法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-06-26
授权
授权
2019-11-15
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K38/02 申请日:20190812
实质审查的生效
2019-10-22
公开
公开
技术领域
本发明属于微生物制药技术领域,尤其涉及一种治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂及其制备方法。
背景技术
近几年,由于抗生素的滥用,激素、免疫抑制剂的频繁使用,念珠菌的致病率随年累加。白色念珠菌是存在于人类口腔环境中的机会致病菌,感染力极强,在一定条件下,能够引起多种口腔黏膜疾病。口腔环境的改变,又会引起口腔内菌群失调,而牙周病的产生因素关键是菌群失调。人类口腔念珠菌病的经久不愈表明患者身体有局部或系统性的免疫低下或是丧失,如果没有及时予以抗真菌药物等治疗措施,将会导致感染播散或者可能引发系统性念珠菌疾病。当前,临床上治疗真菌性感染疾病的药物主要为唑类、丙烯胺类、多烯类等,由于长期使用广谱抗生素,可激发真菌产生相应耐药性,从而造成临床诊治中抗真菌性药物的选择极其困难。
细菌素(Bacteriocin),是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽,因其具有抑菌谱窄,安全、高效、无毒副作用以及无抗药性,获得了国内外学者的青睐。细菌素通过在靶细胞上穿孔、抑制肽聚糖合成,与核糖体或tRNA相互作用抑制蛋白质合成,直接降解靶细胞DNA,从而起到抑菌效果。
血链球菌是革兰氏阳性细菌,可粘附于口腔内软、硬组织上,是公认的牙周优势菌。血链球菌能产生一种具有抑菌活性的细菌素,即血链球菌素。公开号为CN106581638A的发明专利申请《血链球菌蛋白在制备抑制白色念珠菌的药物上的应用》公开了血链球菌蛋白,即血链球菌素能够用于治疗白色念珠菌病。但这篇专利申请的技术方案主要停留在理论研究阶段,并没有公开血链球菌素用于治疗口腔念珠菌病的具体治疗方法。而在实际的口腔念珠菌病治疗过程中,传统的给药方式如喷施、含片等常常造成血链球菌素有效成分因唾液稀释、冲散而无法在口腔黏膜患处精准实现药效。因此,如何在治疗过程中使血链球菌素在口腔黏膜患处精准实现药效成为现阶段亟需解决的问题。
发明内容
为解决血链球菌素无法在口腔黏膜患处精准实现药效的问题,本发明提供了一种治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂及其制备方法。
本发明的技术方案:
一种治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂,该制剂为口腔黏膜注射用粉针剂,血链球菌素以载药复合微球形式均匀分散于粉针剂中,该制剂包括如下质量份的组分:血链球菌素3~10份、金银花提取物1~3份、玄参提取物1~3份、麦冬提取物1~3份、薄荷脑1~3份、海藻酸钠30~50份、壳聚糖60~100份、吐温-808~10份和葡萄糖20~100份。
进一步的,该制剂包括如下质量份的组分:血链球菌素6份、金银花提取物2份、玄参提取物2份、麦冬提取物2份、薄荷脑2份、海藻酸钠40份、壳聚糖80份、吐温-809份和葡萄糖80份。
进一步的,所述载药复合微球的粒径为20~50μm,所述载药复合微球中血链球菌素的载药量为2~9%,金银花提取物、玄参提取物、麦冬提取物和薄荷脑的载药量均为0.5~3%,所述口腔黏膜注射用粉针剂封装于无菌西林瓶中,使用前用无菌注射用水将粉针剂充分悬浮,注射于口腔内白色念珠菌病患处黏膜下。
一种治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、制备载药复合微球:
称取30~50份海藻酸钠,用去离子水配制成一定质量浓度的海藻酸钠溶液,将3~10份血链球菌素加入所述海藻酸钠溶液中,超声分散均匀得到载药海藻酸钠溶液待用;
