一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法

摘要

本发明公开了一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法，涉及动物生物制品领域。本发明提供六基因缺失的猪伪狂犬病毒的保藏编号为CGMCC No：16290。该六基因缺失的猪伪狂犬病毒缺失六个基因，致病性被去除，其免疫原性被有效保留，使用该猪伪狂犬病毒制备的疫苗，可诱导机体产生更高级剂量的干扰素，在紧急免疫接种方面具有更好的免疫效果。

说明书

技术领域

本发明涉及猪伪狂犬病疫苗领域，具体而言，涉及一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又称奥耶斯基氏病(Aujeszky's disease,AD)，是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)所引起的猪、牛、羊等多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。猪是该病的天然宿主、主要储存宿主和传染源，无论是新生仔猪、育肥猪，还是成年种猪，都受到PR的威胁。其表现症状为：2周龄内仔猪感染后死亡率很高，可达100％，可出现腹泻、呕吐、共济失调、角弓反张、四肢泳动等神经症状，最后麻痹、衰竭死亡；断奶仔猪也能引起死亡，但主要表现为呼吸系统症状，也有部分猪出现神经症状、腹泻、呕吐等，耐过的仔猪往往发育不良，成为僵猪；育肥猪感染后则大多数伴有体温升高，呼吸困难，偶有神经症状，一般不发生死亡；成年猪感染后不发病或仅表现为体温升高等轻微症状，呈隐形感染，耐过后主要表现生长发育迟缓，饲料报酬降低等，并可长期带毒或排毒，成为最危险的传染源；妊娠母猪感染后会导致流产、产死胎、木乃伊胎等；该病还可引起种猪不育、公猪睾丸肿胀、母猪返情、屡配不孕等。

伪狂犬病毒只有一个血清型，但不同毒株在毒力和生物学特征等方面存在差异。疫苗接种是有效防制猪伪狂犬病最经济、有效的方法。但现有的猪伪狂犬病疫苗的免疫效果并不理想。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒，该猪伪狂犬病毒是经人工改造后得到的，其缺失六个基因，致病性被去除，其免疫原性被有效保留，使用该猪伪狂犬病毒制备的疫苗，可诱导机体产生更高级剂量的干扰素，在紧急免疫接种方面具有更好的免疫效果。

本发明的另一目的在于提供上述猪伪狂犬病毒的应用。

本发明的另一目的在于提供一种猪伪狂犬病疫苗，该疫苗由上述六基因缺失的猪伪狂犬病毒制成，其具有较好的免疫效果。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述猪伪狂犬病疫苗的方法。通过该方法制得的猪伪狂犬病疫苗，具有较好的免疫效果。

本发明是这样实现的：

2011年前后在全国范围了出现了新的猪伪狂犬病疫情，主要表现为突发性大面积种猪流产，育肥猪致死性感染，猪群gE抗体阳性率突然升高，部分猪场gE抗体阳性率高达100％。疫情爆发的不同地区，免疫状况不同而呈现出不同的临床表现。免疫状况较好的猪场，大多无明显临床症状，但猪群gE阳性率突然升高；免疫状况较差的猪场，主要表现为种猪的大面积流产、仔猪腹泻、育肥猪呼吸道症状与急性死亡。新疫情爆发以后全国多个实验室分离到新的猪伪狂犬病毒流行毒株，经过致病力实验、免疫保护实验和分子流行病学等研究，一致认为新流行的猪伪狂犬毒株在主要毒力基因gE、gI基因，以及与免疫保护相关的基因gB、gC、gD上存在多个位点的变异。我国不同地区分离的新流行毒株，与目前广泛使用的猪伪狂犬病活疫苗Bartha K61毒株位于不同的基因亚型，动物试验与中和抗体检测均证实，Bartha K61毒株对我国当前流行的猪伪狂犬病毒保护效果较弱，本发明使用新分离的变异毒株构建了TK、gE、gI、11K、28K和gG等6个基因缺失的伪狂犬病活疫苗，与市场上使用的TK/gE/gI、gE/gI基因确实疫苗相比较，该疫苗能够诱导机体产生更高级剂量的干扰素，在紧急免疫接种方面具有更好的效果。使用流行毒株构建的基因缺失疫苗能够为仔猪提供100％免疫保护。

