摘要：研究背景系统性红斑狼疮(systemic lupus erytllematosus, SLE)作为一种严重危害健康的自身免疫性疾病,其病因、发病机制尚未完全阐明,治疗至今仍是世界难题。目前西医仍主要用糖皮质激素和免疫抑制剂治疗,长期应用会带来明显的毒副作用。临床实践证明中西医结合治疗SLE临床疗效突出,可减少药物的毒副作用,提高SLE患者的生存质量。阴虚内热是SLE的基本证型,滋阴清热法是治疗SLE基本法则。现代研究认为SLE的发生是由多基因共同作用的结果。研究SLE基因调控网络和蛋白质相互作用网络的动态变化将有助于我们对SLE发病的深入了解。目的观察滋阴清热方治疗阴虚内热证SLE的疗效,研究SLE患者治疗前、中(治疗6周)、后(治疗12周)外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)基因及蛋白表达谱的动态改变,了解阴虚内热证SLE患者基因及蛋白表达模式与正常人间的异同,从基因及蛋白水平探讨中医药治疗机理,为构建中医药治疗SLE的基因与蛋白表达谱研究方法与平台打下基础。方法1 研究对象女性阴虚内热证SLE病例来自2005年11月至2006年11月在广东省中医院门诊就诊的确诊病人。轻、中度活动(5≤SLEDAI≥25分),如使用了糖皮质激素,则维持量为10~25/日,三个月内不加量,如使用过非甾体抗炎药则需停药一周以上,如使用过其它免疫抑制剂则需停药半年以上。健康对照组来自于广州中医药大学健康大学生和健康志愿者,共15例,均为女性。治疗组总共纳入18例,其中退出2例,失访1例,有效病例共15例,平均年龄:31.60(9.37;健康对照组平均年龄:28.4(6.50。两组年龄经两样本t检验,方差齐性(P=0.098),差异无统计学意义(P=0.289)。2 治疗与疗效观察入选病例用滋阴清热方制成胶囊,每次5粒,每日3次口服治疗3个月,每两周进行中医症候积分评估,并在中药治疗前、治疗6周、治疗12周时评定活动度积分,检测患者血清补体C3、CA水平、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体(Ds-DNA)、血常规、尿常规等指标,提取PBMC总RNA和总蛋白质,-70℃保存备用,将完成3次观察的合格病例的样品进行基因芯片与蛋白芯片的检测。所有病例均按病例资料收集要求与规范详细填写《病例观察报告表》。3 基因芯片实验与分析方法合格病例PBMC总RNA样品用琼脂糖凝胶电泳初步判断样品总RNA保存质量。合格样品进行体外RNA扩增处理,保留3次均合格的样品组进行下一步实验。病例完成3个月疗程后标本送检,按完成顺序送检9例,选择3次样品均合格的5例患者进行基因表达谱芯片研究。每5个正常对照组样本混合做1张芯片,共2张。人类基因表达谱芯片由微芯生物公司采用cDNA直接点样生产,共有8064个基因点,采用Cy3单荧光标记探针,利用扫描仪(Generation Ⅲ array scanner, Amersham Pharmacia)进行扫描,然后将图像转化为基于荧光强度的数字信号(Imagequant 5.0 Array Vision 6.O)。以每张芯片上的阴性对照点杂交信号为参照,大于阴性对照点的平均信号强度加上3倍的阴性对照标准偏差的杂交信号作为有效杂交信号,再按可比性样品间的数据重复性进行数据筛选和分析。