称取60~100份壳聚糖,以醋酸为溶剂,配制成一定质量浓度的壳聚糖溶液;将1~3份金银花提取物、1~3份玄参提取物、1~3份麦冬提取物和1~3份薄荷脑加入所述壳聚糖溶液中,超声分散均匀得到载药壳聚糖溶液待用;
向所述载药壳聚糖溶液中加入8~10份吐温-80并搅拌均匀,在一定转速机械搅拌下,将所得载药海藻酸钠溶液逐滴滴入所得载药壳聚糖溶液中,室温下持续搅拌8~12h后再对所得混合体系进行高速剪切,离心并收集沉淀,得到载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球;
步骤二、制备血链球菌素复配制剂:
称取20~100份葡萄糖,将其溶于去离子水中配制成一定质量浓度的葡萄糖水溶液,将步骤一制得的载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球用去离子水洗涤三次后加入所述葡萄糖水溶液中充分悬浮,将所得悬浮液真空冷冻干燥,灭菌后得到无菌的血链球菌素复配制剂。
进一步的,步骤一所述血链球菌素的提取方法为:
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,将培养液置于4℃条件下离心收集、洗涤菌体沉淀;
将所得菌体分散于PBS缓冲溶液中制成菌悬液,冰水浴条件下对菌悬液进行超声细胞破碎,4℃条件下离心收集细胞破碎液上清液;
向所得细胞破碎液上清液中加入硫酸铵使上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度并将其置于4℃盐析,所得第一盐析液于4℃离心,分别获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管,将第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再次加入硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析,所得第二盐析液于4℃离心,收集离心第二盐析沉淀,将所述第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到血链球菌素,于-80℃保存备用。
进一步的,所述离心收集菌体沉淀是以12000g/min离心30min,所述洗涤菌体是将离心收集到的菌体用1×PBS缓冲溶液振荡洗涤,再以12000g/min离心30min收集菌体,重复洗涤三次。
进一步的,所述菌悬液的菌体浓度为50mg/mL,所述超声破碎的频率为20~25KHz,超声功率为300W,超声时工作时间为4s,间歇时间为8s,共处理30min,所述离心收集细胞破碎上清液的离心条件为15000g/min离心45min。
进一步的,所述盐析时间均为12h,所述第一盐析液和第二盐析液的离心条件均为15000g/min离心45min,所得血链球菌素的纯度为89.7%。
进一步的,步骤一所述海藻酸钠溶液的质量浓度为3.0%,所述壳聚糖溶液的质量浓度为3.0%,所述超声分散的功率均为300~1000W,所述超声分散处理时间均为20~30min;所述搅拌速度为200~300rpm,所述高速剪切的转速为10000~13000rpm,所述高速剪切处理时间为5~20min,所述离心条件均为10000g/min离心25min。
进一步的,步骤二所述葡萄糖水溶液的浓度为5~50%,所述灭菌为环氧乙烷灭菌48h。
本发明的有益效果:
本发明提供的治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂以血链球菌素为主要抗真菌成分;金银花提取物、玄参提取物、麦冬提取物和薄荷脑能够起到滋阴生津的作用,缓解患者口干、灼热的症状。
本发明将血链球菌素复配制剂设计成口肠黏膜注射用粉针剂,其中有效药物成分以载药复合微球形式分散在粉针剂中,其中载药复合微球以金银花提取物、玄参提取物、麦冬提取物、薄荷脑与壳聚糖相复配做囊层,以血链球菌素和海藻酸钠相复配做核,增加了血链球菌素的活性和稳定性,提高其生物利用度。海藻酸钠和壳聚糖均为可降解材料,降解产物安全无毒,生物相容性好,在降解过程中起到缓释作用,可以延长药效期,避免频繁注射给病人造成的痛苦。
