香附薁酮用于制备抑制SIRT1基因表达治疗食管鳞状细胞癌的药物的用途

摘要

本发明公开了香附薁酮用于制备抑制SIRT1基因表达治疗食管鳞状细胞癌的药物的用途。本发明发现，香附薁酮、香附子烯‑2,5,8‑三醇为有效的SIRT1基因表达抑制剂，香附薁酮、香附子烯‑2,5,8‑三醇通过抑制食管鳞状细胞癌中SIRT1基因表达有效抑制食管鳞状细胞癌的迁移和侵袭，可以开发成治疗食管鳞状细胞癌转移的药物。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇用于制备抑制SIRT1基因表达治疗食管鳞状细胞癌的药物的用途。

背景技术

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，虽然近年来食管癌的诊疗水平不断提高，但其总生存期并没有显著改善，侵袭转移仍是食管癌预后差的重要原因之一。

广藿香烯酮、香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇是存在于莎草中的化合物，化学结构如下。

现有技术没有公开过广藿香烯酮、香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇与ESCC的关系。

发明内容

本发明的目的是提供香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇用于制备抑制SIRT1基因表达治疗食管鳞状细胞癌的药物的用途。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

香附薁酮用于制备SIRT1基因表达抑制剂的医药用途。

香附薁酮用于制备抑制食管鳞状细胞癌转移的药物的用途。

香附薁酮用于制备治疗食管鳞状细胞癌的药物的医药用途。

有益效果：

本发明发现，香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇为有效的SIRT1基因表达抑制剂，香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇通过抑制食管鳞状细胞癌中SIRT1基因表达有效抑制食管鳞状细胞癌的迁移和侵袭，可以开发成治疗食管鳞状细胞癌转移的药物。

附图说明

图1为各组癌细胞中SIRT1mRNA/GAPDH mRNA比值；

图2为各组癌细胞划痕愈合率；

图3为各组癌细胞细胞侵袭穿膜数。

具体实施方式

下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料

食管鳞状细胞癌TE-1细胞购自ATCC；胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司

广藿香烯酮、香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇自制，纯度在95％以上。

二、实验方法

1、食管鳞状细胞癌TE-1的培养

常规复苏食管鳞状细胞癌TE-1，加入含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养，置于37℃、体积分数5％CO₂培养箱中，观察细胞生长情况。培养48h后换液1次，以后每周换液2次，观察细胞生长至70％～80％融合后，以胰酶消化，以1:2传代。

2、细胞分组及给药

广藿香烯酮组：用含有5μM广藿香烯酮的完全培养基培养；

香附薁酮组：用含有5μM香附薁酮的完全培养基培养；

香附子烯-2,5,8-三醇组：用含有5μM香附子烯-2,5,8-三醇的完全培养基培养；

空白对照组：使用完全培养基培养，不额外添加药物。

3、Real-time RT-PCR方法测定药物对癌细胞中SIRT1mRNA含量的影响

取对数生长期的食管鳞状细胞癌TE-1细胞，PBS洗涤3遍，加入0.25％胰蛋白酶消化并离心，弃上清，采用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，将细胞以2×10⁵/孔的浓度接种于6孔板中，培养于37℃、体积分数5％CO₂饱和湿度培养箱中，观察细胞融合达70％左右时弃去培养液，按照上述分组及给药方法继续培养48h。

48h后，用0.25％胰酶消化、收集细胞，按RNeasy Mini Kit说明书提取总RNA，凝胶电泳鉴定其完整性，分光光度法测定其纯度和量。根据Real time PCR试剂盒说明书中的方法配置好各个样品的反应体系，在PCR仪上设置好反应程序进行PCR反应。以GAPDH为内参基因，用实时定量PCR相对定量法测定TE-1细胞中SIRT1mRNA的相对含量。

RT-PCR引物序列委托上海生工设计合成，序列如下(5’→3’)：

SIRT1上游引物：CCTGAGAATGGACCCCATCAGA

SIRT1下游引物：CACGTCCATACGACGTACACG

GAPDH上游引物：TGGGGAAGGTGAAGGTCGG

GAPDH下游引物：CTGGAAGATGGTGATGGGA

4、划痕实验检测细胞迁移能力

取对数生长期的食管鳞状细胞癌TE-1细胞，PBS洗涤3遍，加入0.25％胰蛋白酶消化并离心，弃上清，采用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，按照上述分组及给药方法于37℃、体积分数5％CO₂饱和湿度培养箱中培养48h。