基于此，一方面，本发明提供了一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒，该猪伪狂犬病毒缺失如下基因：TK、gE、gI、11K、28K和gG。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，其保藏编号为CGMCC No：16290。

本发明提供的猪伪狂犬病毒是在伪狂犬病毒PRV-FJ株的基础上缺失了TK、gE、gI、11K、28K和gG六个基因，经过基因编辑后得到本发明六基因缺失的猪伪狂犬病毒。

该毒株于2018年08月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类学命名：猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)；保藏编号：CGMCC NO.16290。

将上述6基因缺失猪伪狂犬病毒按照10⁸TCID₅₀/只的剂量肌肉注射小鼠和家兔均不引起动物发病和死亡。使用5×10⁸TCID₅₀病毒液滴鼻和肌肉注射1日龄仔猪，不引起1日龄仔猪发病，该六基因缺失猪伪狂犬病毒毒株不具有致病性。此外，采用该六基因缺失猪伪狂犬病毒毒株制成的疫苗，经免疫原性试验验证，使用由疫苗后，可诱导机体产生更高级剂量的干扰素，gE抗体检测结果为阴性，gB抗体呈阳性，中和抗体值得到提高。

另一方面，本发明提供了上述六基因缺失的猪伪狂犬病毒在制备伪狂犬病疫苗中的应用。

再一方面，本发明提供了一种猪伪狂犬病疫苗，其包括如上所述的六基因缺失的伪狂犬病毒以及稳定剂。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述稳定剂包括：低聚糖、氨基酸、明胶和蛋白酶解物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述低聚糖为蔗糖和海藻糖的组合。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，氨基酸为谷氨酸钠。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，蛋白酶解物为水解乳蛋白。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，按质量体积比计，所述稳定剂含有：5％-10％蔗糖(即100ml稳定剂中含有5-10g的蔗糖，后文同此)、1％-5％海藻糖、1％-5％谷氨酸钠以及2％-10％水解乳蛋白，0.5％-1％的明胶，余量为水。

另一方面，本发明提供了一种如上所述的猪伪狂犬病疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

步骤(a)：将上述的六基因缺失的猪伪狂犬病毒接种适宜细胞，收获病毒液；

步骤(b)：将收获的病毒液与稳定剂混合。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述制备方法还包括步骤(c)：将病毒液与稳定剂的混合溶液经真空冷冻干燥制成成品的猪伪狂犬病疫苗。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述稳定剂包括：低聚糖、氨基酸、明胶和蛋白酶解物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述低聚糖为蔗糖和海藻糖的组合。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，氨基酸为谷氨酸钠。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，蛋白酶解物为水解乳蛋白。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，按质量百分比计，所述稳定剂含有：5％-10％蔗糖、1％-5％海藻糖、1％-5％谷氨酸钠以及2％-10％水解乳蛋白，0.5％～1％的明胶，余量为水。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(a)中，所述病毒液与稳定剂按照1：1-1：10的比例混合。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述适宜细胞为BHK21细胞、ST细胞、293T细胞、PK15细胞、Vero细胞或MDBK细胞，优选为BHK21细胞。

采用本发发明提供的备方法，可以制得猪伪狂犬病疫苗，该疫苗含有上述的六基因缺失的猪伪狂犬病毒，其致病性被去除，其免疫原性被有效保留，使用该疫苗具有较好的免疫效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为免疫后猪α干扰素检测结果。

图2为免疫后28日gB/gE和中和抗体检测结果，注：gB/gE抗体检测，S/N值小于0.6为阳性，大于0.7为阴性，0.6至0.7为可疑。

图3为攻毒保护试验体温曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

人工改造伪狂犬病毒

1、毒株

PRV-FJ株，由畜禽传染病四川省重点实验室从2015年福建猪伪狂犬发病猪病料中分离获得；发病猪主要表现为体温升高，食欲不佳，打喷嚏等症状。PRV-FJ株以10⁷TCID₅₀/头的剂量感染28日龄断奶仔猪，无神经症状，攻毒后7天全部死亡。

ST细胞与293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM培养液培养(Gibco公司)。

2、重组载体构建

人工合成SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，然后将SEQ ID NO.1定向克隆到pEGFP-C1载体的Ase1酶切位点处，将其命名为pEGFP-gI，将SEQ ID NO.2定向克到pEGFP-gI的Mlu1酶切位点处，将其命名为pEGFP-gI28K。将SEQ ID NO.3定向克隆到pUC57载体的EcoR1和HindIII酶切位点之间，将其命名为pUC-TK。