本申请血链球菌素复配制剂通过黏膜注射给药的方式直接注射到口腔白色念珠菌病患处黏膜下,能够精准实现药效,血链球菌素直接作用于白色念珠菌,局药浓度高,能够快速达到降低白色念珠菌的粘附力,抑制并杀灭白色念珠菌的效果。
本发明制备方法简单,工艺温和,为口腔念珠菌病的治疗提供了一种全新的给药方式,能够缩短口腔念珠菌病的病程,减轻患者痛苦,为念珠菌感染的治疗开拓了新的思路。
附图说明
图1为动物实验中A组、B组、C组和D组在给药0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h时实验小鼠口腔中白色念珠菌菌落数的变化对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
一种治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂,该制剂为口腔黏膜注射用粉针剂,血链球菌素以载药复合微球形式均匀分散于粉针剂中,该制剂包括如下质量份的组分:血链球菌素3~10份、金银花提取物1~3份、玄参提取物1~3份、麦冬提取物1~3份、薄荷脑1~3份、海藻酸钠30~50份、壳聚糖60~100份、吐温-808~10份和葡萄糖20~100份。
本实施例载药复合微球的粒径为20~50μm,所述载药复合微球中血链球菌素的载药量为2~9%,金银花提取物、玄参提取物、麦冬提取物和薄荷脑的载药量均为0.5~3%,所述口腔黏膜注射用粉针剂封装于无菌西林瓶中,使用前用无菌注射用水将粉针剂充分悬浮,注射于口腔内白色念珠菌病患处黏膜下。
实施例2
一种治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂,该制剂为口腔黏膜注射用粉针剂,血链球菌素以载药复合微球形式均匀分散于粉针剂中,该制剂包括如下质量份的组分:血链球菌素6份、金银花提取物2份、玄参提取物2份、麦冬提取物2份、薄荷脑2份、海藻酸钠40份、壳聚糖80份、吐温-809份和葡萄糖80份。
本实施例载药复合微球的粒径为20~50μm,载药复合微球中血链球菌素的载药量为4%,金银花提取物、玄参提取物、麦冬提取物和薄荷脑的载药量均为1%。本实施例中的口腔黏膜注射用粉针剂封装于15mL无菌西林瓶中,使用前用无菌注射用水将粉针剂充分悬浮,分别注射于口腔内白色念珠菌病患处不同位置黏膜下。
实施例3
一种治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、制备载药复合微球:
称取30~50份海藻酸钠,用去离子水配制成一定质量浓度的海藻酸钠溶液,将3~10份血链球菌素加入所述海藻酸钠溶液中,超声分散均匀得到载药海藻酸钠溶液待用;
称取60~100份壳聚糖,以醋酸为溶剂,配制成一定质量浓度的壳聚糖溶液;将1~3份金银花提取物、1~3份玄参提取物、1~3份麦冬提取物和1~3份薄荷脑加入所述壳聚糖溶液中,超声分散均匀得到载药壳聚糖溶液待用;
向所述载药壳聚糖溶液中加入8~10份吐温-80并搅拌均匀,在一定转速机械搅拌下,将所得载药海藻酸钠溶液逐滴滴入所得载药壳聚糖溶液中,室温下持续搅拌8~12h后再对所得混合体系进行高速剪切,离心并收集沉淀,得到载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球;
步骤二、制备血链球菌素复配制剂:
称取20~100份葡萄糖,将其溶于去离子水中配制成一定质量浓度的葡萄糖水溶液,将步骤一制得的载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球用去离子水洗涤三次后加入所述葡萄糖水溶液中充分悬浮,将所得悬浮液真空冷冻干燥,灭菌后得到无菌的血链球菌素复配制剂。
本实施例中薄荷脑、海藻酸钠、壳聚糖、吐温-80和葡萄糖等原料使用任意品牌的医用级市售成品均可。
实施例4
本实施例提供了一种提取血链球菌素的方法,具体步骤如下:
本实施例所用血链球菌(Streptococcus sanguinis)菌株ATCC10556购自四川华西口腔医学院卫生部口腔生物医学工程重点实验室,复苏、传纯后进行染色镜检和生化鉴定。
