从甘草中提取甘草甜素、甘草黄酮及甘草多糖的方法

摘要

从甘草中提取甘草甜素、甘草黄酮及甘草多糖的方法，所述从甘草中提取甘草甜素的方法，包括以下步骤：（1）将干燥的甘草根或根茎粉碎，投入渗漉器中，压紧，加水，在室温下，渗漉提取，得渗漉液；（2）超滤，收集超滤膜透过液；（3）上阴离子交换树脂柱，用洗脱剂洗脱，洗脱液减压浓缩，调节pH值至酸性，在室温下，搅拌析晶，离心过滤，冰水洗晶，干燥，得甘草甜素。本发明方法还公开了提取甘草黄酮及甘草多糖的方法。本发明方法所得甘草甜素、甘草黄酮和甘草多糖的纯度和收率高；本发明方法可提取多种活性成分，工艺过程可操作性强，成本低，不使用有毒有害化工溶剂、绿色环保，甘草资源高效综合利用，适宜于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从甘草中提取活性成分的方法，具体涉及一种从甘草中提取甘草甜素、甘草黄酮及甘草多糖的方法。

背景技术

甘草为多年生草本植物，属豆科，是一种药食同源的宝贵资源。甘草味甘甜，性平和，入心、脾、肺、胃四经。生用偏凉，可泻火解毒、缓急止痛；炙用偏温，能散表寒、补中益气。此外，甘草还善于调和药性，解百药之毒。甘草中的生理活性成分主要有甘草甜素（三萜类化合物，即甘草酸）、甘草黄酮类化合物及甘草多糖类化合物。甘草甜素是甘草甜味的主要成分，其甜度为蔗糖的250倍，是一种天然的甜味剂；药理研究表明，甘草甜素具有解毒、消炎、镇痛、抗肿瘤的作用，近年来，还用于治疗病毒性肝炎、癌症及艾滋病等。甘草黄酮具有抑菌、抗肿瘤、抗诱变、抗病毒、抗氧化等功能。甘草多糖主要是葡萄糖及葡萄糖醛酸组成的有机大分子多糖，在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等方面具有重要的作用。其中，甘草黄酮和甘草多糖在药膳中应用广泛。

CN1359905A公开了一种从甘草中系统分离、提取甘草黄酮、甘草酸、甘草多糖生产方法，是以甘草粉为原料，通过第一步用乙醇提取甘草黄酮，第二步将第一步的残渣用碱性清水提取甘草酸，第三步用第二步所得的残渣以清水煮沸提取后，用醇析法制取甘草多糖。但是，该方法提取三种成分需要三种不同的提取方式，过于复杂，不适宜工业化生产。

CN104479033A公开了一种从甘草中综合分离提取甘草酸、甘草黄酮、甘草多糖的方法，是以甘草为原料，通过碱性清水浸泡、酸化沉淀制得甘草酸，上清液膜浓缩制得甘草多糖，甘草草渣用醇浸泡、膜浓缩、大孔树脂吸附纯化等步骤制得甘草黄酮。但是，该方法需要两种不同的提取方式，需要使用大量的碱和酸，对环境的污染较大，且制得的三种成分都是粗制品。

CN1803789A公开了一种提取分离甘草酸、甘草黄酮和甘草多糖的方法，是以甘草粉为原料，通过水或有机溶剂提取、浓缩、有机溶剂萃取，萃取液减压回收，得甘草黄酮，萃余相醇沉，得甘草多糖，上清液调酸，得甘草酸。但是，该方法使用了大量有毒有害、易燃易爆的化工溶剂，且醇沉使用的大量高度乙醇无法回收利用，制得的三种成分同样都是粗制品，不适宜工业化生产。

CN103285074A公开了一种分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，是以含有甘草提取物的提取液为原料，通过有机试剂反复萃取、调节不同的pH值范围等步骤，得甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖。但是，该方法使用了大量有毒有害、易燃易爆的化工溶剂，且通过pH值调节萃取过程中的物质分配系数的灵敏度并不高，因此，所得不同成分的收率和含量都偏低。

CN107118252A公开了一种甘草酸的制备方法，是以甘草酸粗粉为原料，通过乙醇提取、氨化、析晶、反复阳离子交换、反复酸析等步骤得到甘草酸。但是，该方法所得甘草酸的收率和含量都很低。

CN102453075A公开了一种甘草酸的分离纯化工艺，是以甘草制片为原料，通过水煮提取、酸析、乙醇提取、大孔吸附树脂层析、离子交换树脂层析等步骤得到甘草酸。但是，该方法仅分离了甘草中一种成分——甘草酸，未对甘草中其它的有效成分做分离，没有实现资源的综合利用。