3、基因编辑载体构建

使用表1引物按照LentiCRISPR v2载体(Addgene公司)说明书方法构建TK、gE、gG基因编辑的载体，分别命名为载体psgRNA-TK、psgRNA-gE、psgRNA-gGA和psgRNA-gGB。

gRNA只是将病毒核酸切割开，TK对应的gRNA将TK切割开以后与pUC-TK发生重组，从而缺失TK基因部分序列，gE gRNA切割开病毒基因组以后与pEGFP-gI28K发生重组，从而缺失gI、gE、11K、28K基因。psgRNA-gGA和psgRNA-gGB两个联合起来切割掉gG的一个片段从而缺失gG基因。

伪狂犬病毒中TK和gG单独在某个位置，而gI、gE、11K和28K四个基因相邻，因此使用一个gRNA和相应的同源序列可以同时缺失4个基因。

表1 gRNA构建引物信息

4、重组病毒构建

按照常规方法提取PRV-FJ株基因组DNA；将PRV-FJ基因组DNA(3μg)、pUC-TK质粒(5μg)和psgRNA-TK质粒(5μg)混合后参照Lipofectamine 3000(Thermo fisher scientific)说明书转染生长状态良好的293T细胞，转染后37℃培养至出现细胞病变。取病毒上清接种BHK21细胞，挑选单个病毒嗜斑。取挑选的病毒嗜斑接种BHK21细胞，收获病毒液，按照常规方法提取病毒DNA，使用引物TKF：CATCCTCCGGATCTACCTCGACGGC和TKR：CACACCCCCATCTCCGACGTGAAGG参照Lyophilized HS Taq PCR Master Mix(TAKARA)试剂盒说明书进行PCR扩增，选择扩增片段约为680bp的样品进行序列测定。将序列测定后纯化病毒rPRV-FJ-delTK。

按照常规方法提取rPRV-FJ-delTK基因组，取提取的基因组DNA(3μg)、pEGFP-gI28K质粒(5μg)和psgRNA-gE参照Lipofectamine 3000(Thermo fisher scientific)说明书转染生长状态良好的293T细胞，转染后37℃培养至出现细胞病变。取病毒上清接种ST细胞，挑取绿色荧光嗜斑，进行三轮嗜斑纯化，将纯化病毒命名为rPRV-FJ-del5gene-EGFP。

将pCDNA3.1-CRE载体参照Lipofectamine 3000(Thermo fisher scientific)说明书转染生长良好的293T细胞，转染后24小时接种rPRV-FJ-del5gene-EGFP病毒，出现细胞病变后取细胞上清接种ST细胞，挑取无荧光嗜斑，进行三轮嗜斑纯化，将纯化病毒命名为rPRV-TIE18株。

取质粒psgRNA-gGA(2μg)和psgRNA-gGB(2μg)转染生长良好的293T细胞，转染后37℃培养，24小时接种rPRV-TIE18株，继续37℃培养至出现细胞病变。收集病毒液上清进行嗜斑克隆，挑选单嗜斑接种BHK21细胞，收获病毒上清。按照常规方法提取病毒DNA，然后使用gGup：GCACCTGATCGACCTCATCC和gG-Down：AAGATGGACACCCGGTGAGA参照Lyophilized HS TaqPCR Master Mix(TAKARA)试剂盒说明书进行PCR扩增，选择扩增片段低于1860bp的样品进行序列测定。将序列测定后缺失了SEQ ID NO.4的病毒样品命名为PRV-TIE18G。

5、重组病毒的保存

将鉴定后的PRV-TIE18G病毒按照常规方法接种BHK21细胞，培养至出现CPE后收获病毒上清，分装后-80℃保存，记为F0代。该毒株于2018年08月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类学命名：猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)；保藏编号：CGMCC NO.16290。

实施例2

PRV-TIE18G细胞适应性与纯净性检验

取保存的PRV-TIE18G病毒，常规方法接种BHK21细胞，培养至出现CPE后收获病毒上清。将PRV-TIE18G病毒连续传代至F5。以BHK21细胞进行病毒TCID50测定。按照《中国兽药典》(2015版)附录记载的方法对不同代次病毒进行无菌、支原体、外源病毒检验。