复苏S.s菌种ATCC10556:以三区划线法接种于哥伦比亚培养基上,于37℃厌氧培育48h后取出进行传代。
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,采用低温高速离心机在4℃条件下,以12000g/min离心30min后,缓慢取出离心筒并弃除上清液,收集菌体沉淀,用1×PBS缓冲溶液洗涤菌体,再以12000g/min离心30min,重复洗涤三次。
将收集到的菌体沉淀分散于252mLPBS缓冲溶液中,得到菌体浓度为50mg/mL的菌悬液,用超声细胞破碎机在冰水浴中对菌悬液进行细胞破碎,超声波频率为20~25KHz,超声波功率150W,超声波的工作时间4s,间歇时间为8s,共处理30min。将所得细胞破碎液于4℃下,15000g/min低温离心45min,得到258mL细胞破碎液上清液。
在冰水浴条件下,向所得细胞破碎液上清液中加入96.272g硫酸铵并将其搅拌溶解,使细胞破碎液上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度,将所得细胞破碎上清液置于4℃条件下盐析12h;得到第一盐析液。
将第一盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管;将275mL第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再加入17.687g硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析12h得到第二盐析液。
将第二盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第二盐析上清液和第二盐析沉淀,将第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到纯度为89.5~89.7%的血链球菌素,于-80℃保存备用。血链球菌素中含有一定量的杂质蛋白,不影响血链球菌素的药效。
本实施例利用二次盐析法使血链球菌细胞破碎液中的血链球菌素完全析出,提取效率高、所制备的血链球菌素纯度高。已有研究证实血链球菌素可能通过以下五种方式抑制以白色念珠菌为代表的致病念珠菌:
①血链球菌素可能导致细胞膜结构的破坏、形成孔性通道,释放出菌体内小分子物质和大分子物质。②血链球菌素可能破坏麦角固醇的形成,从而使菌体胞膜框架变得不牢固,加大胞膜的流动性。③血链球菌素可能黏附到菌体的细胞壁并和其中的自溶酶结合,将自溶酶激活并释放,最终使细胞自溶。④念珠菌菌丝的胞壁蛋白1(hyphal wallprotein1,Hwp1)在白色念珠菌黏附以及毒力方面有促进功能,因此血链球菌素可能减少Hwp1的合成。⑤凝集素样序列(agglutinin-like sequence,Als 1p和Als 5p)可能与白色念珠菌黏附力息息相关,血链素可能导致Als 1p和Als 5p的改变,从而降低C.a的黏附性。
实施例5
本实施例提供了一种制备金银花提取物、玄参提取物、麦冬提取物的方法,具体步骤如下:
选取金银花、玄参或麦冬作为原料,清洗干净后将原料置于65℃真空干燥箱中干燥15h,将充分干燥后将原料粉碎至80目得到金银花、玄参或麦冬粉末;向所得粉末中加入20倍体积的60%乙醇溶液,常温下浸泡3h待用;
将浸泡有原料粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中,密封后放入超高压提取装置的提取容器中;常温下在15min内将超高压提取装置内的压强升高至500Mpa,保压20min后在10~14s内将超高压提取装置内的压强迅速泄为常压;重复升压泄压的操作3次后,将塑料袋从超高压提取装置的提取容器中取出,将物料过滤除去滤渣,将滤液离心,取上清液重复离心1次,上清液浓缩得到金银花、玄参或麦冬粗提液;
将金银花、玄参或麦冬粗提液分别进行减压浓缩,喷雾干燥,得到金银花、玄参或麦冬提取物。
本实施例采用超高压提取工艺提取金银花、玄参或麦冬提取物,超高压提取过程中植物细胞内外压力达到平衡后快速泄压,造成细胞内外渗透压突然增大,使细胞膜的结构发生变化,使得细胞内的有效药物成分能够穿过细胞膜而转移到细胞外的提取液中,提取的更加充分,提高了原料药的利用率,降低了原料成本。