CN1210865A公开了甘草甜素精制方法，是以甘草或甘草粗提取为原料，通过稀氨水提取、酸析、醇提、碱析沉降、溶解、调节pH值、大孔吸附、洗脱、浓缩、乙醇结晶等步骤，得甘草酸。但是，该方法所得的甘草酸含量和收率都偏低。

CN1207910A公开了甘草总黄酮提取方法，是以甘草或甘草粗提取为原料，通过稀氨水提取、酸化沉淀、乙醇提取、氨化、大孔吸附树脂吸附、洗脱、中和、浓缩、酸析、有机溶剂提取等步骤，得甘草总黄酮。但是，该方法大量使用了腐蚀性强酸，以及易燃易爆、有毒有害的化工溶剂，环境污染大，不符合绿色、安全生产的要求；此外，该方法所得甘草总黄酮的含量和收率均不明确。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种可提取多种活性成分，且所得的各活性成分产品的纯度及收率高，工艺过程可操作性强，成本低，不使用有毒有害化工溶剂、绿色环保，甘草资源高效综合利用，适宜于工业化生产的从甘草中提取甘草甜素、甘草黄酮及甘草多糖的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：从甘草中提取甘草甜素的方法，包括以下步骤：

（1）渗漉提取：将干燥的甘草根或根茎粉碎，投入渗漉器中，压紧，加水，在室温下，渗漉提取，得渗漉液；

（2）超滤：将步骤（1）所得渗漉液用超滤膜超滤，收集超滤膜透过液；

（3）离子交换树脂提取：将步骤（2）所得超滤膜透过液上阴离子交换树脂柱，用洗脱剂洗脱，洗脱液减压浓缩，调节pH值至酸性，在室温下，搅拌析晶，离心过滤，冰水洗晶，干燥，得甘草甜素。

优选地，步骤（1）中，所述干燥的甘草根或根茎中甘草甜素（折算成甘草酸）的质量含量为5～10%，甘草黄酮的质量含量为4～8%，甘草多糖的质量含量为8～12%，含水量≤5%。

优选地，步骤（1）中，所述粉碎至20～40目。

优选地，步骤（1）中，所述加水的量为干燥的甘草根或根茎质量的6～10倍。

优选地，步骤（1）中，渗漉的流速为0.1～0.5BV/h。使用渗漉提取的目的是提高提取率，减少杂质的浸出，并减少水的用量。若粉碎的目数过小、水的用量过少或渗漉的流速过快，都将造成提取不充分，收率偏低；若粉碎的目数过大、水的用量过多或渗漉的流速过慢，都将造成能源和物料的浪费。

优选地，步骤（2）中，所述超滤膜的截留分子量为2000～4000Da。超滤的目的是去除渗漉液中含有的蛋白质、淀粉和水溶性纤维等大分子杂质。

优选地，步骤（2）中，所述超滤的压力为0.3～0.6MPa。

优选地，步骤（3）中，上柱的流速为0.5～1.0BV/h。使用阴离子交换树脂的目的是吸附渗漉液中的甘草甜素。在水溶液中，甘草甜素中的羧基（-COOH）电离失去氢离子后，形成阴离子，可与阴离子交换树脂发生离子交换，从而被树脂吸附。

优选地，步骤（3）中，所述阴离子交换树脂与干燥的甘草根或根茎的体积质量比（L/kg）为0.05～0.40:1（更优选0.1～0.3:1）。

优选地，步骤（3）中，所述阴离子交换树脂柱的高径比为4～10:1。

若上柱流速过快、离子交换树脂的用量过少或高径比过小，都将导致甘草甜素的吸附不充分，造成甘草酸的收率偏低；若上柱流速过慢、离子交换树脂的用量过多或高径比过大，都将造成物料和能源的浪费。

优选地，步骤（3）中，所述阴离子交换树脂的型号为201×7型、201×8型、202型、D201型或D202型等中的一种或几种。

优选地，步骤（3）中，所述洗脱剂的用量为2～4BV。

优选地，步骤（3）中，所述洗脱剂为稀氨水。由于氨在浓缩过程中极易挥发，因此，氨水洗脱液浓缩后，不会造成浓缩液的碱性过强，不会对甘草甜素的分子结构造成破坏。

优选地，步骤（3）中，所述稀氨水的质量浓度为0.5～2.0%。若稀氨水的质量浓度过低，则难以将甘草甜素从阴离子交换树脂柱上解吸，若稀氨水的质量浓度过高，则将造成物料的浪费。