表2 PRV-TIE18G细胞适应性与纯净性检验

病毒代次F0F1F2F3F4F5病毒含量(TCID₅₀/ml)10^7.610^8.2510^8.010^8.410^8.410^8.16无菌检验阴性阴性阴性阴性阴性阴性支原体检验阴性阴性阴性阴性阴性阴性外源病毒检验无污染无污染无污染无污染无污染无污染

PRV-TIE18G病毒F0代病毒含量为10^7.6TCID₅₀/ml；连续传代至F5代，F1代至F5代的病毒含量均在10^8.0TCID₅₀/ml以上。无菌检验、支原体检验结果均为阴性，外源病毒检验结果显示均无外源病毒污染。

实施例3

PRV-TIE18G的致病性试验

1～3日龄PRV抗体阴性仔猪35头，随机分为6组分别标记为A、B、C、D、E、F、G组，选用PRV-TIE18G病毒F1代，按照下表(表3)进行攻毒试验。攻毒后连续观察14日。

表3 PRV-TIE18G和PRV-FJ对初生仔猪的致病性试验

组别攻毒毒株毒种代次攻毒剂量攻毒方式备注APRV-TIE18GF110⁸TICD₅₀滴鼻接种BPRV-TIE18GF110⁷TICD₅₀滴鼻接种CPRV-TIE18GF110⁸TICD₅₀肌肉注射DPRV-TIE18GF110⁷TICD₅₀肌肉注射EDMEM培养液2.0ml滴鼻+肌肉注射空白对照FPRV-FJF610⁷TICD₅₀滴鼻GPRV-FJF610⁷TICD₅₀肌肉注射

攻毒后每日观察并测定仔猪体温，观察是否出现伪狂犬病临床症状和死亡。结果如下表3。结果显示PRV-TIE18G滴鼻和肌肉注射攻毒组均未出现体温升高和其他临床症状，而滴鼻和肌肉注射攻毒PRV-FJ的仔猪在攻毒后第二天有仔猪出现体温升高(见图3)、打喷嚏等症状，攻毒后第3天仔猪死亡，在攻毒后第4天全部死亡。空白对照组未出现任何临床症状，试验整个过程中均正常。

表4 PRV-TIE18G和PRV-FJ对初生仔猪的致病性试验结果统计

组别发热呼吸道症状神经症状死亡数量A0/50/50/50/5B0/50/50/50/5C0/50/50/50/5D0/50/50/50/5E0/50/50/50/5F5/55/50/55/5G5/54/50/55/5

实施例4

猪伪狂犬病活疫苗PRV-TIE18G的制备方法如下：

常规传代BHK21细胞，按照《中国兽药典》2015版本记载方法对传代BHK21细胞进行无菌检验、霉菌检验、支原体检验和外源病毒检验。

使用检验合格的BHK21细胞按照常规方法扩大培养至15L转瓶，待细胞长满单层后将培养基吸出，按照0.5％的比例接种PRV-TIE18G种毒，37℃吸附30分钟，然后每个转瓶添加1000ml DMEM无血清培养液。

37℃继续培养，每隔12小时观察一次。观察到细胞病变达到90％以上时，收获转瓶内病毒液。使用10um滤芯进行过滤出去细胞碎片后2～8℃保存。按照《中国兽药典》2015版记载的方法测定病毒液的TCID50。

按照蔗糖5％、海藻糖2％、水解乳蛋白6％、谷氨酸钠3％、明胶0.85％的比例配制冻干保护剂。115℃高压灭菌30分钟后室温保存备用。将冻干保护剂和病毒液按照1：1的比例混合后定量分装至10ml西林瓶，加盖后置于冻干机内，经预冷、干燥过程冻干疫苗。冻干压盖并置于2～8℃保存。

取冻干后的疫苗按照《中国兽药典》2015版进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验和病毒含量测定。

实施例5

猪伪狂犬病活疫苗PRV-TIE18G的免疫原性

选用3-4周龄猪伪狂犬病毒抗原抗体阴性仔猪20头，随机分为A、B、C、D四组，每组5头。按下表(表5)进行肌肉注射免疫接种，免疫后1-7日，每日采血进行猪α干扰素检测；免疫后28日采血分离血清进行PRV gB(IDEXX)、gE(IDEXX)、中和抗体(PRV-FJ中和)检测；免后28日采血后，每头试验猪滴鼻接种PRV-FJ(10⁷TICD₅₀/头)进行攻毒保护试验。