荧光信号采用管家基因(Housekeeping gene)校正和局部加权最小二乘法(LOWESS)方法对数据进行标准化校正,计算基因表达量在实验组和对照组间的比值(Rario),SPSS统计处理过程中对Ratio取常用对数得到R?,再进行分析,按Ratio大予2或小于0.5作为表达差异的显着性标准(取常用对数后,当│R?│≥O.3时基因表达差异有显着性)。运用国际通用的GeneCluster 2软件对标准化后数据进行SOMs (self-organizing maps;自组图)分析,对所有数据中具有类似的基因表达变化规律的数据进行筛选,并进行功能分类分析和聚类分析。对统计分析发现的有意义的基因到美国国立图书馆PubMed等数据库进行文献调研。4 蛋白芯片实验与分析方法采用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(SELDI)方法建立15例SLE患者治疗前、治疗6周、治疗12周共45个样本以及正常对照组15个样本PBMC蛋白质表达数据,利用浙江大学肿瘤研究所余捷凯等研究设计的ZUCIPDAS软件包找出蛋白质荷峰,用支持向量机方法建立判别模型,用留一法交叉验证来评估模型判别效果。对有意义的蛋白质荷峰,我们采用基因芯片表达数据库与Expasy蛋白数据库交连比对分析方法初步确定蛋白质荷峰的可能名称与功能。结果1 临床治疗评分与指标改变激素常规治疗配合滋阴清热方治疗阴虚内热证SLE可以较快缓解患者病情,改善自觉症状,SLEDAI积分、中医症候积分治疗后显着下降,C3、C4水平上升,患者病情有明显改善。中医症候积分与SLEDAI积分呈正相关,提示中医症候评分可以较客观地综合反映患者的病情。2 基因表达谱实验结果2.1 自组图分析结果8064个基因表达经归一化等数据处理后得到2946个基因表达数据。选择其中至少三次独立实验处理过程中存在明显的表达差异的数据共167个进行SOMs分析。设置5×5共25类,再用SPSS13.0软件对25个类别进行统计分析,采用重复测量方差分析和多元方差分析,Dunnett两两比较。对治疗前、中、后167个基因3次表达经重复测量数据的方差分析,差异有显着性意义(P=0.000),其中有20个基因表达前后差异有统计学意义(P<0.05),分析如下:5059治疗前低于正常人,治疗后接近正常人,对应的ACTR2基因编码肌动蛋白相关蛋白2(Arp2)。Arp2和Arp3复合物在真核生物中对控制肌动蛋白动态平衡起核心作用,具有使肌动蛋白聚合和使肌动蛋白纤维尖端加帽及交联肌动蛋白纤维成网状结构的能力。肌动蛋白是一类高度保守的蛋白质,存在于所有真核细胞中,参与细胞分裂、运动、迁移、形态的维持、生长等多种重要生理活动。肌动蛋白可能参与了大多数RNA聚合酶Ⅱ介导的基因转录活动、RNA的加工与运输。细胞核中的肌动蛋白,不仅作为一种结构蛋白参与核骨架和染色质骨架的组成,更重要的是作为一种功能蛋白,参与调整染色质结构和调控基因转录活动。王展、曾凡钦的研究认为SLE患者血中脱氧核糖核酸酶1基因(Deoxyribonuclease Ⅰ, DNase Ⅰ)活性与肌动蛋白浓度之间呈负相关,提示血中肌动蛋白浓度的增高可能是DNase Ⅰ活性降低的原因之一.冯学兵等的研究发现SLE患者DNASE1基因表达水平显着高于正常对照(P<0.001),未发现SLE疾病活动性指数积分与基因表达水平存在相关性,但性别分析显示女性患者DNASE1基因表达水平高于男性患者(P<0.01),提示DNASE1基因与SLE发病相关。提示Arp2合成低下可能与SLE的发病有关,通过提高Arp2合成以调节肌动蛋白功能,可能可以降低DNaseⅠ的活性,减少抗双链脱氧核糖核酸抗体(ds-DNA)的生成而达到改善病情的目的,它们间的关系有待进一步研究证实。