优选地，步骤（3）中，所述减压浓缩的温度为60～75℃，真空度为-0.08～-0.09MPa，浓缩至固含量为25～40%。

优选地，步骤（3）中，调节pH值至4～6。调节pH值的目的是使离子状态的甘草甜素（铵盐）转变为分子状态。

优选地，步骤（3）中，用醋酸调节pH值。醋酸是有机弱酸，在调节pH值的过程中，不会因溶液局部pH值过低，而导致甘草甜素分子结构被破坏。

优选地，步骤（3）中，所述搅拌析晶的转速为30～90r/min，时间为12～24h。

优选地，步骤（3）中，所述冰水的温度为0～10℃。

本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：在从甘草中提取甘草甜素的同时提取甘草黄酮的方法，将步骤（3）中阴离子交换树脂柱的流出液，上大孔吸附树脂柱，先用稀碱液洗脱，再水洗至中性，最后用醇溶液洗脱，将醇溶液洗脱液减压浓缩，干燥，得甘草黄酮。使用大孔吸附树脂的目的是吸附离子交换树脂柱流出液中的甘草黄酮。

优选地，上柱的流速为0.5～1.0BV/h。

优选地，所述大孔吸附树脂与干燥的甘草根或根茎的体积质量比（L/kg）为0.1～0.5:1（更优选0.2～0.4:1）。

优选地，所述大孔吸附树脂柱的高径比为4～10:1。

若上柱流速过快、大孔吸附树脂的用量过少或高径比过小，都将导致甘草黄酮的吸附不充分，造成甘草黄酮的收率偏低；若上柱流速过慢、大孔吸附树脂的用量过多或高径比过大，都将造成物料和能源的浪费。

优选地，所述大孔吸附树脂的型号为D101B型、D101C型、LSA-10型或LX-38型等中的一种或几种。

优选地，所述稀碱液的用量为1.5～2.5BV。稀碱液洗脱的目的是去除吸附在大孔树脂上的部分低极性的色素类杂质。

优选地，所述稀碱液的质量浓度为0.1～0.5%。

优选地，所述稀碱液为氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液。

优选地，所述稀碱液洗脱的速度为1～2BV/h。

若洗脱速度过快、稀碱液的用量过少或浓度过低，都难以达到除去杂质的目的；若洗脱速度过慢、稀碱液的用量过多或浓度过高，都有可能将目标成分甘草黄酮从大孔树脂上洗脱下来，造成甘草黄酮的收率偏低。

优选地，所述水洗的速度为1～2BV/h。水洗的目的是去除柱床中残留的碱。

优选地，所述醇溶液的用量为2～4BV。醇溶液洗脱的目的是将甘草黄酮从大孔树脂上解吸。

优选地，所述醇溶液的体积分数为65～80%。

优选地，所述醇溶液为甲醇、乙醇或异丙醇等中的一种或几种。

优选地，所述醇溶液洗脱的速度为1～2BV/h。

若醇溶液的用量过少、体积分数过小或洗脱的流速过快，都难以将甘草黄酮从大孔树脂上充分的解吸，造成甘草黄酮的收率偏低；若醇溶液的用量过多、体积分数过大或洗脱的流速过慢，都将造成能源和物料的浪费。

优选地，所述减压浓缩的温度为60～75℃，真空度为-0.08～-0.09MPa，浓缩至固含量为25～40%。

本发明更进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：在从甘草中提取甘草甜素和甘草黄酮的同时提取甘草多糖的方法，将大孔吸附树脂柱的流出液上氧化铝树脂柱，将流出液减压浓缩，干燥，得甘草多糖。使用氧化铝树脂的目的是吸附大孔吸附树脂柱流出液中除甘草多糖以外的色素、多酚等杂质。

优选地，上柱的流速为0.5～1.0BV/h。

优选地，所述氧化铝树脂与干燥的甘草根或根茎的体积质量比（L/kg）为0.1～0.5:1（更优选0.2～0.4:1）。

优选地，所述氧化铝树脂柱的高径比为4～10:1。

若上柱流速过快、氧化铝树脂的用量过少或高径比过小，都将导致杂质的吸附不充分，造成甘草多糖的含量偏低；若上柱流速过慢、氧化铝树脂的用量过多或高径比过大，都将造成物料和能源的浪费。

