高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其单克隆抗体的制备方法

摘要

研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其特异性单克隆抗体(Mabs)的制备方法.本研究以HP-PRRSV为研究对象,参照已发表的PRRSV基因组序列,设计一对PCR引物,并在其上下游分别添加BamHI和SalI酶切位点,获得的PCR产物用BamHI和SalI酶切后与经同样处理的pET-28a原核表达载体质粒连接,转化DH5a感受态细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后,转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG于37℃诱导表达不同时间点后,取细菌菌体用SDS-PAGE分析.结果表明,Nsp2在大肠杆菌中得到表达.经包涵体的提取,用猪抗PRRSV血清抗体进行Western-bolt鉴定,结果表明,融合表达的pET28a-dNsp2蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别.取纯化的pET28a-Nsp2蛋白按每只100μg的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化,并作为免疫原采取常规皮下多点注射免疫6-8周龄BALB/c小鼠.取其脾细胞与SP2/0的骨髓瘤细胞融合,经间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选,采用有限稀释法进行克隆.经过3次克隆后获得了一株抗PRRSV-Nsp2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为A2F1.Western-blot和间接免疫荧光结果显示这株单克隆抗体株能与Nsp2蛋白和PRRSV JXA1株发生特异性反应,而不与PRRSV CH1A株发生反应,证明获得的McAb为针对PRRSV JXA1株的McAb.抗体亚类鉴定结果表明,重链为IgG1型,轻链为κ链.采用间接ELISA法测得单抗的细胞培养上清抗体效价为1:800,腹水效价分别为1:12800.这株单抗的获得为进一步研究pET28a-Nsp2基因的功能及建立准确快速PRRSV的诊断方法提供了强有力的手段.