One step RT-PCR法による媒介蚊からのフラビウイルスRNAの検出条件の検討

摘要

デング熱，ウエストナイル熱など世界中で蚊媒介性感染症の流行，拡散がみられており，フラビウイルス属の国内侵入が強く懸念されている．そのために，フラビウイルス媒介蚊のサーベイランスを効率かつ有効に行えるシステム構築を念頭に，one step RT-PCR法による媒介蚊からのフラビウイルスRNAの検出条件および採集蚊の保有条件の検討を行った．検出条件では，ISOGEN-LSおよびカラムの使用，熱処理など検討したが，蚊乳剤の遠心上清からISOGEN-LS抽出することが最も高感度であった．この抽出法により各ウイルスの検出感度をウイルス量（Plaque forming unit：PFU）として評価したところ，蚊100個体のプールからフラビウイルス共通プライマーを用いた場合は100PFU，各ウイルス特異的プライマーでは10PFUであった．そして，人工的に作製したデングウイルス感染蚊1個体と未感染蚊99個体のプールからウイルスRNAの検出が可能であった．また，保存条件の検討では，冷凍?冷蔵でなくとも室温で30日間経過してもウイルスRNA検出は同レベルで可能であった．以上のことから，本研究による諸条件の設定のもと，実効性の高い，簡便安価でかつ短時間での判定が可能なone step RT-PCR法によるフラビウイルス媒介蚊のサーベイランスへの実用が可能となり，新たなサーベイランスシステム構築の大きな一助になるものと思われた．