培养48h后，以0.25％胰蛋白酶消化并收集细胞，采用无血清DMEM培养基制备细胞悬液，以2×10⁴个/孔的密度接种于6孔板，当细胞呈单层贴壁且接近100％融合时，使用10μl无菌移液器头在6孔板中划痕，清洗悬浮脱落细胞后，用无血清培养液，放置于37℃、5％CO₂培养箱内，分别于划痕后0和48h在倒置光学显微镜下拍照，计算其划痕愈合率，实验重复3次。划痕愈合率＝(0h划痕距离－48h后划痕距离)÷0h划痕距离×100％。

5、Transwell小室实验检测细胞侵袭能力

取对数生长期的食管鳞状细胞癌TE-1细胞，PBS洗涤3遍，加入0.25％胰蛋白酶消化并离心，弃上清，采用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，按照上述分组及给药方法于37℃、体积分数5％CO₂饱和湿度培养箱中培养48h。

培养48h后，以0.25％胰蛋白酶消化并收集细胞，采用无血清DMEM培养基制备细胞悬液，以2×10⁵/孔的密度铺于Transwell小室上层腔室。然后，将含体积分数20％胎牛血清的DMEM培养基加入Transwell小室下层腔室。培养24h后，用棉签从Transwell小室上层腔室移走非侵袭的细胞，取Transwell小室，以PBS洗涤3遍，甲醇固定30min，采用0.1％结晶紫染色30min，于倒置光学显微镜观察计数。随机选取5个视野，实验重复3次。

6、统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件，所有实验均重复3次，数据资料用均值±标准差表示，样本均数比较采用组间t检验。P<0.05为差异有显著性意义。

三、实验结果

1、药物干预对癌细胞中SIRT1基因表达的影响

结果如表1和图1所示，与空白对照组相比，香附薁酮组、香附子烯-2,5,8-三醇组食管鳞状细胞癌TE-1细胞中SIRT1基因表达显著降低，而广藿香烯酮组与空白对照组相比无显著差异。该结果表明，香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇可以有效抑制食管鳞状细胞癌TE-1细胞中SIRT1基因的表达，广藿香烯酮则不具有这种抑制作用。

表1各组癌细胞中SIRT1mRNA/GAPDH mRNA比值

2、药物干预对癌细胞迁移能力的影响

结果如表2和图2所示，与空白对照组相比，香附薁酮组、香附子烯-2,5,8-三醇组食管鳞状细胞癌TE-1细胞的迁移能力显著降低，而广藿香烯酮组与空白对照组相比无显著差异。该结果表明，香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇可以有效抑制食管鳞状细胞癌TE-1细胞的迁移，广藿香烯酮则不具有这种抑制作用。

表2各组癌细胞划痕愈合率

划痕愈合率(％)空白对照组83.96±5.23广藿香烯酮组81.49±4.85香附薁酮组56.75±4.47香附子烯-2,5,8-三醇组55.83±4.56

3、药物干预对癌细胞侵袭能力的影响

结果如表3和图3所示，与空白对照组相比，香附薁酮组、香附子烯-2,5,8-三醇组食管鳞状细胞癌TE-1细胞的侵袭能力显著降低，而广藿香烯酮组与空白对照组相比无显著差异。该结果表明，香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇可以有效抑制食管鳞状细胞癌TE-1细胞的侵袭，广藿香烯酮则不具有这种侵袭作用。

表3各组癌细胞细胞侵袭穿膜数

细胞侵袭穿膜数(个)空白对照组295.65±18.27广藿香烯酮组287.92±17.74香附薁酮组56.71±7.02香附子烯-2,5,8-三醇组53.85±6.72

上述实验结果表明，香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇为有效的SIRT1基因表达抑制剂，香附薁酮、香附子烯-2,5,8-三醇通过抑制食管鳞状细胞癌中SIRT1基因表达有效抑制食管鳞状细胞癌的迁移和侵袭，可以开发成治疗食管鳞状细胞癌转移的药物。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。