一种金黄色节杆菌及其在制备秋葵多糖降解酶中的应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种金黄色节杆菌及其在制备秋葵多糖降解酶中的应用。本发明提供一种金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU，其于2019年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019035。该菌株能够高效分泌秋葵多糖降解酶，可用于制备秋葵多糖降解酶。该菌株产生的秋葵多糖降解酶具有较高的秋葵多糖降解活性，且具有较高的热稳定性以及较广的温度和pH适应范围，为酶法降解秋葵多糖提供了高效的资源，为秋葵的高值化利用提供了有利的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种金黄色节杆菌及其在制备秋葵多糖降解酶中的应用。

背景技术

秋葵(Abelmoschus esculent，又名黄秋葵)，锦葵科一年生草本植物，是一种药、花、菜、饲料兼用型植物。20世纪90年代从中国台湾和日本引进，现山东、广东、江苏、浙江、海南和福建等省份均有种植。近几年山东秋葵种植面积一直呈上升趋势，目前种植面积已达10万余亩，约占中国种植面积的三分之一。目前，山东省秋葵的销售主要依靠加工企业的订单，80％的秋葵作为特菜速冻加工之后出口日、韩等国，小部分黄秋葵作为鲜食蔬菜供应国内市场。然而，随着农户对秋葵价值的了解以及秋葵可观的销售价格，促使一些种植户盲目大面积种植，但由于销售方式以及市场成熟度等原因经常出现滞销的问题。

秋葵果中富含矿物质、蛋白质与游离氨基酸，果实内的黏性物质主要成分为多糖和果胶。科学研究发现黄秋葵多糖具有调节免疫功能、抗氧化、抗肿瘤活性、降血脂功能、降血糖活性等多种对人体有益的功能活性，对它结构和功能的研究，是提高秋葵经济价值以及菜农和企业的经济效益的关键性科学问题，已成为目前国内外研究的热点。目前，越来越多的研究报道了秋葵多糖的生物活性，然而，关于其结构的报道主要还是单糖组成和糖苷键的构成，鲜有关于其具体结构的研究报道。闵莉静等报道了秋葵果多糖的分子量为191.82kDa，其单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖及D-葡萄糖等。Shen and Lai等采用苯胺蓝分析法对秋葵果多糖的水解产物进行分析，研究发现其水解组分为0.6％的β-1,3-D-葡聚糖。Sengkhamparn等研究发现热提取秋葵多糖的单糖组成为半乳糖醛酸、鼠李糖和半乳糖，其比例为1.3:1:1.3。Lengsfeld等发现醇提秋葵粗多糖的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖组成，其比例为2.68:0.44:0.56:0.53。

目前，对秋葵多糖的研究主要集中在秋葵多糖的提取、纯化、鉴定及其生理功能的研究方面。但是较寡糖而言，多糖有其自身的不足，如溶解性较寡糖差，表现出的生理活性也较寡糖弱等。因此，为更加深入研究秋葵的生物活性，需要完善秋葵多糖的降解技术。酶作为一种特殊的催化剂，具有极强的底物特异性和产物专一性。酶法制备寡糖具有催化效率高、产物专一性好、降解过程及其产物的分子量或聚合度易控制等优势。使用酶法制备寡糖能容易地对反应进行实时监控，及时作出条件的调整，获得目标聚合度的低聚糖。而且与物理和化学方法相比，酶法制备是在较为温和的条件进行的，不需加入大量其它的化学试剂，故对环境污染相对较少。然而，目前国内外还未发现有关秋葵多糖降解酶的报道。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种金黄色节杆菌、利用该菌株制备秋葵多糖降解酶的方法以及秋葵多糖的酶法降解。

本发明利用秋葵多糖培养基从潍坊青州地区的秋葵种植土壤中分离得到一株金黄色节杆菌，命名为Arthrobacter aurescens TU，该菌株能够分泌秋葵多糖降解酶，高效降解秋葵多糖。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU，其菌种保藏信息如下：保藏编号：CCTCC NO:M 2019035；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏时间：2019年1月11日。

金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU的形态特征如下：革兰氏阳性棒状杆菌、无荚膜、无芽孢、有端生鞭毛、大小约为(0.44 μm-0.62μm)×(0.93μm-3.34μm)。该菌株的形态特征如图1所示。该菌株在秋葵多糖培养基上，35℃培养12h后，菌落直径2-3mm、圆形黄色、边缘光滑、中间隆起、湿润、易挑取，生长pH为3-13。