表5 PRV-TIE18G免疫原性试验分组

组别毒株代次免疫剂量攻毒毒株攻毒剂量APRV-TIE18GF110^5.0TICD₅₀PRV-FJ10⁷TICD₅₀BPRV-TIE18GF510^5.0TICD₅₀PRV-FJ10⁷TICD₅₀CBartha-K6110^5.5TICD₅₀PRV-FJ10⁷TICD₅₀DDMEM2.0mlPRV-FJ10⁷TICD₅₀

2个PRV-TIE18G免疫组，免后第2天至第6天在血液中检测到猪α干扰素；Bartha-K61与对照组接种前至接种后第7天，均未在血液中检测到猪α干扰素(图1)。免后28日，2个PRV-TIE18G免疫组与Bartha-K61免疫组的gB抗体均5/5阳性；gE抗体均5/5阴性；对照组gB、gE均5/5阴性。2个PRV-TIE18G免疫组的对PRV-FJ的中和抗体水平比Bartha-K61免疫组更高，对照组无中和抗体(图2)。

免疫后28日进行攻毒保护试验，2个PRV-TIE18G免疫组均未出现发热症状，精神、食欲正常，连续观察14日全部存活；Bartha-K61免疫组1/5出现发热与食欲减退，连续观察14日存活4头，死亡1头；对照组全部出现发热症状，均出现精神不振、食欲减退，观察14日死亡3头。

表6 PRV-TIE18G免疫原性试验攻毒保护试验结果统计

组别发热精神食欲不振神经症状死亡数量结果A0/50/50/50/55/5保护B0/50/50/50/55/5保护C1/51/50/51/54/5保护，1/5死亡D5/55/50/55/55/5发病，5/5死亡

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川华神兽用生物制品有限公司

<120> 一种六基因缺失的猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病疫苗以及制备方法

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<213> 人工序列

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ggcgtgaaca tcctcaccga cttcatggtg gcgctccccg aggggcaaga gtgcccgttc 60

gcccgcgtgg accagcaccg cacgtacaag ttcggcgcgt gctggagcga cgacagcttc 120

aagcggggcg tggacgtgat gcgattcctg acgccgttct accagcagcc cccgcaccgg 180

gaggtggtga actactggta ccgcaagaac ggccggacgc tcccgcgggc ctacgccgcc 240

gccacgccgt acgccatcga ccccgcgcgg ccctcggcgg gctcgccgag gcccaggccc 300

cggccccggc ccaggccccg gccgaagccc gagcccgccc cggcgacgcc cgcgcccccc 360

ggccgcctgc ccgagccggc gacgcgggac cacgccgccg gggggcgccc cacgccgcga 420

cccccgaggc ccgagacgcc gcaccgcccc ttcgccccgc cggccgtcgt gcccagcggg 480

tggccgcagc ccgcggagcc gttcccgccc cggaccaccg ccgcgccggg cgtctcgcgc 540

caccgctcgg tgatcgtcgg cacgggcacc gcgatgggcg cgctcctggt gggcgtgtgc 600

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<213> 人工序列

<400> 4

tcgtggtccg caccgtcgtg gccagagagg cccctcggga gctctgctac ggccaccccg 60

tccacgacga ccggcggccc gtcgggcccg cgaccgacgc ccagcccgtg aacccgctcg 120

cccccgccaa cgccaccggg acggactact ctcgcggctg cgagatgcgc ctcctggatc 180

cgcctctcga cgtatcgtcc cgctcctcgg accccgtcaa cgtgaccgtc gcctggttct 240

ttgacggcgg ccactgcaag gtgcccctcg tccaccgcga gtactacggc tgccccgggg 300

acgccatgcc ctccgtcgag acgtgcaccg gcgggtactc gtacacccgc acgcgcatcg 360

acaccctgat ggagtacgcc ctcgtgaacg ccagcctcgt gctgcagccc gggctgtacg 420

acgccggcct gtacatcgtc gtgctcgtct ttggcgacga cgcctacctc ggcaccgtct 480

ccctgtcggt ggaggccaac ctggactacc cctgcggcat gaagcacggg ctcacgatca 540

cccgccccgg ggccaccctc ccacccatcg cccccacggc cggcgaccac cagcgctggc 600

gcgggtgctt cccctcga 618