人BRCA1真核表达载体的构建及鉴定

摘要

目的 构建人BRCA1基因真核表达载体,为BRCA1基因高表达乳腺癌细胞株的研究奠定基础.方法 从胎盘中提取总RNA,设计引物,RT-PCR方法克隆BRCA1基因,以羧基端插入 pcDNA3.1(+)真核表达载体中.通过DNA序列测定,菌液提取质粒,酶切鉴定插入基因片段的正确性.提取无内毒素质粒pcDNA3.1-BRCA1并转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,获得稳定高表达BRCA1细胞株.提取细胞总蛋白,Western blot方法鉴定BRCA1的表达.结果 从人胎盘组织中成功克隆出BRCA1基因N端933个碱基.测序及提取质粒酶切鉴定证实pcDNA3.1-BRCA1中含有插入方向、片段大小和DNA序列均正确BRCA1基因N端933个碱基序列.转染后细胞株中BRCA1表达水平明显高于转染前,P＜0.01.结论 成功构建了人BRCA1基因的真核表达载体.获得稳定高表达BRCA1的MDA-MB-231细胞株.