金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU的生理生化特征如表1所示：该菌株能够水解淀粉，氧化酶阳性，吲哚试验阳性，产生色素，不能氧化乙醇到乙酸，不能液化明胶，不产生H₂S，不能利用柠檬酸盐，能利用纤维二糖、D-葡萄糖、蔗糖、D-甘露糖，不能利用D-甘露醇、L-阿拉伯醇、古老糖、D-麦芽糖，能利用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵。

表1 Arthrobacter aurescens TU的生理生化特征

经分子生物学鉴定，金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU 的16S序列如SEQ ID NO.1所示，该菌株的16S rRNA序列与 Arthrobacter aurescens RE117的相似度为98％。

本发明进一步提供包含所述金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU的菌剂。

本发明所述菌剂可以为固体菌剂或液体菌剂。具体可以为利用金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU培养后获得的培养液或菌体制备得到。

本领域技术人员可以根据需要在所述金黄色节杆菌 (Arthrobacter aurescens)TU的培养液或菌体中加入菌种保存剂(如甘油)或其它辅料，采用常规方法制备所述菌剂。

在此基础上，本发明还提供所述金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU或所述菌剂在制备秋葵多糖降解酶或降解秋葵多糖中的应用。

本发明提供的金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU能够分泌产生具有降解秋葵多糖活性的秋葵多糖降解酶。

进一步地，本发明提供一种秋葵多糖降解酶的制备方法，为利用所述的金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU或所述的菌剂进行发酵，得到秋葵多糖降解酶。

作为优选，所述秋葵多糖降解酶的制备方法包括如下步骤：

(1)种子液的制备：将所述金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU或含有金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU的菌剂接种于种子培养基，经培养获得种子液；

(2)发酵生产：将所述种子液接种于发酵培养基，进行发酵培养；

(3)秋葵多糖降解酶的提取纯化：分离得到所述发酵培养的发酵液上清，经提取纯化获得秋葵多糖降解酶。

作为优选，上述步骤(1)和步骤(2)中，所述培养为在30～37℃， pH为6～7.5条件下进行。本发明发现，在上述温度和pH条件下的更有利于金黄色节杆菌(Arthrobacteraurescens)TU的生长和秋葵多糖降解酶的生产。

作为优选，上述步骤(3)中，所述提取纯化采用硫酸铵沉淀法和/或蛋白纯化柱纯化。

作为优选，上述步骤(3)制得的秋葵多糖降解酶可经冻干处理制备为冻干粉状。

本发明还提供一种秋葵多糖降解酶，为利用所述秋葵多糖降解酶的制备方法制备得到。

经实验分析，本发明提供的秋葵多糖降解酶的基本酶学性质如下：(1)最适反应温度为35-45℃；(2)该酶在30、35、40℃下保温300min，残余酶活仍保留在100％，当温度升高至45℃时，保温 60min，残余酶活为75％，保温180min后，残余酶活为30％左右，表明该酶具有较好的热稳定性；(3)最适反应pH为7，在pH 6-8 时稳定性较好，在中性环境中酶活力较稳定；(4)Ba²⁺对该酶活性具有促进作用，Ca²⁺、Mg²⁺对该酶活性没有显著影响，Co²⁺、Zn²⁺、>3⁺、Fe³⁺、Cu²⁺和EDTA能够强烈的抑制该酶活性。

本发明提供的秋葵多糖降解酶可高效降解秋葵多糖，用于低聚糖的制备，克服现有酸解、氧化降解、物理降解等多糖降解方法存在的缺陷。

本发明的有益效果在于：本发明提供了能够高效分泌秋葵多糖降解酶的金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU，该菌株可用于制备秋葵多糖降解酶。本发明提供的秋葵多糖降解酶具有较高的秋葵多糖降解活性，且具有较高的热稳定性和酸碱稳定性以及较广的温度和pH适应范围，可在实践中用于降解秋葵多糖制备秋葵低聚糖，与物理或化学降解方法相比，本发明提供的酶法制备过程简单、产物得率高、质量稳定、在制备过程中活性基团不受破坏，为寡糖的活性研究和开发提供保证。金黄色节杆菌(Arthrobacteraurescens) TU和秋葵多糖降解酶的发现为酶法降解秋葵多糖提供了高效的资源，为秋葵的高值化利用提供了有利的技术手段。