3482对应的古蛋白1(ARCN1)基因参与细胞内蛋白运输,与热休克蛋白有类似作用,与高尔基内质网膜泡介导运输有关。治疗前接近正常,治疗6周上调,治疗12周又下调,提示ARCN1可能作为辅助因子参与SLE病理过程。4820对应于隐花色素2基因(cryptochrome 2, CRY2)参与DNA的修复。CRY2作为不依赖于光照的昼夜节律钟的一个部件,可能通过与激活剂和反馈抑制剂相作用而调节周期同族体1(PER1)转录子的周期循环,而PER1是生理循环的转录因子,作为一种负性调节组件,其启动子可作为多个信号分子的传感器,但不能与DNA直接结合,提示其可能通过间接方式发挥转录抑制效应。CRY2在植物中是蓝光受体(blue light receptor)或蓝光/紫外光A受体(BL/UVA receptor)。它是吸收蓝光(400~500nm)和近紫外光(320~400nm)而引起光变态反应的一类光敏受体。它在红斑狼疮中的作用有待进一步研究。760对应的补体促衰变因子(DAF,CD55分子),是一种免疫调节因子,属膜蛋白,是补体激活途径中的一个重要膜调节蛋白,可通过与C2竞争与C4b结合,从而抑制C3转化酶形成并促进其分解而调节经典途径或通过竞争性抑制B因子与C3b结合而干扰旁路途径C3转化酶的组装,从而阻断补体级联反应,从而保护自身细胞。在SLE弥漫增生性肾小球肾炎患者中血红细胞和肾小球细胞中高表达,提示对补体介导的损伤起积极的防护作用。本研究中治疗前明显低于正常人,治疗后明显高于正常人,治疗前后有显着性差异,提示中药等综合治疗可能通过上调DAF而对抗由补体介导的损伤,与文献研究一致。572对应的二氢嘧啶酶样2(DPYSL2),参与核苷酸和核酸代谢、信号转导、神经系统发育等,可能与其它候补基因相互作用引起精神分裂症。本研究中,治疗前基本接近正常人,治疗后高于正常人,前后差异有统计学意义。它在SLE发病中的作用有待进一步研究探讨。135号对应的脆性X智力低下基因(FMR1)参与mRNA加工、运输,有研究认为FMRP缺失可导致树突棘密度增高和感觉皮质功能柱区域树突棘修剪异常。治疗前显着低于正常人,治疗后明显上调而接近正常人,其在SLE发病中的作用有待进一步探讨。111号对应的激活酪氨酸激酶基因FYN是经典的src激酶家族成员,在细胞生长,分化和转化的调节中起重要作用。具有核苷酸结合、蛋白酪氨酸激酶、非膜跨越蛋白酪氨酸激酶、蛋白结合等活性,参与蛋白氨基酸磷酸化、钙离子运输、细胞内信号转导级联、蛋白激酶级联、T细胞受体信号转导途径等。本研究中治疗前低于正常人,治疗后高于正常人,提示FYN可能通过T细胞受体信号转导等途径参与自身免疫的调节过程。4265对应的是趋化因子配体3(GR03)基因。参与趋化、炎症应答、G蛋白偶联受体蛋白信号转导途径及应答刺激等。治疗前低于正常人,治疗后显着高于正常人,提示GRO3可能是治疗相关的效应蛋白,它在SLE发病进程中的作用有待进一步深入研究。893对应的极端同源物(LFNG)基因,编码一种信号传导膜蛋白,位于高尔基体,可减少JAGGED1与NOTCH2结合。JAGGED1是Notch信号通路中的一个配体,近来许多研究表明,它能诱导树突状细胞的成熟,并通过促使T淋巴细胞分化成调节性T细胞或Ⅱ型T辅助细胞,从而诱导免疫耐受。本研究中,SLE患者治疗前LFNG表达接近正常人,治疗后显着上调,提示可能通过上调LFNG的表达而抑制SLE患者T淋巴细胞成熟与分化,从而调节免疫应答。