血红素合成酶特异性RNAi表达载体的构建及其干扰效果鉴定

摘要

目的 利用含红色荧光报告基因(DsRed)的pGCsi-U6/Neo/DsRed/质粒构建干扰人红系特异的γ-氨基-6-酮戊酸合成酶(eALAS)基因表达的短发夹RNA(shRNA)表达载体,并进行活性鉴定.方法 根据GenBank中eALAS的序列,设计3条表达shRNA的互补DNA序列,分别克隆至质粒载体pGCsi-U6/Neo/DsRed中构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株扩增后,提取质粒测序分析,以相同的方法构建并鉴定eALAS基因的真核表达载体pEGFP-N1-eALAS;将3种pGCsi-U6/Neo/DsRed/eALAS-shRNA分别与pEGFP-N1-eALAS共转染HEK293细胞株,通过流式细胞仪检测pEGFF-N1-eALAS融合蛋白的荧光强度,选择最佳RNA干扰(RNAi)靶点,并在基因和蛋白水平检测eALAS的表达,进一步验证最佳RNAi靶点的敲减效率.结果 经测序,模板序列与设计序列完全正确,最佳RNAi靶点敲减效率达72.45%,eALAS在基因和蛋白水平显著下降.结论 成功构建了eALAS特异性RNAi表达载体,为下一步研究铁效应元件eALAS在铁代谢异常所致红系统疾病的机制奠定了基础.