优选地，所述氧化铝树脂的粒径为100～300目。

优选地，所述减压浓缩的温度为60～75℃，真空度为-0.08～-0.09MPa，浓缩至固含量为25～40%。

本发明方法中，1 BV=1个柱体积。

本发明方法的原理是：以水作为溶媒，采用渗漉法将甘草中的三种成分提取出之后，先利用阴离子交换树脂只吸附带有羧基的甘草甜素，将甘草甜素与甘草黄酮、甘草多糖分离，洗脱阴离子交换树脂，即得甘草甜素；再利用大孔吸附树脂只吸附甘草黄酮而不吸附甘草多糖的特性，将两者分离，洗脱大孔吸附树脂，即得甘草黄酮；氧化铝虽然不吸附甘草多糖，但是可以吸附色素等杂质，从而得到高纯度的甘草多糖。

本发明方法的有益效果如下：

（1）本发明方法所得甘草甜素的纯度高达99.6%，收率高达98.6%；甘草黄酮的纯度高达98.1%，收率高达96.4%；甘草多糖的纯度高达98.6%，收率高达96.4%；

（2）本发明方法可提取多种活性成分，工艺过程可操作性强，成本低，不使用有毒有害化工溶剂、绿色环保，甘草资源高效综合利用，适宜于工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的甘草（根茎）购于甘肃灵台，其中，甘草甜素（折算成甘草酸）、甘草黄酮、甘草多糖的质量含量分别为6.65%、5.72%和10.35%；本发明实施例所使用的截留分子量4000Da、3000Da、2000Da的超滤膜均购于江苏汉邦科技有限公司；本发明实施例所使用的D201型、201×8型、D202型阴离子交换树脂，D101B型、LSA-10型、LX-38型大孔吸附树脂和氧化铝树脂均购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例中，采用高效液相色谱外标法检测甘草甜素含量，采用紫外分光光度法测定甘草黄酮的含量，采用苯酚-硫酸比色法测定甘草多糖的含量。

实施例1

（1）渗漉提取：将50kg干燥的甘草根茎（含水量≤5%）粉碎至40目，投入渗漉器中，压紧，加水300kg，在室温下，以0.2 BV/h的流速渗漉提取，得渗漉液；

（2）超滤：将步骤（1）所得渗漉液用截留分子量为4000Da的超滤膜，在0.3MPa下，超滤，收集超滤膜透过液；

（3）离子交换树脂提取：将步骤（2）所得超滤膜透过液，以0.5BV/h的流速，上D201型阴离子交换树脂柱（D201型阴离子交换树脂的体积为15L，阴离子交换树脂柱的高径比为5:1），用3.0BV、质量浓度1%的稀氨水洗脱，洗脱液在65℃、-0.09MPa下，减压浓缩至固含量为30%，用醋酸调节pH值至4.0，在室温下，以转速60r/min搅拌析晶12h，离心过滤，0℃冰水洗晶，干燥，得甘草甜素3.23kg。

同时提取甘草黄酮的方法：

将步骤（3）中阴离子交换树脂柱的流出液，以1.0BV/h的流速，上D101B型大孔吸附树脂柱（D101B型大孔吸附树脂的体积为10L，大孔吸附树脂柱的高径比为6:1），先用2BV、质量浓度0.2%的氢氧化钠水溶液，以1BV/h的流速洗脱，再以1BV/h的流速水洗至中性，最后用2BV、体积分数75%的乙醇溶液，以1BV/h的流速洗脱，将乙醇溶液洗脱液在65℃、-0.08MPa下，减压浓缩至固含量为30%，干燥，得甘草黄酮2.80kg。

同时提取甘草多糖的方法：

将提取甘草黄酮时大孔吸附树脂柱的流出液，以0.5BV/h的流速，上氧化铝树脂柱（氧化铝树脂的用量为12.5L，氧化铝树脂柱的高径比为4:1，氧化铝树脂的目数为300目），将流出液在75℃、-0.08MPa下，减压浓缩至固含量为35%，干燥，得甘草多糖4.94kg。

经高效液相色谱外标法检测，本发明实施例所得甘草甜素的纯度为99.5%，甘草甜素的收率为96.7%；经紫外分光光度法检测，本发明实施例所得甘草黄酮的纯度为97.3%，甘草黄酮的收率为95.3%；经苯酚-硫酸比色法测定，本发明实施例所得甘草多糖的纯度为98.6%，甘草多糖的收率为94.1%。

实施例2

（1）渗漉提取：将100kg干燥的甘草根茎（含水量≤5%）粉碎至20目，投入渗漉器中，压紧，加水800kg，在室温下，以0.4 BV/h的流速渗漉提取，得渗漉液；