1823号对应的NS1-BP基因为流感病毒NS1A结合蛋白(ⅣNS1ABP)基因。NS1-BP与细胞核剪接体组成相关,参与mRNA前体的剪接过程,在SLE患者治疗前明显低于正常人,治疗后高于正常人,而提示治疗可能通过上调NS1-BP的表达,影响淋巴细胞内前mRNA剪接成熟,进而调控基因的表达。5181对应的P125基因,又名sec23ip,编码SEC23结合蛋白。囊胞分子复合体(Sec23/24-Sar1)是COPⅡ衣被小泡的重要组成成分,参与蛋白从内质网转运出来的重要生理过程。P125负责SEC23的结合与固定。在本研究中SLE患者治疗前显着低于正常人,治疗后高于正常人,治疗后比治疗前表达显着增多,提示P125可能参与了SLE的发病进程,治疗可能通过上调P125而增强SEC23蛋白与SEC24蛋白结合与固定形成囊胞分子复合体,改善蛋白的转运有关,有必要通过进一步研究证实P125在SLE中表达低下在SLE发病中的作用以及促进P125表达在治疗中的作用。3836对应的前8细胞克隆增强因子(PBEF)表达治疗前低于正常人,治疗后上调接近正常人。PBEF受IL-6和IL-6相关细胞因子OSM的调节,在关节炎期间表达增高,PBEF可能与关节炎的发病有关,PBEF与SLE的关系有待进一步研究。376对应的蛋白激酶C-β1(PRKCB1)基因,编码一种在糖尿病相关肾病起重要作用的信号分子,可以作为预测日本2型糖尿病患者肾病恶化的因子。我们的研究中发现,治疗前PRKCB1表达明显低于正常人,治疗后上调接近正常人,治疗前后差异有显着性,说明PRKCB1在SLE的发病中出起重要作用,是否与狼疮肾的发生与发展有关需进一步研究。也可能是药物治疗的一个靶基因。1253对应的PSCDBP基因是白介素-12诱导而表达的细胞色素C家族,它可激活树突状细胞并促进其与T细胞的粘附。PSCDBP治疗前接近正常,治疗后上调,前后差异有统计学意义。6481对应蛋白酪氨酸磷酸酶受体E(PTPRE)基因,参与蛋白氨基酸去磷酸化,对细胞信号传导、细胞生长与分化及免疫应答有重要作用。蛋白酪氨酸磷酸酶受体O (PTPRO)具有维持B细胞静止,抑制其生长及促进其分化的作用。在本研究中治疗前低于正常人,治疗后高于正常人,提示PTPRE可能参与SLE患者淋巴细胞病理过程,SLE的治疗是否通过上调PTPRE来抑制B细胞增殖并促进分化有待进一步研究证实。1111对应的固醇载体蛋白2(SCP2)基因,可能通过增强过氧物酶体多功能酶2(MFE2)与脂酰CoA的结合力,使得MFE2发挥最有效的催化活力,在哺乳类动物的脂类代谢中发挥其重要作用。本研究中,治疗前低于正常人,治疗后高于正常人,前后差异有统计学意义,中药等综合治疗对该基因的表达有上调作用。3964对应跨膜蛋白2(TMEM2)基因,治疗后表达显着高于治疗前,提示TMEM2参与到SLE的发病过程,具体作用有待进一步研究以证实。4235对应的是肿瘤坏死因子基因(TNF)。TNF在SLE发病中的作用目前研究不一致。TNF可通过与(肿坏死因子受体)TNFR结合而起广泛的生物学活性,如参与炎症反应和免疫应答,同时TNF与TNFR也是重要的死亡配体和死亡受体,两者结合后可诱导细胞凋亡。本研究中发现TNF治疗前低于正常人,治疗后显着高于正常人。可能TNF表达的增高,通过介导过度增生的异常B淋巴细胞的凋亡而起调节自身免疫的功能。TNF在SLE发病中的作用可能是多方位的,一方面它可以介导炎症的发生,引起组织损害,另一方面可通过加速病变细胞的凋亡。治疗可能通过调节两种不同作用起改善病情的作用。