Κλωνοποίηση, έκφραση, καθαρισμός και ενζυμικές δοκιμές της 5-μεθυλ-τρανσφεράσης του tRNA του αρχαίου Pyrococcus Abyssi - ταυτοποίηση του γονιδίου για την κωδικοποίηση της 5-μεθυλ-τρανσφεράσης του tRNA στο βακτήριο Bacillus Subtilis

摘要

Η μετα-μεταγραφική τροποποίηση 5-μεθυλ-ουρακίλη (m5U) εντοπίζεται στη βρόγχο Τ (θέση 54) τωνπερισσότερων μορίων tRNA σε οργανισμούς των τριών Βασιλείων (Βακτήρια, Ευκαρύωτες και Αρχαία). Στογονιδίωμα του αρχαίου Pyrococcus abyssi εντοπίζεται ένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ΡΑΒ0719, Genebank)που κωδικοποιεί την m5U μεθυλ-τρανσφεράση των μορίων tRNA. Το συγκεκριμένο πλαίσιο ανάγνωσηςεντοπίστηκε λόγω της ομολογίας του με ανάλογα γονίδια στο βακτήριο Escherichia coli (trmA) και στονευκαρυώτη Saccharomyces cerevisiaea (trm2). Το γονίδιο κλωνοποιήθηκε με αλυσιδωτή αντίδρασηπολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας ζεύγος εκκινητών με υψηλή ομολογία προς το 5' και το 3' άκρο τηςαλληλουχίας-στόχου και συνδέοντας το γονίδιο με ένα φορέα έκφρασης, ο οποίος σε κύτταρα E.coti επιτρέπειτην έκφραση μιας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με μοριακό βάρος 49 kDa. Ο καθαρισμός της τελευταίαςεπιτυγχάνεται με χρωματογραφία συγγένειας. Η δραστικότητα του ενζύμου ως m5U μεθυλ- τρανσφεράσηελέγχεται in vitro. Ως συνένζυμο της συγκεκριμένης in vitro δοκιμής χρησιμοποιείται η S-αδένινο-ί. μεθειονίνη(S- adenosyl- L- methionine). Η τροποποίηση m5U δεν ανιχνεάεται στα μόρια tRNA του στελέχους BFS2838 τουβακτηρίου Bacillus subtilis. Το συγκεκριμένο στέλεχος φέρει μετάλλαξη στο γονίδιο gid. Η έλλειψη δραστικότηταςτου ενζύμου ανιχνεύεται με δοκιμή in vitro χρησιμοποιώντας ως πηγή του ενζύμου κυτταρικό εκχύλισμα από τομεταλλαγμένο στέλεχος BFS2838, ενώ ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιείται κυτταρικό εκχύλισμα από τοαγρίου τύπου στέλεχος W168 του B.subtilis. Ft σύσταση της αντίδρασης περιλαμβάνει μια σειρά από συνένζυμα:τετραφολικό οξύ (TFIF), ανηγμένη μορφή του φλάβινο- αδένινο- δινουκλεοτιδίου (FADH2) και ανηγμένη μορφήφωσφορικού νικοτινάμινο- αδένινο- δινουκλεοτιδίου (NADPH).