实施例6
本实施例利用实施例4提取得到的血链球菌素和实施例5制备的金银花提取物、玄参提取物和麦冬提取物制备治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂,具体制备方法包括如下步骤:
步骤一、制备载药复合微球:
称取30~50份海藻酸钠,用去离子水配制成质量浓度为3.0%的海藻酸钠溶液,将3~10份血链球菌素加入所述海藻酸钠溶液中,300~1000W功率超声分散处理20~30min得到载药海藻酸钠溶液待用;
称取60~100份壳聚糖,以体积浓度为3%的醋酸为溶剂,配制成壳聚糖质量浓度为3.0%的溶液;本实施例使用的壳聚糖脱乙酰度为80~85%;将1~3份金银花提取物、1~3份玄参提取物、1~3份麦冬提取物和1~3份薄荷脑加入所得壳聚糖溶液中,300~1000W功率超声分散处理20~30min得到载药壳聚糖溶液待用;
向所述载药壳聚糖溶液中加入8~10份吐温-80并搅拌均匀,在200~300rpm机械搅拌下,将所得载药海藻酸钠溶液逐滴滴入所得载药壳聚糖溶液中,室温下持续搅拌8~12h后对所得混合体系进行高速剪切,高速剪切的转速为10000~13000rpm,高速剪切处理时间为5~20min,10000g/min离心25min并收集沉淀,得到载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球;
步骤二、制备血链球菌素复配制剂:
称取20~100份葡萄糖,将其溶于去离子水中配制成质量浓度为5~50%的葡萄糖水溶液,将步骤一制得的载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球用去离子水洗涤三次后加入所述葡萄糖水溶液中充分悬浮,将所得悬浮液真空冷冻干燥,环氧乙烷灭菌48h后得到无菌的血链球菌素复配制剂。
实施例7
本实施例利用实施例4提取得到的血链球菌素和实施例5制备的金银花提取物、玄参提取物和麦冬提取物制备治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂,具体制备方法包括如下步骤:
步骤一、制备载药复合微球:
称取30g海藻酸钠,用去离子水配制成质量浓度为3.0%的海藻酸钠溶液,将3g血链球菌素加入所述海藻酸钠溶液中,300W功率超声分散处理30min得到载药海藻酸钠溶液待用;
称取60g壳聚糖,以体积浓度为3%的醋酸为溶剂,配制成壳聚糖质量浓度为3.0%的溶液;本实施例使用的壳聚糖脱乙酰度为80~85%;将1g金银花提取物、1g玄参提取物、1g麦冬提取物和1g薄荷脑加入所得壳聚糖溶液中,300功率超声分散处理30min得到载药壳聚糖溶液待用;
向所述载药壳聚糖溶液中加入8g吐温-80并搅拌均匀,在200rpm机械搅拌下,将所得载药海藻酸钠溶液逐滴滴入所得载药壳聚糖溶液中,室温下持续搅拌12h后对所得混合体系进行高速剪切,高速剪切的转速为10000rpm,高速剪切处理时间为20min,10000g/min离心25min并收集沉淀,得到载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球;
步骤二、制备血链球菌素复配制剂:
称取20g葡萄糖,将其溶于去离子水中配制成质量浓度为5%的葡萄糖水溶液,将步骤一制得的载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球用去离子水洗涤三次后加入所述葡萄糖水溶液中充分悬浮,将所得悬浮液真空冷冻干燥,环氧乙烷灭菌48h后得到无菌的血链球菌素复配制剂。
本实施例载药复合微球的粒径为20~50μm,载药复合微球中血链球菌素的载药量为2.5%,金银花提取物、玄参提取物、麦冬提取物和薄荷脑的载药量均为0.9%。
取本实施例中的口腔黏膜注射用粉针剂625mg封装于15mL无菌西林瓶中,使用前用2mL无菌注射用水将粉针剂充分悬浮,2mL注射液中含有15mg血链球菌素分别注射于口腔内白色念珠菌病患处不同位置黏膜下。