207对应的ZFP103基因为抗抑郁相关基因,是抗抑郁药的新靶点,编码的锌指蛋白在泛肽-蛋白酶体系统起重要作用。在SLE患者中ZFP103总体表达低于正常人(Ratio=0.724),治疗后ZFP103表达上调,由治疗前低于正常人上调到治疗后高于正常人,而蛋白表达谱研究中也发现4108-4109 Da蛋白质荷峰对应的最可能是锌指蛋白(Zinc finger protein),该蛋白治疗前(133.84±107.76)接近正常人(131.49±90.45),治疗后(307.33±211.55)高于正常人,前后差异有统计学意义(P=0.038)。同时还发现了其它一些锌指蛋白相关基因表达的异常。这与多数患者中医药干预前表现出的狂躁或精神压抑以及中医药治疗后患者自觉明显好转相一致,提示滋阴清热方可能可能通过提高抗抑郁相关基因的表达达到缓解精神神经症状,有待进一步研究证实。2.2 SLE治疗中、后与治疗前比较样品基因表达聚类分析对87个前、中、后三次样品具有相似性表达变化的基因数据进行了聚类分析,下调的有21个,上调的有66个。下调基因主要有免疫应答相关基因(DXS1357E、LY117、IGHG3、IGKC、IGL@、PTPRCAP)及炎症反应相关基因(LY117、ADORA3、MIF、EDG6、CTSH),以及一些细胞凋亡增殖、信号信道及代谢相关等基因(H2AFO、RPL28、FEZ1、EMP3、CAPN4、MIF、DXS1357E、APRT、COX6A1、PLEC1、RPS5、DGKA、NMBR、PTPRCAP)。上调的基因中主要有信号转导相关基因(SHOC2、SEL1L、JAK2、NGB、BIG2、DPYSL2、RGS19、PTGS2、BAI3),免疫炎症相关基因(ILF3、B4-2、PTPRC、KLRC1、CSF2RB、PBEF、GRO3、DAF、SDCBP、TNF、TRA1、SSFA2、HSPA9B、JAK2),转录调控修饰相关基因(B4-2、ZNF9、RYBP、TFEC、ZNF217、SSX<'2>、ATF3、HUMHOXY1、MAF、SMARCA5、LFNG、PTGS2、NS1-BP、EGR2、SF381、prpf4、GRSF1),细胞增殖、凋亡与分化相关基因(CLK1、BTG3、IF116、RYBP、TNF、CCNG2、ERCC5、IDN3、CLK1、CDC23),以及生物合成、膜蛋白等(TBCC、DLEU2、ZNF217、PLSCR1、TMEM2、SCP2、CD47、CGGBP1、TACC1、DNM1、EB12、PIGA、SLC7A6、KIAA1382、PTPRC、IPLA2、FOSB)。2.3 细胞凋亡相关的基因家族基因表达结果我们的研究发现阴虚内热证SLE患者治疗治疗前后均有凋亡相关基因的异常表达。治疗前促进细胞凋亡的许多基因明显上调,抑制细胞凋亡的基因则多数表达下调,而治疗3个月后则出现相反的情况,再次证实细胞凋亡在SLE的发病中起着非常重要的作用,糖皮质激素配合滋阴清热方治疗可以从凋亡的多个环节对细胞凋亡进行调控。2.3.1 治疗前后变化不大,前后均下调的8个凋亡相关基因,其中抗凋亡的基因有:AIM、BLC2、BY55、HSPD1;促进细胞凋亡的有:DR6、PA26;而HUS1与ITK在细胞凋亡中起着重要的调节作用。2.3.2 治疗后较治疗前上调的凋亡相关基因有21个,其中抗细胞凋亡的基因有:SGK、AD022、API5、BAG1、BAG3、BCL6、SGK、VCAM1、BCL2A1、BNIP2、GG2-1、HSPA1B、IL1B、TNFRSF6、IL2RB;促进细胞凋亡的基因有:CASP3、TNF、TNFSF10,另外NKTR编码淋巴细胞识别因子,它可以激活毒性淋巴细胞杀死靶细胞,HLA-DQA1与HLA-G与免疫应答及抗原提呈有关,CD83参与体液免疫应答和信号传导等,它们通过各种途径参与调节细胞凋亡。