黑芝麻黑色素的分离纯化、结构表征及体外抗氧化活性

摘要

[目的]对黑芝麻黑色素进行分离纯化,并对分离得到的不同级分进行结构表征,评价各级分的体外抗氧化活性,为黑芝麻黑色素的精细结构解析及功能活性研究提供理论依据.[方法]以黑芝麻皮为原料,通过碱提酸沉法得到黑芝麻黑色素.黑芝麻黑色素经HW-40C尺寸排阻色谱柱分离纯化,测定所得不同级分的得率、色价和黑色素含量,并采用紫外可见光谱(UV-Vis)、元素分析(EA)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)、X-射线光电子能谱(XPS)、电子顺磁共振(EPR)、X-射线衍射(XRD)等手段表征黑色素不同级分的结构,通过DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))自由基清除率、铁离子还原能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)和氧自由基吸收能力(oxygen radical absorption capacity,ORAC)评价不同级分的体外抗氧化活性.[结果]黑芝麻黑色素经过分离纯化得到黑色的Fr1和棕褐色的Fr2两个级分,得率分别为60％和24％,两个级分的分子量分别为38800 Da和6000 Da,Fr1的黑色素含量为782.16 mg SME·g-1 DW,Fr2的黑色素含量为884.66 mg SME·g-1 DW.元素分析结果表明Fr1为真黑色素而Fr2可能是异黑色素;Fr1和Fr2的紫外可见吸收光谱及红外光谱显示,两个级分均含有苯环、-OH、-NH2及-COOH等官能团结构;1H-NMR结果表明Fr1中含有更多的脂肪氢且芳香环上的氢大多数被取代,Fr2的芳香氢含量较Fr1高;固体核磁13C-NMR结果表明Fr1结构中含有更多的脂肪碳和羰基,Fr2含有更多的芳香碳;XPS结果显示两个级分黑色素的官能团含量不同,C1s结果表明Fr1的C-C(H)和C=O官能团的比例高于Fr2,但C-OH/C-N和O-C=O的比例低于Fr2;N1s结果表明Fr1的C-NH官能团比例高于Fr2,但芳香N的比例低于Fr2,且Fr1不含C-NH3+;O1s结果表明Fr1的C-OH官能团比例高于Fr2,但C=O官能团的比例略低于Fr2,且Fr1中不含吸收的H2O.EPR结果显示两个级分均具有较强的顺磁共振特性,Fr1和Fr2的g值分别为2.0078和2.0085,ΔHpp分别为0.7430和0.6950 mT;X-射线衍射表明黑芝麻黑色素的两个级分均为非晶态化合物,Fr1存在平面堆叠结构.Fr1和Fr2的DPPH自由基清除的IC50值分别为83.00和54.00μg·mL-1,ABTS自由基清除的IC50值分别为53.00和30.00μg·mL-1.Fr1和Fr2的FRAP值分别为1.05和1.62 mmol FeE·g-1 DW,ORAC值分别为3141.80和4143.76μmol TE·g-1 DW.[结论]Fr1是黑芝麻黑色素的主要级分;Fr1主要是真黑色素,而Fr2可能是异黑色素.Fr1和Fr2结构中均含有羰基、羟基、氨基、芳环和氮杂环等官能团,Fr2结构芳香性较Fr1高;Fr2的DDPH和ABTS自由基清除能力、FRAP和ORAC抗氧化能力均高于Fr1.