实施例8
本实施例利用实施例4提取得到的血链球菌素和实施例5制备的金银花提取物、玄参提取物和麦冬提取物制备治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂,具体制备方法包括如下步骤:
步骤一、制备载药复合微球:
称取35g海藻酸钠,用去离子水配制成质量浓度为3.0%的海藻酸钠溶液,将6g血链球菌素加入所述海藻酸钠溶液中,500W功率超声分散处理15min得到载药海藻酸钠溶液待用;
称取70g壳聚糖,以体积浓度为3%的醋酸为溶剂,配制成壳聚糖质量浓度为3.0%的溶液;本实施例使用的壳聚糖脱乙酰度为80~85%;将2g金银花提取物、2g玄参提取物、2g麦冬提取物和2g薄荷脑加入所得壳聚糖溶液中,500W功率超声分散处理15min得到载药壳聚糖溶液待用;
向所述载药壳聚糖溶液中加入9g份吐温-80并搅拌均匀,在200rpm机械搅拌下,将所得载药海藻酸钠溶液逐滴滴入所得载药壳聚糖溶液中,室温下持续搅拌12h后对所得混合体系进行高速剪切,高速剪切的转速为12000rpm,高速剪切处理时间为10min,10000g/min离心25min并收集沉淀,得到载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球;
步骤二、制备血链球菌素复配制剂:
称取40g葡萄糖,将其溶于去离子水中配制成质量浓度为20%的葡萄糖水溶液,将步骤一制得的载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球用去离子水洗涤三次后加入所述葡萄糖水溶液中充分悬浮,将所得悬浮液真空冷冻干燥,环氧乙烷灭菌48h后得到无菌的血链球菌素复配制剂。
本实施例载药复合微球的粒径为20~50μm,载药复合微球中血链球菌素的载药量为4.5%,金银花提取物、玄参提取物、麦冬提取物和薄荷脑的载药量均为1.5%。
取本实施例中的口腔黏膜注射用粉针剂630mg封装于15mL无菌西林瓶中,使用前用3mL无菌注射用水将粉针剂充分悬浮,3mL注射液中含有22.5mg血链球菌素分别注射于口腔内白色念珠菌病患处不同位置黏膜下。
实施例9
本实施例利用实施例4提取得到的血链球菌素和实施例5制备的金银花提取物、玄参提取物和麦冬提取物制备治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂,具体制备方法包括如下步骤:
步骤一、制备载药复合微球:
称取40g海藻酸钠,用去离子水配制成质量浓度为3.0%的海藻酸钠溶液,将8g血链球菌素加入所述海藻酸钠溶液中,800W功率超声分散处理15min得到载药海藻酸钠溶液待用;
称取80g壳聚糖,以体积浓度为3%的醋酸为溶剂,配制成壳聚糖质量浓度为3.0%的溶液;本实施例使用的壳聚糖脱乙酰度为80~85%;将2g金银花提取物、2g玄参提取物、2g麦冬提取物和2g薄荷脑加入所得壳聚糖溶液中,800W功率超声分散处理15min得到载药壳聚糖溶液待用;
向所述载药壳聚糖溶液中加入9g吐温-80并搅拌均匀,在300rpm机械搅拌下,将所得载药海藻酸钠溶液逐滴滴入所得载药壳聚糖溶液中,室温下持续搅拌10h后对所得混合体系进行高速剪切,高速剪切的转速为12000rpm,高速剪切处理时间为10min,10000g/min离心25min并收集沉淀,得到载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球;
步骤二、制备血链球菌素复配制剂:
称取80g葡萄糖,将其溶于去离子水中配制成质量浓度为30%的葡萄糖水溶液,将步骤一制得的载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球用去离子水洗涤三次后加入所述葡萄糖水溶液中充分悬浮,将所得悬浮液真空冷冻干燥,环氧乙烷灭菌48h后得到无菌的血链球菌素复配制剂。
本实施例载药复合微球的粒径为20~50μm,载药复合微球中血链球菌素的载药量为5%,金银花提取物、玄参提取物、麦冬提取物和薄荷脑的载药量均为1.3%。