（2）超滤：将步骤（1）所得渗漉液用截留分子量为3000Da的超滤膜，在0.4MPa下，超滤，收集超滤膜透过液；

（3）离子交换树脂提取：将步骤（2）所得超滤膜透过液，以0.6BV/h的流速，上201×8型阴离子交换树脂柱（201×8型阴离子交换树脂的体积为20L，阴离子交换树脂柱的高径比为4:1），用2.5BV、质量浓度1.5%的稀氨水洗脱，洗脱液在70℃、-0.09MPa下，减压浓缩至固含量为35%，用醋酸调节pH值至5.0，在室温下，以转速45r/min搅拌析晶24h，离心过滤，5℃冰水洗晶，干燥，得甘草甜素6.58kg。

同时提取甘草黄酮的方法：

将步骤（3）中阴离子交换树脂柱的流出液，以0.5BV/h的流速，上LSA-10型大孔吸附树脂柱（LSA-10型大孔吸附树脂的体积为30L，大孔吸附树脂柱的高径比为5:1），先用2.5BV、质量浓度0.3%的氢氧化钾水溶液，以1.5BV/h的流速洗脱，再以1.5BV/h的流速水洗至中性，最后用3BV、体积分数70%的甲醇溶液，以1.5BV/h的流速洗脱，将甲醇溶液洗脱液在70℃、-0.08MPa下，减压浓缩至固含量为35%，干燥，得甘草黄酮5.62kg。

同时提取甘草多糖的方法：

将提取甘草黄酮时大孔吸附树脂柱的流出液，以0.8BV/h的流速，上氧化铝树脂柱（氧化铝树脂的用量为30L，氧化铝树脂柱的高径比为5:1，氧化铝树脂的目数为100目），将流出液在70℃、-0.09MPa下，减压浓缩至固含量为40%，干燥，得甘草多糖10.18kg。

经高效液相色谱外标法检测，本发明实施例所得甘草甜素的纯度为99.6%，甘草甜素的收率为98.6%；经紫外分光光度法检测，本发明实施例所得甘草黄酮的纯度为98.1%，甘草黄酮的收率为96.4%；经苯酚-硫酸比色法测定，本发明实施例所得甘草多糖的纯度为97.3%，甘草多糖的收率为95.7%。

实施例3

（1）渗漉提取：将200kg干燥的甘草根茎（含水量≤4%）粉碎至30目，投入渗漉器中，压紧，加水1400kg，在室温下，以0.3BV/h的流速渗漉提取，得渗漉液；

（2）超滤：将步骤（1）所得渗漉液用截留分子量为2000Da的超滤膜，在0.5MPa下，超滤，收集超滤膜透过液；

（3）离子交换树脂提取：将步骤（2）所得超滤膜透过液，以0.8BV/h的流速，上D202型阴离子交换树脂柱（D202型阴离子交换树脂的体积为50L，阴离子交换树脂柱的高径比为6:1），用2.0BV、质量浓度2%的稀氨水洗脱，洗脱液在75℃、-0.08MPa下，减压浓缩至固含量为40%，用醋酸调节pH值至4.5，在室温下，以转速90r/min搅拌析晶18h，离心过滤，10℃冰水洗晶，干燥，得甘草甜素13.06kg。

同时提取甘草黄酮的方法：

将步骤（3）中阴离子交换树脂柱的流出液，以0.8BV/h的流速，上LX-38型大孔吸附树脂柱（LX-38型大孔吸附树脂的体积为50L，大孔吸附树脂柱的高径比为7:1），先用1.5BV、质量浓度0.5%的氢氧化钠水溶液，以2BV/h的流速洗脱，再以2BV/h的流速水洗至中性，最后用4BV、体积分数65%的异丙醇溶液，以2BV/h的流速洗脱，将异丙醇溶液洗脱液在75℃、-0.09MPa下，减压浓缩至固含量为40%，干燥，得甘草黄酮11.15kg。

同时提取甘草多糖的方法：

将提取甘草黄酮时大孔吸附树脂柱的流出液，以1.0BV/h的流速，上氧化铝树脂柱（氧化铝树脂的用量为40L，氧化铝树脂柱的高径比为6:1，氧化铝树脂的目数为200目），将流出液在65℃、-0.09MPa下，减压浓缩至固含量为30%，干燥，得甘草多糖20.61kg。

经高效液相色谱外标法检测，本发明实施例所得甘草甜素的纯度为98.9%，甘草甜素的收率为97.1%；经紫外分光光度法检测，本发明实施例所得甘草黄酮的纯度为97.7%，甘草黄酮的收率为95.2%；经苯酚-硫酸比色法测定，本发明实施例所得甘草多糖的纯度为96.8%，甘草多糖的收率为96.4%。