附图说明

图1为本发明实施例1中金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens) TU的电镜观察照片。

图2为本发明实施例1中金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens) TU在秋葵多糖固体培养基上形成的透明圈。

图3为本发明实施例4中温度对秋葵多糖降解酶的酶活力的影响分析结果。

图4为本发明实施例4中秋葵多糖降解酶的热稳定性的分析结果，其中，30℃(◆)，35℃(■)，40℃(▲)。

图5为本发明实施例4中pH对秋葵多糖降解酶的酶活力的影响分析结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例采用的各种培养基配方如下：

营养琼脂培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，自来水1000mL，pH7.6。

秋葵多糖培养基的配方如下：琼脂15g，秋葵多糖3g，牛肉膏1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，氯化钠1.5g，氯化铵2g，硫酸亚铁0.01 g，自来水1000mL，pH 7.0。

发酵培养基：秋葵多糖3g，牛肉膏1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁 0.5g，氯化钠1.5g，氯化铵2g，硫酸亚铁0.01g，自来水1000mL， pH 7.0。

以下实施例中，秋葵多糖降解酶的酶活定义如下：在40℃，pH 7.0的条件下每分钟降解秋葵多糖产生1μmol还原糖(以鼠李糖计) 所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

实施例1金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU的形态、生理生化特征以及分子生物学鉴定

利用秋葵多糖培养基从潍坊青州地区的秋葵种植土壤中分离得到一株金黄色节杆菌，命名为Arthrobacter aurescens TU，将金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU进行菌种保藏，菌种保藏信息如下：保藏编号：CCTCC NO:M 2019035；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏时间：2019年 1月11日。

金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU的形态、生理生化特征以及分子生物学鉴定结果如下：

1、采用常规的菌种鉴定方法，对金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU的形态特征、生理生化特征进行鉴定，具体结果如下：该菌株为革兰氏阳性棒状杆菌、无荚膜、无芽孢、无鞭毛、大小约为 (0.44μm-0.62μm)×(0.93μm-3.34μm)，电镜观察结果如图1所示。该菌株在秋葵多糖培养基上35℃培养12h后，菌落直径2-3mm、圆形黄色、边缘光滑、中间隆起、湿润、易挑取。

2、该菌株在秋葵多糖培养基上35℃培养12h后，在培养后的平板滴加碘液，能产生明显的秋葵多糖降解透明圈(如图2所示)。该菌株能水解淀粉，氧化酶阳性，不能氧化乙醇到乙酸，不产生H₂S，产生色素，不能利用柠檬酸盐，吲哚试验阳性，能利用纤维二糖、D->

3、菌株的分子生物学鉴定

(1)PCR扩增和序列分析：采用chelex-100基因组提取该菌株的 DNA。以基因组DNA为模板，采用如下引物对进行16S rDNA的扩增：正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCMTGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反应体系为50μl；反应程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。

PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生物工程有限公司完成。将测序得到的16SrDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)在Genbank中进行同源性比较，该菌株16S rRNA序列与Arthrobacter aurescens RE117的相似度为98％。

实施例2金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU的生长特性分析

(1)种子液的制备：将保存在秋葵多糖培养基上的金黄色节杆菌(Arthrobacteraurescens)TU接种到发酵培养基中，转速150r/min， 30℃培养48h。

(2)温度对菌株生长的影响：将种子液以5％的接种量接种于发酵培养基，pH 7.0，转速150r/min，分别在不同温度下培养，测定细胞浓度。结果表明，该菌在10-55℃温度范围内可以生长，最适生长温度为35℃。

(3)pH对菌株生长的影响：发酵培养基灭菌后采用2M盐酸和1 M氢氧化钠调节培养基的pH，使灭菌后的发酵培养基的pH分别为2-14 之间，将种子液以5％的接种量接种于发酵培养基，在35℃培养24h，转速150r/min，测定细胞浓度。结果表明，该菌在pH 3-13的范围内可以生长，最适生长pH为7。

实施例3金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU生产秋葵多糖降解酶的方法

本实施例提供一种秋葵多糖降解酶的制备方法，为利用金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU发酵制备，具体如下：