取本实施例中的口腔黏膜注射用粉针剂665mg封装于15mL无菌西林瓶中,使用前用7mL无菌注射用水将粉针剂充分悬浮,7mL注射液中含有35mg血链球菌素分别注射于口腔内白色念珠菌病患处不同位置黏膜下。
实施例10
本实施例利用实施例4提取得到的血链球菌素和实施例5制备的金银花提取物、玄参提取物和麦冬提取物制备治疗口腔白色念珠菌病的血链球菌素复配制剂,具体制备方法包括如下步骤:
步骤一、制备载药复合微球:
称取50g海藻酸钠,用去离子水配制成质量浓度为3.0%的海藻酸钠溶液,将10g血链球菌素加入所述海藻酸钠溶液中,1000W功率超声分散处理20min得到载药海藻酸钠溶液待用;
称取100g壳聚糖,以体积浓度为3%的醋酸为溶剂,配制成壳聚糖质量浓度为3.0%的溶液;本实施例使用的壳聚糖脱乙酰度为80~85%;将3g金银花提取物、3g玄参提取物、3g麦冬提取物和3g薄荷脑加入所得壳聚糖溶液中,1000W功率超声分散处理20min得到载药壳聚糖溶液待用;
向所述载药壳聚糖溶液中加入10g吐温-80并搅拌均匀,在300rpm机械搅拌下,将所得载药海藻酸钠溶液逐滴滴入所得载药壳聚糖溶液中,室温下持续搅拌8h后对所得混合体系进行高速剪切,高速剪切的转速为13000rpm,高速剪切处理时间为5min,10000g/min离心25min并收集沉淀,得到载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球;
步骤二、制备血链球菌素复配制剂:
称取100g葡萄糖,将其溶于去离子水中配制成质量浓度为50%的葡萄糖水溶液,将步骤一制得的载药壳聚糖-海藻酸钠复合微球用去离子水洗涤三次后加入所述葡萄糖水溶液中充分悬浮,将所得悬浮液真空冷冻干燥,环氧乙烷灭菌48h后得到无菌的血链球菌素复配制剂。
本实施例载药复合微球的粒径为20~50μm,载药复合微球中血链球菌素的载药量为5.5%,金银花提取物、玄参提取物、麦冬提取物和薄荷脑的载药量均为1.6%。
取本实施例中的口腔黏膜注射用粉针剂637mg封装于15mL无菌西林瓶中,使用前用7mL无菌注射用水将粉针剂充分悬浮,7mL注射液中含有35mg血链球菌素分别注射于口腔内白色念珠菌病患处不同位置黏膜下。
对比例1
本对比例制备的一种含有血链球菌素的喷剂,包括如下步骤:
步骤一、提取血链球菌素:
本实施例所用血链球菌(Streptococcus sanguinis)菌株ATCC10556购自四川华西口腔医学院卫生部口腔生物医学工程重点实验室,复苏、传纯后进行染色镜检和生化鉴定。
复苏S.s菌种ATCC10556:以三区划线法接种于哥伦比亚培养基上,于37℃厌氧培育48h后取出进行传代。
将已传纯并鉴定后的血链球菌进行增殖培养,将血链球菌接种于BHI培养基中于37℃厌氧条件下恒温静置培养48h,采用低温高速离心机在4℃条件下,以12000g/min离心30min后,缓慢取出离心筒并弃除上清液,收集菌体沉淀,用1×PBS缓冲溶液洗涤菌体,再以12000g/min离心30min,重复洗涤三次。
将收集到的菌体沉淀分散于252mLPBS缓冲溶液中,得到菌体浓度为50mg/mL的菌悬液,用超声细胞破碎机在冰水浴中对菌悬液进行细胞破碎,超声波频率为20~25KHz,超声波功率150W,超声波的工作时间4s,间歇时间为8s,共处理30min。将所得细胞破碎液于4℃下,15000g/min低温离心45min,得到258mL细胞破碎液上清液。
在冰水浴条件下,向所得细胞破碎液上清液中加入96.272g硫酸铵并将其搅拌溶解,使细胞破碎液上清液中的硫酸铵达到60%的饱和度,将所得细胞破碎上清液置于4℃条件下盐析12h;得到第一盐析液。
将第一盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第一盐析上清液和第一盐析沉淀,将第一盐析沉淀妥善保管;将275mL第一盐析上清液在原有硫酸铵60%饱和度的基础上再加入17.687g硫酸铵将其饱和度调至70%并置于4℃条件下再次盐析12h得到第二盐析液。
将第二盐析液置于4℃下15000g/min离心45min,获得第二盐析上清液和第二盐析沉淀,将第一盐析沉淀和第二盐析沉淀合并后用PBS缓冲溶液溶解并经Sephadex G-25过柱除盐,收集过柱后的液体进行透析浓缩、冻干后即得到纯度为89.7%的血链球菌素,于-80℃保存备用。