2.4 其它差异表达基因HLA基因家族:HLA-C、HLA-DQB1、HLA-G与HLA-DPB1在SLE中以上调为主,虽然治疗后表达有所下调,但总体仍高于正常人,而HLA-B、HLA-DQA1为下调,治疗后无明显改变,HLA-E治疗后下调,但与治疗前差异无统计学意义(t'=2.127,v=7.397,P=0.069)。HLA-DQB1基因可能是治疗相关基因,治疗后其对应表达的HLA-DQB1蛋白片段量减少。其它发现了雌激素及其受体基因、生物钟相关基因、抑郁症、睡眠障碍相关的基因,白介素基因家族成员等基因表达改变。3 蛋白表达谱实验结果3.1 阴虚内热证SLE患者与正常人蛋白表达的存在显着性差异SLE患者与正常人比较,找出152个蛋白峰,其中有统计学意义的差异表达蛋白峰73个(P<0.05),其中44个峰有非常显着性差异(P<0.01),建立中药治疗前SLE患者与正常人的蛋白质质谱检测模型(10542Dam/z和2554Dam/z),其判别率为100﹪,可以通过以上两个峰将SLE与正常人区别开来。治疗前SLE患者与正常人比较缺失的10542Da质荷峰,差异有非常显着性意义(P=0.0001),进一步比对治疗中及治疗后SLE与正常人比较所得蛋白峰,我们发现,SLE治疗1个半月时找到10543Da蛋白峰与正常人比较有显着性差异(P=0.002),而治疗3个月后找到10546Da差异蛋白峰(P=0.045),经基因与蛋白比对分析,我们认为10542、10543标志物最可能是HLA基因家族相关的多个蛋白片段的复合物,而10546标志蛋白最可能是HLA-DPB1protein片段,说明SLE患者淋巴细胞HLA基因家族表达产物明显低于正常人,治疗后表达产物可以接近正常人,但仍有HLA-DPB1基因表达低于正常人。HLA-DQB1基因可能是治疗相关基因,治疗后其对应表达的HLA-DQB1蛋白片段量减少。国内外相关研究也认为HLA基因家族与SLE的发病密切相关。而2554Da在蛋白数据库中找到一个相同分子量的假定蛋白,功能结构尚不清楚,在基因比对中未找到对应基因,可能是一个红斑狼疮患者发病有关的未知蛋白或多肽片段,提示2554Da可能与SLE的发病密切相关,有待进一步研究证实。3.2 阴虚内热证SLE患者治疗前、后蛋白表达有显着性差异阴虚内热证SLE患者前疗3个月后与治疗前进行比较,共发现蛋白峰167个,其中差异有统计学意义的有20个(P<0.05)。其中四个蛋白质峰(4787、2724、4804、4831)可以对SLE样品是治疗前还是治疗3个月后进行判别,预测治疗前与治疗3个月后的正确率分别为100﹪与90﹪,其中303号样品误判为治疗前的样品。对其中的几个蛋白进行分析发现:2312对应可能是HLA-G蛋白片段或者是IL-8,在SLE与正常人及硬皮病患者间表达无差异(P>0.1),但SLE病人治疗前中后表达不断增高,治疗45天与治疗前比较差异有统计学意义(P=0.054),治疗90天后与治疗前比较差异有非常显着性意义(p=0.007),这与SLE患者HLA家族基因表达谱中的HLA-G的变化基本一致,认为2312差异表达蛋白主要为HHC class Ⅰ antigen片段。结语1 本研究的特色与创新1.1 选用全国名中医广东省中医院皮肤科??国维教授多年临床经验方"滋阴清热方"进行研究,疗效确切。