(1)种子液的制备：将保存在秋葵多糖培养基上的金黄色节杆菌(Arthrobacteraurescens)TU接种到发酵培养基中，转速130r/min，30℃培养24h，得种子液；

(2)发酵生产秋葵多糖降解酶：将步骤(1)得到的种子液按6％的接种量接种到发酵培养基中，130r/min，30℃培养48h；

(3)秋葵多糖降解酶的提取纯化：将步骤(2)得到的发酵液以 10000r/min离心10min，取上清液；在上清液中加入45％的硫酸铵，4℃过夜，10000r/min离心，用等体积的蒸馏水将沉淀复溶，得到秋葵多糖降解酶的粗酶液。

经检测，经48h发酵，金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)TU 的发酵液中的秋葵多糖降解酶的酶活力达到0.32U/ml，表明该菌株具有较高的秋葵多糖降解酶分泌能力。制备的发酵液中的蛋白含量为 0.21mg/ml，粗酶液中秋葵多糖降解酶的相对酶活力为1.52U/mg，表明该菌株分泌的秋葵多糖降解酶具有较高的秋葵多糖降解活性。

实施例4秋葵多糖降解酶的酶学性质分析

本实施例中，秋葵多糖降解酶酶活性的测定方法如下：以秋葵多糖为底物(反应液中秋葵多糖的浓度为2‰)，加入秋葵多糖降解酶至反应体系中浓度为2.5U/ml，35℃，pH为7的条件下，反应1小时，采用3，5-二硝基水杨酸法测定反应结束后体系中的还原糖量。

1、秋葵多糖降解酶的最适温度分析

将实施例3制备得到的秋葵多糖降解酶粗酶液分别在25℃、30℃、 35℃、40℃、45℃、50℃条件下测定酶活力，结果如图3所示，秋葵多糖降解酶在35-45℃时酶活较高，该酶的最适反应温度是35-45℃。

2、秋葵多糖降解酶的热稳定性分析

将实施例3制备得到的秋葵多糖降解酶粗酶液分别在30℃、35℃、 40℃下保温300min，残余酶活仍保留在100％；当温度升高至45℃时，保温60min，残余酶活为75％，保温180min后，残余酶活为30％左右 (如图4所示)，可见，该酶具有较高的热稳定性。

3、秋葵多糖降解酶的最适pH分析

将实施例3制备得到的秋葵多糖降解酶粗酶液分别在pH 4-9范围内的不同pH条件下测定酶活力，结果如图5所示，结果表明，该酶的最适反应pH为7；该酶在pH 6-8时，酶活稳定性较好，即在中性环境中酶活力较稳定。

4、秋葵多糖降解酶的抑制剂和激活剂分析

将实施例3制备得到的秋葵多糖降解酶粗酶液分别在各种金属离子和EDTA存在条件下进行酶活性测定，结果表明，Ba²⁺对该酶活性有促进作用(添加5mM的Ba²⁺，相对酶活力为112.4％)，Ca²⁺、Mg²⁺对该酶活性没有影响，Co²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺能够强烈的抑制该酶活性(添加5mM的Co²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺，其剩余酶活力分别为13.4％、1.5％、1.7％、1.3％、12.3％)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 青岛科技大学

<120> 一种金黄色节杆菌及其在制备秋葵多糖降解酶中的应用

<130> KHP191111218.5

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1435

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agggggtggc ggcgtgctta cacatgcaag tcgaacgatg aagcccagct tgctgggtgg 60

attagtggcg aacgggtgag taacacgtga gtaacctgcc cccgactctg ggataagccc 120

gggaaactgg gtctaatacc ggatatgacc tcgcaccgca tggtgcgggg tggaaagatt 180

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ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgcg 900

gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatgtgcca gaccgcctca 960

gagatggggt ttcccttcgg ggctggttca caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc tcgttccatg ttgccagcac 1080

gtagtggtgg ggactcatgg gagactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg 1140

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ggttgcgata ctgtgaggtg gagctaatcc ctaaaagccg gtctcagttc ggattggggt 1260

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aagccgatgg cctaaccacc ttgtgtgggg ggagtcgtcg aaggtggaag gcgga 1435

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cmtgctcag 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acggctacct tgttacgact t 21