步骤二、制备含有血链球菌素的喷剂
将2g血链球菌素溶于98mL无菌水中,震荡混匀制成载药量为2%的喷剂。
动物实验
(一)实验材料
白色念珠菌:C.glabrata菌株ATCC15126,购自上海复祥生物科技有限公司,复苏、传纯后进行染色镜检和生化鉴定。
昆明小鼠60只,雌雄各半,6~8周,重量20±2g,由东北农业大学提供。
(二)实验方法
将60只昆明小鼠随机分成4组,每组15只,即实施例7配制的每毫升注射液含有7.5mg血链球菌素的口腔黏膜注射液-A组,实施例9配制的每毫升注射液含有5mg血链球菌素的口腔黏膜注射液-B组,对比例1制备的载药量为2%的喷剂-C组和空白对照-D组。
在4组小鼠的饮用水中加入阿莫西林使其浓度达到1%,两周后水中阿莫西林浓度姜维0.1%直至实验结束。由于小鼠单侧颊部黏膜面积较小,约为4mm×4mm,因此以小鼠整个右侧颊部黏膜为观察对象。每天腹腔注射5%水合氯醛用以麻醉小鼠,随后用无菌小油画笔蘸取浓度为1×109CFU/mL的白色念珠菌菌悬液50μL,在小鼠口腔右侧颊部黏膜涂抹三下,每隔3天用无菌探针轻划小鼠口腔右侧颊部黏膜3下,以不划破黏膜为基准,持续4周,至小鼠右侧颊部黏膜形成白色斑片状生物被膜。
每组各任意选出一只完成建模的小鼠,临床观测到小鼠口腔右侧颊部黏膜上出现白色的斑片状损害,用棉签使劲擦掉后能看到充血严重的红色溃烂面。杀死后取右侧颊部涂菌处黏膜固定、脱水、包埋和切片,常规的进行HE染色和PAS染色。在病变严重处取其分泌物涂片,经过革兰氏染色,光镜下看到酵母样孢子。取病变处做病理学探查发现,PAS染色可见基底层上方有大量菌丝和孢子,固有层中有为数不多的慢性炎症细胞浸润,建模成功。
在建模成功的小鼠中,通过腹腔注射5%水合氯醛用以麻醉小鼠,将实施例7配制的每毫升注射液含有7.5mg血链球菌素的口腔黏膜注射液,实施例9配制的每毫升注射液含有5mg血链球菌素的口腔黏膜注射液分别注射至A组、B组小鼠的右侧颊部黏膜下,每只小鼠患处分5个注射点,共注射2mL,将对比例1制备的载药量为2%的喷剂至C组小鼠的右侧颊部黏膜,将0.9%的生理盐水涂抹至D组小鼠的右侧颊部黏膜,注射后每12h取样检测小鼠口腔白色念珠菌菌落数,取样至72h。
(三)实验结果
四组给药处理小鼠口腔白色念珠菌菌落数变化情况如图1所示:由图1可以看出,在给药前12h,C组直接喷施对比例1制备的喷剂的小鼠口腔内的白色念珠菌数量下降的更快,由于A组实施例7配制的每毫升注射液含有7.5mg血链球菌素的口腔黏膜注射液处理的小鼠和B组每毫升注射液含有5mg血链球菌素的口腔黏膜注射液处理的小鼠,这主要是由于实施例7和实施例9制备的注射液中血链球菌素包裹在复合微球中,不能立即作用于白色念珠菌,而C组直接喷施血链球菌素,因此见效速度较快。
但从给药24h开始,复合微球中的海藻酸钠和壳聚糖开始逐渐降解,将更多的血链球菌素释放出来,黏膜患处积累的血链球菌素逐渐增加,杀灭白色念珠菌的速度也越来越快,给药72h后A组、B组小鼠口腔内的白色念珠菌数量分别下降了98%和92%。
而C组由于血链球菌素喷施后不能长时间停留在患处,易被唾液稀释、冲散,无法长时间维持药效,72h后口腔内的白色念珠菌数量下降了70%。
由此可见,本申请血链球菌素复配制剂通过黏膜注射给药的方式直接注射到口腔白色念珠菌病患处黏膜下,能够精准实现药效,血链球菌素直接作用于白色念珠菌,局药浓度高,能够快速达到降低白色念珠菌的粘附力,抑制并杀灭白色念珠菌的效果。
机译: 稳定制剂的制备方法,该稳定制剂含有一种或多种脂溶性维生素ad或e形式的敏感,生物或治疗活性物质,或此类维生素或原维生素与抗氧化剂的混合物。
机译: 用于测试样品中酶促水解酶和靶标抑制剂的存在的方法以及用于检测阴道毛滴虫和白色念珠菌的水解酶以及用于在念珠菌病酶促水解酶存在的条件下对样品进行测试的测试装置和目标水解酶的抑制剂
机译: 用于治疗,抑制或减轻口腔炎性病症的口腔组合物,治疗和抑制口腔炎性病症中的至少一种的方法,口腔护理组合物以及治疗和抑制口腔炎性病症中至少一种的方法,并提供口腔中的抗氧化活性