1.2 在课题组前期研究的基础上,动态观察滋阴清热方治疗阴虚内热证SLE白细胞基因与蛋白表达谱的动态变化,从整体水平了解基因与蛋白表达间的关系,较全面反映机体复杂基因与蛋白调控网络的变化特征。1.3 本研究技术路线设计新颖,目前文献未见研究治疗前、中、后基因与蛋白动态变化的报道。1.4 本研究选用的表达谱基因芯片技术先进。1.5 本研究引入当前国内外肿瘤研究领域热门的顶尖的SELDI蛋白芯片技术,更好地实现SLE白细胞蛋白表达谱动态、高通量研究。1.6 本研究取得了可喜的成果,发现了许多凋亡相关等基因的异常表达,观察到一些凋亡相关等基因治疗前后有显着改变。如IGKC基因治疗后较治疗前表达减少,提示治疗可以减少免疫球蛋白的K链合成,因而可以减少自身抗体的产生。补体促衰变因子(DAF)治疗后表达较治疗前明显升高,因而可抑制补体级联反应,对抗补体介导的损伤。治疗可以提高Arp2的合成而调节肌动蛋白的功能,从而降低DNase Ⅰ活性,进而减少ds-DNA的生成,从而改善病情。治疗对细胞凋亡及免疫相关基因的表达有调节作用。1.7 发现了SLE与正常人差异表达的蛋白质荷峰,观察到治疗相关蛋白质荷峰,为下一步深入研究提供更多的信息。1.8 本研究提示滋阴清热方可能在基因及蛋白表达水平上对SLE患者进行调节,从而改善患者的中医症候,达到治疗作用。2 存在的问题和研究展望2.1 本研究没有能设立纯中医治疗组,样本数较少,没能完全说明滋阴清热方的治疗机制。下一步在医学伦理许可的情况下,设立纯中医治疗组、西医药治疗组及中西医结合治疗组进行大样本的研究非常有必要,可能可以揭示中医治疗SLE的基因与蛋白水平的内在机制。2.2 基因与蛋白分析的方法仍不很成熟,实验数据海量,有待进一步结合国内外研究成果深入分析,并在此基础上设计新的研究方案,进一步完善研究。2.3 规范中医辨证论治体系,实行多中心临床与实验结合研究,设立相对独立的中西医结合疗效评价体系,是中医研究让人信服的关键点。有待同道们一起努力。中医药的研究可能可以在基因与蛋白水平上找到突破!3 结论通过本实验,我们得出以下结论:3.1 治疗前后中医症候积分差异显着,滋阴清热方可以改善SLE患者的阴虚内热的症状。3.2 阴虚内热证患者细胞凋亡相关基因、免疫相关基因等基因表达紊乱,治疗前、中、后基因表达模式有显着改变,提示滋阴清热方可能通过调节患者基因表达紊乱而达到阴平阳秘的治疗作用。值得进一步深入研究。对SLE及其它免疫相关疾病的进一步大样本基因聚类分析研究,可能可以建立SLE早期诊断、鉴别诊断及中医不同证候的基因表达模式。3.3 阴虚内热证患者白细胞蛋白表达模式与正常人有差异,可以通过蛋白表达模式区别正常人和SLE样本,提示可以用蛋白芯片的方法实现SLE的早期诊断,有待进一步研究。3.4 治疗前、中、后许多蛋白有差异表达,提示滋阴清热方可能通过调节患者蛋白表达而达到治疗作用。对发现的标志蛋白质荷峰进一步深入研究,有可能找到治疗相关靶蛋白,值得进一步深入研究。致谢衷心感谢博士导师范瑞强教授、硕士导师杨柳教授,感谢??国维教授、许德清教授和陈达灿副院长,感谢广州中医药大学给我深造的机会,感谢广东省中医院皮肤科全体医生与护士及中心实验室老师在学习、生活、实验等方方面面给予的帮助与支持,感谢余捷凯博士、潘恩德博士、程喜平博士、廖勇梅博士,感谢2004级全体博士给予的热情帮助!我要特别感谢我的爱人和家人,正是由于她们的奉献、支持和鼓励,才使我能安心学习,信心百倍地完成学业。还要感谢女儿赖祎的健康成长,给我的生活增添了许多责任与快乐。
