方法具体如下：

1）剖取雄性四角蛤蜊性腺，放入液氮研磨，取研磨后的性腺40mg加入到1mL Trizol中；

2）加入0.2mL 氯仿，用力震荡15s，并于室温放置5min；

3）12000g、4℃离心15min，离心后，混合物从上到下依次为无色的水相、中间相和淡红色的酚仿相，RNA 就存在于水相中；

4）将水相移至Eppendorf 管中，加入等体积异丙醇，-20℃放置15 min；

5）12000g、4℃离心15 min，沉淀RNA；

6）加1ml 75％的乙醇洗涤RNA 沉淀，12000g、4℃离心10 min，弃上清，重复洗涤一次；

7）RNA 沉淀干燥5-10min，加入30μL RNase-free 水，4℃放置30min，充分溶解RNA；

8）将RNA 样品稀释100 倍，在紫外分光光度计下测OD260 及OD280，RNA 的A260/A280应介于1.8-2.2 之间。

RNA浓度（μg/ml）=OD260×稀释倍数×40μg/ml。

用琼脂糖电泳检查RNA 的完整性，真核细胞核糖体RNA 的28S组分与18S 组分的比率应为2:1。

2、反转录合成cDNA

1）DNA酶消化

RNA5μLDNA酶1μLRNA酶抑制剂0.5μL反转录缓冲液2μL无RNA酶水调整总体积至11.5μL

37℃温浴20min，然后向上述体系中加入反应终止液 1.0μL，65℃灭活DNA酶10min，之后再向体系中加入反转录引物2.0μL，70℃热变性5min，迅速冰浴2min。

2）反转录

在已完成变性反应的以上体系中加入：

反转录缓冲液3.0μL无RNA酶脱氧核糖核苷三磷酸1.25μL反转录酶1.0μLRNA酶抑制剂0.5μL无RNA酶水调整总体积至25μL

稍离心，然后42℃反转录1h，之后95℃灭活反转录酶10min。

二、对四角蛤蜊的DMRT基因和GAPDH基因进行扩增

对于任意一个四角蛤蜊样品，对其DMRT基因和GAPDH基因（内参基因）进行扩增，DMRT基因和GAPDH基因分别扩增时，加入等量的cDNA模板。按照如下反应体系和反应条件，采用SYBR GreenQRT-PCR 试剂盒，在ABI PRISM 7500 实时定量PCR 仪上进行扩增，并绘制溶解曲线，对部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、测序以验证扩增的特异性和准确性。

反应体系：

cDNA1μL实时定量PCR反应混合液10μL正向引物0.4μL反向引物0.4μL水8.2μL

其中，用于检测四角蛤蜊DMRT基因的实时定量PCR 引物的序列信息如下：

正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT

反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG

用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的实时定量PCR引物的序列信息如下：

正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG

反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT

PCR 条件：95℃预变性5min，1 个循环；95℃变性15s，60℃退火30s，40 个循环。

三、计算四角蛤蜊DMRT 基因的相对表达量

通过检测SYBRGreen在PCR 反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR 反应的Ct 值，然后以GAPDH基因为内参，采用2^{−△△CT>法对结果进行分析，即可计算出DMRT 基因的相对表达量。用单因素方差分析同一取样点不同浓度组之间的差异。}

实施例3

为了验证本发明提供的检测海洋中的PBDEs的方法的可行性和准确性，我们从莱州湾西部滩涂采集了四角蛤蜊、海水和海洋沉积物，用本发明提供的方法检测了海水和海洋沉积物中的PBDEs，并与气相色谱-质谱联用测得的结果进行了比对。

2018年5月，我们在莱州湾西岸滩涂设置了8个调查站位，这8个调查站位的经纬度见表1。

表1莱州湾西岸调查站位经纬度

站位编号经度纬度1119°17′6″37°40′2119°10′37°39′3119°0′37°38′4118°57′37°32′5118°58′37°22′6119°59′37°16′7119°4′37°15′8119°11′37°8′

我们从这8个调查站位采集了雄性四角蛤蜊、海水和海洋沉积物，带回实验室，分析了雄性四角蛤蜊DMRT基因相对表达量，同时采用气相色谱-质谱联用测定了海水和海洋沉积物中PBDEs的含量。其中，海水中PBDEs的含量采用气相色谱-质谱联用测定的结果见表2，海洋沉积物中PBDEs的含量采用气相色谱-质谱联用测定的结果见表3，雄性四角蛤蜊DMRT基因相对表达量的测定结果见图3。

表2 莱州湾西岸调查站位海水中PBDEs的含量（pg/L）

站位12345678BDE-2838.530.353.232.534.173.49370.1BDE-4734.244.263.135.453.94078.141.2BDE-7127.924.835.831.145.731.244.528BDE-10026.60033.635.336.432.330.4BDE-13821.421.528.519.734.520.720.429.3BDE-20660.248.753.937.364.345.858.948.8BDE-20743.532.825.722.829.539.620.827.1BDE-20828.42632.827.140.794.653.833.3总计132.1113.2121.6130.2159190.7134.4127.2

表3 莱州湾西岸调查站位海洋沉积物中PBDEs的含量（ng/g dw）

站位12345678BDE-282.34.110.75.39.54.92.119.8BDE-47106.298.9152.889.4200.3264.1198.9186.3BDE-7110.912.73.67.234.127.431.84.6BDE-10022.413.411.210.87.714.221.232.5BDE-13817.521.945.123.512.610.76.413.2BDE-20612.813.14.811.921.122.517.89.1BDE-2075.94.21.35.75.38.612.61.7BDE-20824.618.69.516.318.525.913.118.4总计963.7730.5801.4566.1967.21050.51011.4931.4

随后，我们根据测定的雄性四角蛤蜊DMRT基因相对表达量以及海水和海洋沉积物中PBDEs的含量，采用皮尔森相关性分析结果表明海水PBDEs含量、海洋沉积物PBDEs含量均与DMRT基因表达量呈现显著负相关，相关性系数分别为-0.946、-0.836。

所以，测定DMRT基因的表达量可以反映海水和海洋沉积物被PBDEs污染的状况，本发明提供的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs的方法确实可行且有效。

另外，本发明提供的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs的方法，对于判断PBDEs对生物体的毒性、构建我国基于生物标物的海洋环境评价体系具有重要意义，能够助力我国实现标准化的生物监测，有良好的推广应用前景。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法

<141> 2019-10-29

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gttctgctgc ggacaggtat 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

taagacgccc atctcacg 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cgtattggtc gtcttgttgt tag 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ttagcagggt ctttctcgtt at 22